Abstract
Vævsstilladser spiller en afgørende rolle i vævsregenerering processen. Den ideelle stillads skal opfylde flere krav såsom at have en ordentlig sammensætning, målrettet modul, og veldefinerede arkitektoniske træk. Biomaterialer der rekapitulere iboende arkitektur af in vivo væv er afgørende for at studere sygdomme samt at lette regeneration af tabte og misdannet blødt væv. Et hidtil ukendt biofabrication teknik blev udviklet som kombinerer stade billeddannelse, tredimensionale (3D) udskrivning, og selektiv enzymatisk aktivitet til at skabe en ny generation af biomaterialer til forskning og klinisk anvendelse. Det udviklede materiale, okseserumalbumin gummi, er reaktion injiceres i en form, der værner specifikke geometriske funktioner. Dette offer materiale muliggør tilstrækkelig overførsel af arkitektoniske træk til en naturlig stillads materiale. Prototypen består af en 3D-collagen stillads med 4 og 3 mm kanaler at ReprESENT en forgrenet arkitektur. Dette papir lægger vægt på brugen af denne biofabrication teknik til frembringelse af naturlige konstruktioner. Denne protokol udnytter en computerstøttet software (CAD) at fremstille en fast form, der vil være reaktion injiceret med BSA gummi efterfulgt af den enzymatiske fordøjelse af gummi, efterlader de arkitektoniske træk inden stilladset materiale.
Introduction
I vævet ingeniørområdet evnen til at fremstille vævsstilladser er afgørende. En egnet væv stillads har en 3D-struktur, er sammensat af biokompatible materialer, og efterligner in vivo vævsarkitekturen at lette celler og væv vækst og remodeling. Dette stillads skal tillade transport af næringsstoffer og fjernelse af affald 1-4. En af de væsentligste hindringer for produktionen af disse stilladser er evnen til at rekapitulere specifikke geometriske elementer i et biokompatibelt materiale. Adskillige biofabrication teknikker er blevet rapporteret til at styre de geometriske karakteristika ved disse scaffolds, er eksempler elektrospinding 5-8, opløsningsmiddel-støbning 9, stereolitografi 10, og 3D-trykning 11, blandt andre. Disse teknikker kommer til kort i at yde en forholdsvis nem overførsel af styrbare interne og eksterne arkitektoniske træk, er dyre, er begrænset af deres opløsning og trykbarhed (
I mange kommercielle fabrikation systemer, er oprettelsen af interne hulrum, kanaler og funktioner opnås ved anvendelse af sand eller andre egnede aftagelige eller offer materialer. Metallet eller plastdelen er dannet omkring sandformen, og når det er størknet, bliver sandet fjernes. På samme måde, den næste generation af biomaterialer brug for biosand tilsvarende. Derfor blev BSA gummi udviklet som en erstatning for biosand. BSA gummi er en nyligt formuleret materiale, der består af okseserumalbumin tværbundet med glutaraldehyd. Det endelige mål er at genskabe specifikke arkitektoniske træk i en biologisk nedbrydelig collagen stillads. Egenskaberne ved det hellige biorubber der opretholder dimensional nøjagtighed med formen af det oprindelige væv, er beskrevet.
in vivo væv elasticitet og andre egenskaber ved vævet af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestem Andel af faste stoffer i Collagen Batch
- Ekstrahere kollagen efter en tidligere publiceret procedure 13. Tø mindst 20 ml collagen. Bestem den oprindelige procentdel af kollagen faste stoffer i parti for at manipulere kollagen koncentration i de dannede hydrogeler.
- Skær tre stykker af aluminiumsfolie (ca. 6 x 6 cm) og form hver enkelt som en pande ved anvendelse af bunden af en 25 ml bægerglas. Noterer vægten af hver pande.
- Tilføje en lille mængde af kollagen til hver skål og registrere den samlede vægt af aluminium pan og collagen. Tilsæt 0,5 - 0,8 g collagen på hver aluminium pan.
Bemærk: Efter dette trin er der tre aluminiumfolie pander og hver enkelt skal have en lille mængde af kollagen. Sørg for at registrere vægten af hver (i alt 3) tomme aluminium pan og vægten af panden efter tilsætning af collagen. - Beregn vægten af collagen i hver skål under anvendelse af following formel:
Collagen vægt = Pan og kollagen vægt - Pan vægt - Placer de tre aluminiumpander der holder collagen i ovnen ved 100 ° C i 24 timer.
- Efter 24 timer, registrerer vægten af hvert aluminium pan og dehydreret kollagen.
- Beregn vægten af den dehydrerede collagen ved hjælp af følgende ligning:
Tørrede kollagen vægt = Pan og dehydreret kollagen vægt - Pan vægt - Beregn procentdelen af fast stof i de tre prøver til bestemmelse af kollagen faststofkoncentration ved hjælp af formlen nedenfor:
- Beregn den gennemsnitlige kollagen tørstofindhold i batchen ved anvendelse procentdelen af collagen faststoffer for hver af de tre prøver.
Bemærk: kollagen, der skal anvendes, er hvad der er tilbage af den hydratiserede collagen. Ingen af det dehydrerede kollagen vil blive anvendt. - Efter bestemmelse af procentdelen af collagen fast (initial kollagen koncentration) af partiet, fortsætte med at bruge den resterende hydreret kollagen. Brug en kalibreret pH-meter for at justere pH af kollagen parti til 3.
- Tilsætte små mængder (2-5 pi ad gangen) på 12 N saltsyre (HCI). Hold på is på alle tidspunkter. Tilføj ikke saltsyre direkte til collagen - tilføj syren til siden af røret. Efter tilsætning af syre, bruge spatel til at skubbe syre til kollagen og hurtigt omrør blandingen.
- Når den når en pH på 3, lad kollagen sidde O / N ved 4 ° C.
2. Forberedelse af BSA Rubber
- Forbered bovint serumalbumin (BSA) løsning efter den nedenfor procedure.
- Forbered 2x phosphatpufret saltopløsning (PBS). Tilsæt to PBS tabletter til 100 ml vand for at lave 0,02 M PBS-opløsning.
- Kombiner BSA med 2x PBS for at skabe en 30% BSA-opløsning ved anvendelse af fremgangsmåden angivet nedenfor.
- For eksempel for at lave en 30% BSA med 30 ml 2x PBS, bruge 12,9 g BSA. Tilføj 1/3 af 2x PBS (f.eks 10 ml) til en kolbe med en omrører. Tilføj 1/2 af BSA (f.eks, 6,45 g BSA) til kolben, og ved hjælp af en spatel, fugte tør opløste stof.
- Gentag denne proces med at tilføje PBS og derefter BSA indtil al det opløste stof og opløsningsmidlet er i kolben. Brug spatel til våd alle det opløste stof. Det vil ligne en blanding af noget væske og klumper. Lad det sidde i ca. 30 min.
- Tænd derefter omrøreren på en lav cyklus, og sørg for, at der ikke er nogen klumper omkring omrører. Det bør tage 90 minutter at komme alt i opløsning eller det kan stå omrøring O / N ved 4 ° C. Efter det opløste stof er alle opløst, placere opløsning i en 20 ml sprøjte og lukket med en 0,20 um sprøjtefilter. Tryk på stemplet for at uddrive væske gennem filteret og indsamle den steriliserede løsning i et nyt rør. Opbevares ved 4 ° C.
- Forbered 3% glutaraldehyd solutipå ved fortynding 25% glutaraldehydopløsning med sterilfiltreret 2x PBS. For eksempel til 10 ml 3% glutaraldehydopløsning, bruge 2 ml 25% glutaraldehyd og 8 ml 2x PBS. Opbevares ved 4 ° C.
3. Forme Behandling
Bemærk: der er beskrevet i dette papir prototype bruger en skræddersyet rustfri stål Y skimmel stykke. Formen indeholder en indstrømning og to udstrømningskanaler fra 4 til 3 mm. Først, rene forme, sprøjte dem med umættet fedt, og sterilisere dem. Forbered formene efter den nedenfor beskrevne procedure.
- Rene forme af rustfrit stål ved hjælp sonikator med en frekvens på 35 kHz. Placer formene i ultralydsapparat og dykke dem med vand og is. Hold formene koldt på alle tidspunkter, når sonikator kører. Kør sonikator i 2 perioder på 90 min.
- Efter hver periode, så brug en nål til at sikre, at der ikke er materiale i Luer lock rustfrit stål eller bRASS stik. Brug sæbe og vand til at rengøre hele overfladen af de to sider af formene. Kontroller, at der ikke er nogen forhindring i kanalerne.
- Placer forme, skruer, og Luer lock connector i en autoklave pose og autoklaveres det.
- Fyld flasken, der tillægger en luft sprøjte halvvejs med kommercielt tilgængelig svinefedt (blandet fedtsyre slipmiddel). Sæt hætten med en almindelig kasket flaske. Placer den i en autoklave taske og autoklaveres det.
Bemærk: Lard anvendes til at lette frigivelsen af det materiale, som vil være reaktionen injiceret senere (BSA gummi). Placer ikke sprøjten flaske låg i autoclave- det kan beskadige den interne forsegling. - Varme op svinefedt i 45 sekunder eller indtil dets klare og væske i en mikrobølgeovn. Skrue luft sprøjten låget til svinefedt flasken. Tilslut låg med sprøjten. Fastgør sprøjten til luften kilde på laboratoriet bænken. Åbn luftventilen, og åbne dysen af sprøjten, indtil den begynder at befugte overfladenaf et stykke køkkenrulle.
- Spray svinefedt vinkelret på formoverfladen, indtil overfladen er helt dækket. Efter hvert stykke er blevet sprøjtet, placere dem i en petriskål og forsegle den. Placer formene ved 4 ° C i 2 timer.
- Fortsæt til sterilisere formene ved at udsætte overfladen for UV-lys i 30 minutter. Placere dem tilbage ved 4 ° C, indtil de er klar til at blive reaktion injiceres.
4. Reaction Injection af BSA Rubber
Bemærk: Alle materialer og opløsning skal holde kold indtil den er klar til at bruge til at forhindre for tidlig indstilling af BSA gummi i de næste trin.
- Forbered dispenser til at levere BSA gummi til formene efter disse trin.
- Sterilisere alle de blandingskomponenter (to O ringe, sprøjte cap, dobbelt sprøjte, bland spids, og 4: 1 dispenser) ved at udsætte dem for UV-lys i 30 minutter i polymerasekædereaktionen (PCR) hætte.
Bemærk: En PCR-hætte blev brugt, fordi thans procedure indebærer fikseringsmidler. Disse kemikalier kan ikke bruges i cellen / vævskultur hætte på grund af risikoen for eksponering og toksicitet til cellerne. Enhver anden hætte, der indeholder et UV-lys, vil være egnet. - Placér spidsen hætten på indehaveren løsningen.
- Udfør blanding og injektion i en 4: 1-forhold mellem BSA: glutaraldehyd. Tilsæt 30% BSA til den dobbelte sprøjte kammer, der vil levere den højeste mængde opløsning (Det vil tage ca. 4 ml for at udfylde). Sørg for at efterlade nok plads til at placere O-ringen for at forhindre overfyldte og forurening af det tilstødende kammer.
- Tilsæt 3% glutaraldehydopløsning til det andet kammer (det vil tage ca. 1 ml til at udfylde). Sørg for at efterlade nok plads til at placere O-ringen for at forhindre overfyldte og forurening af det tilstødende kammer.
- Det dobbelte sprøjte på dispenseren. Vip aggregatet lodret, så at sprøjten hætten er øverst. Sæt hætten med blandespids.
- scRew de to rustfri stål skimmel stykker sammen.
- Placer samlingen indersiden af en autoklave pose.
- At fjerne eventuel luft i dispenseren, holde den i oprejst position og hurtigt klemme håndtaget én gang for at frigive en lille mængde af BSA blandet med glutaraldehyd. Så hurtigt fastgøre rustfri stål Y skimmel s Luer lock stikket til sprøjten.
- Hold rustfrit stål Y form med venstre og BSA-Glutaraldehyd blanding dispenser til højre. Alternativ dækker hver af venstre og højre udstødning af de udadgående kanaler ved at trykke udstødningen til siderne af autoklaven pose for at sikre de indvendige hulrum er fyldt med opløsning. Derefter placere formene vandret og injicere igen.
- Tag formene fra dispenser og sted i en 25 mm petriskål.
- Placer Parafilm omkring petriskålen at undgå dehydrering af gummi.
- Placer formen i 4 ° C køleskab O / N.
- Sterilisere alle de blandingskomponenter (to O ringe, sprøjte cap, dobbelt sprøjte, bland spids, og 4: 1 dispenser) ved at udsætte dem for UV-lys i 30 minutter i polymerasekædereaktionen (PCR) hætte.
Bemærk: kollagen bør holdes på is under hele processen.
- Ændre kollagen koncentrationen hvordan den procentdel af kollagen faste stoffer.
- Gør 10 ml 1,75% collagen ved at justere den initiale kollagenkoncentration med koldt vand.
- Ved hjælp af en kalibreret pH-meter, justere pH til 3 ved anvendelse af 12 N saltsyre. Tilføj ikke saltsyre direkte til collagen- tilføje syren til siden af røret. Efter tilsætning af syre, bruge spatel til at skubbe syre i kollagen og hurtigt omrør blandingen.
- Afvejes 4 g collagen i et separat konisk rør.
- Centrifugeres kollagen at fjerne luft ved 4 ° C og 9343 x g i 20-30 min.
- UV sterilisere cellekultur hætte i 30 minutter, og der tilsættes 14 pi laminin til 4 ml collagen. Dette vil resultere i en endelig laminin koncentration på 10 pg / pl. Bemærk: Laminin giver structural integritet, adhæsion, og fremmer forskellige cellulære reaktioner.
- Drej PCR UV lys på i 20-30 minutter, før du bruger emhætten til sterilisering.
- Placer Luer lock cap, til at knytte til en 20 ml sprøjte, i ethanol i en 2 timer. Derefter lade det tørre og læg den i UV-lys.
- Gamma bestråle kollagen til 8,6 minutter at nå 1.200 cGy.
Bemærk: Den tid vil afhænge af henfald af cæsium kilde. Juster tid til at nå den samme dosis.
6.Casting Collagen på BSA Gummi
- At polymerisere kollagen, bruge en 8: 1: 1 forhold (kollagen: HEPES: MEM). Følgende procedure er baseret på en første 4 g syrnet kollagen (fra trin 5.1.8).
- Foretag en 0,2 N HEPES-opløsning i vand, og pH indstilles til 9 ved tilsætning af små mængder (1-5 pi) af 1-5 M natriumhydroxid (NaOH) -opløsning. Ved hjælp af en kalibreret pH-meter, overvåge pH af opløsningen efter hver tilsætning. Opbevares ved 4 ° C eller keep på is.
- Tænd UV-lyset af vævskultur hætte for 20-30 min at sterilisere hætten.
- Autoclave pincet, spatel, og skalpel til sterilisering.
- Bland 1,5 ml 0,2 N HEPES (pH 9) og 1,5 ml 10x MEM hjælp af vævskultur hætte. Sørg for at holde den på is og vortex det i 5 sekunder før anvendelse. Opbevar ved 4 ° C eller holde på is.
- At sterilisere PCR hætte, tænde UV-lys i 30 min.
- Placer en plade 12 og en 20 ml sprøjte i -20 ° C i 10 minutter, eller indtil den er klar til at fortsætte. Bemærk: Hold alle materialer koldt indtil den er klar til brug. Stigningen i temperaturen inducerer tidlig kollagen fibrillogenese.
- Spray alle rør og brønde, der vil være i hætte med 70% ethanol og lad dem tørre i sterilisation. Anbring en 20 ml sprøjte på is til afkøling til senere brug.
- I PCR hætte, åbne rustfrit stål forme til at frigive BSA gummi og ved hjælp af en skalpel, skæres aftrækskanaler af BSA rubber mug.
- Under PCR hætte, åbne sterile kollagen rør og tilsæt 1 ml af HEPES-MEM opløsning (sørg for, at før udvinding af HEPES-MEM løsning, at det er godt blandet og der er ingen faste indskud).
- Brug af den sterile spatel, blandes grundigt kollagen og bufferopløsning.
- Luk og vortex det hurtigt at sikre en velblandet hydrogel.
- Overførsel til en kold 20 ml sprøjte.
- Med den ene hånd holdes BSA Gummi indersiden af brønden og ved hjælp af den anden, dispensere halvdelen af collagen hydrogel løsning på bunden af brønden.
- Brug af sterile pincetter, sikre, at gummi tilgang og afgang ender rører siderne af brønden.
- Hæld collagen opløsning oven på gummi, indtil der er helt dækket.
- Sikre, at BSA gummi er ophængt inden kollagen og at der ikke er bobler, især nær enderne af gummi.
- Placer dækslet og wrap Parafilm omkringomkreds af brønden.
- Sat i inkubatoren i 1 time ved 37 ° C. Hold PCR UV lys på.
- Efter polymeriseringen af kollagen, UV tværbinde hydrogelen via følgende procedure.
Bemærk: tværbinding af kollagen vil ske ved anvendelse af en UV tværbindingsmiddel apparat, hvor mængden af energi kan styres.- Tænd for UV tværbinderen og bruge indstillingen energi til at bestråle den tomme kammer med 630.000 μJ / cm2.
- Fjern gelerne fra inkubatoren.
- Spray hænder med ethanol, og inde i kammeret, fjerne låget så hurtigt som muligt.
- Kammeret lukkes og UV tværbinde de hydrogeler ved at vælge indstillingen energi og bestråling 630.000 μJ / cm2.
- Efter tværbindende cyklus, slukke UV lys på PCR hætte
- Spray hænder med ethanol og åbne kammeret, hurtigt placere låget tilbage på godt plade. Flyt brønds pladetil PCR-hætte.
- Brug af den sterile spatel, forsigtigt løsne og fjerne gelen fra brønden. Flip gelerne under hætten for at tværbinde bunden af hydrogelen. Gentag trin 6.2.3 og 6.2.4.
7. Enzym Fordøjelse af BSA Rubber
- For at have en hul collagen stillads, fjerne BSA Rubber på en måde, der ikke påvirker dimensionerne indlejret i hydrogelen. Fremgangsmåden er beskrevet nedenfor.
- Tænd UV-lys i 20-30 min til at sterilisere vævskultur hætte.
- Gør 0,25% trypsin-opløsning pH 7,8. For eksempel til 15 ml vand, tilsæt 0,0376 g trypsin i et 50 ml konisk rør. PH justeres til 7,8 ved tilsætning af små mængder (2-5 pi) af 1 M NaCl. Placer opløsning i en 20 ml sprøjte og lukket med en 0,20 um sprøjtefilter. Tryk på stemplet for at uddrive væske gennem filteret og indsamle den sterile opløsning i et nyt rør.
- Tænd for vandbadet og sæt temperaturen til 30° C.
- Efter 30 min, slukke UV-lys. Spray ethanol på alle rørene og materialer, der vil blive anvendt i hætten.
- Overfør kollagen hydrogel under kølerhjelmen og sted i separat konisk rør.
- Tilføj omkring 3-5 ml (lige nok til at dække geler) af 0,25% trypsin-opløsning med en pH på 7,8 til hvert rør.
- Forsegl rør med Parafilm og vortex let i ca. 1 min.
- Sted i 30 ° C vandbad i 15-24 timer. Mens i vandbadet, let vortex gelerne ofte indtil BSA gummi er blevet fordøjet eller fjernet fra hydrogelen.
Bemærk: For at bestemme, om BSA gummi er fjernet, enten gummi flyder i trypsin opløsning eller der er havarerede stykker. Der må ikke være synlige mørke områder i hydrogel.
- For at sikre, at alle BSA gummi og trypsin er blevet fjernet fra hydrogelerne, skylles det som beskrevet nedenfor.
- Tænd for PCR hood UV-lys i 20-30 min.
- Forbered Mosconas løsning. Kombiner kaliumchlorid (KCl, 28,6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glucose (9,4 mM) og (NaH 2 PO4, 0,08 mM) i vand. Indstil pH til 7,4 med 1 M NaOH eller 12 M HCI-opløsning. Placer opløsning i en 20 ml sprøjte og bruge en sprøjte filter på 0,20 um til sterilisere opløsningen.
- Spray alt med ethanol før placere dem på hætten og lade ethanol tørre.
- Åben tuben og overføre 5-10 ml steril Mosconas opløsningen til en ny 50 ml konisk rør.
- Overfør collagen hydrogel til den konisk rør, der indeholder enzymopløsningen. Sørg for, at hydrogel er helt dækket med løsningen. Efterlad røret i rysteapparatet i køleskabet ved 4 ° C i 30 minutter.
- Aspirer Mosconas løsning, og gentag trin 7.2.5 to gange.
- Opbevares ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne viser, at dette biofabrication teknik er effektiv i at generere 3D stilladser, der kan efterligne den rumlige arrangement ses i in vivo-væv. De arkitektoniske træk er vigtige parametre for tissue engineering ansøgning, som spiller en afgørende rolle i in vivo celle interaktion og funktionalitet af væv.
Konsistensen og blandbarhed af BSA gummi var en vigtig parameter i at producere en BSA gummi, der er homogent og er i stand til at opretholde sin tilsigtede form. Opløseligheden af proteiner bestemmes ved intermolekylære virkninger, såsom protein-protein-interaktion, og interaktionen med opløsningsmidlet, der inducerer ændringer på den samlede protein adfærd. Ledningsevnen af BSA-opløsningen blev målt, hvilket er en indikation af saltkoncentration på løsningerne. Tabel 1 viser den combinations af BSA, opløsningsmiddel og glutaraldehyd testet. Som forventet prøverne, der havde den højeste ledningsevne (2x PBS opløsningsmiddel) lettet opløseligheden af BSA.
En anden parameter, der anvendes til at bestemme den passende betingelse for udviklingen af denne opofrende materiale var reaktionshastigheden. Reaktionstiden for BSA faldt som koncentrationen af glutaraldehyd steg, som forventet. Fiksativet reagerer med a-aminogrupper på aminosyrerne, den N terminale aminogruppe af peptider og sulfhydrylgruppen i cystein. Den glutaraldehyd reagerer overvejende med BSA gennem aminogrupperne i lysin til dannelse af de intermolekylære kovalente bindinger (figur 1A) 14. Efter en inkubationsperiode, viste prøverne en farveændring fra lysegul til mørk gul og brun, stigende i intensitet med øget glutaraldehyd fusion (figur 1B). De 20%, 30%, end 40% BSA med 2% glutaraldehyd i vand ikke danner en gummi. 40% BSA-opløsning, på grund af sin høje viskositet og den meget reaktive fiksativ, resulterede i varierende styrke langs gummi. Denne adfærd kan skyldes vanskeligheden af glutaraldehyd i at trænge protein kæder homogent. Opløsningsmidlet stor indflydelse på proteinets opløselighed samt dets reaktion med fiksativ. De 2x PBS løsninger var let blandes. BSA-opløsningen med vand var vanskeligt at blande. BSA opløselighed er stærkt påvirket af ledningsevnen af opløsningsmidlet (tabel 2), hvilket bevirker konformationelle ændringer i proteinet. De mest lovende prøver var den 30% BSA med 3% glutaraldehyd i 1 x PBS og 2x PBS.
For at sikre, at gummiet var i stand til vedvarende belastningskræfter blev en kompression test. De mekaniske egenskaber af fire prøver af BSA gummi blev målt: 30% BSA 3% glutaraldehyd i2x PBS, 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1 x PBS, 20% BSA 3% glutaraldehyd i 2 x PBS og 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS. De sinus bølger viste en meget lille ændring fase mellem belastningen og forskydning kurver (Supplement figur 2), der overføres til stress og stamme kurver (Supplement Figur 3). Baseret på stress og belastning kurver, viste de første tre prøver hysterese i mellem på- og aflæsning (figur 2A-2C). Disse tre prøver opførte sig som et viskoelastisk materiale, der indeholder elastiske og viskøse egenskaber, når kræfterne blev anvendt. De 20% BSA 2% glutaraldehyd viste tegn på permanent deformation (figur 2D). De 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1x PBS og 2x PBS viste en lignende adfærd (Figur 2E one lastning og losning cyklus). Elasticitetsmodulet blev bestemt ud fra den lineære del af disse fire prøver (figur 2F). Koncentrationen af phosphatopløsningsmiddel signifikant øget elasticitetsmodulet ved den testede interval (p = 0,03). De 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS deformeres let, der viser en lavere elasticitetsmodul.
For at evaluere den enzymatiske fordøjelse af gummi, blev reaktionshastigheden beregnes på basis af forsvinden af BSA gummi, når de anbringes i kontakt med enzymet ved specifikt tidspunkt. Den enzymatiske fordøjelse proces blev behandlet som en batch-reaktor. En sammenligning mellem udgangs-gummi koncentrationen før behandling og gummiet venstre efter at være lyofiliseret blev gjort for at opnå kinetik fordøjelsen. Figur 3 viser reaktionshastigheden for hver prøve i forhold til koncentrationen af glutaraldehyd og BSA, opløsningsmiddel og opholdstiden. Der blev observeret en klar tendens mellem tværbindingsmidlet koncentrationer og reaktionshastigheden af dissociation af virksomheden. Statistisk analyse blev udført ved hvert tidspunkt. For the 15-timers tidspunkt, den glutaraldehydkoncentrationen påvirkede signifikant reaktionshastigheden resulterer i ap på 0,02 (Supplement tabel 4). Efter dette tidspunkt, både glutaraldehyd og BSA koncentrationen påvirkede signifikant sats (Supplement Tabel 5-7). Den mest indflydelsesrige faktor samlet var glutaraldehyd koncentration, angivet med en mere markant p-værdi. Stigningen i glutaraldehydkoncentrationen faldt reaktionshastigheden for fordøjelsen af gummi enhed.
Mængden af protein opløst med trypsin blev bestemt ved anvendelse af et BCA-assay (figur 4). Der blev set en fælles tendens: jo lavere koncentrationen af fiksativ blev mere protein fordøjet fra BSA gummi. Trypsin interageret med gummi prøven ved at spalte BSA og de nyoprettede kovalente bindinger dannet af glutaraldehyd, således at opløse den overordnede struktur i løbettid. Det forekommer, at med 1x PBS der er mere opløseliggjort protein på et tidligere tidspunkt i forhold til 2x PBS. Over tid, er der en forøgelse af proteiner i opløsning ved 15 timer, som fortsatte med at stige indtil 48 timer og faldt så. Dette kan skyldes, at den trypsin konstant spaltning proteinerne og således skabe mindre peptider og aminosyrer. Det kan også tilskrives af testens begrænsninger, som kun kan læse peptider, som er sammensat af tre eller flere aminosyrer. Statistisk analyse viste, at BSA og glutaraldehydkoncentrationen væsentligt påvirket frigivelsen af proteinet fra BSA gummi (p <0,05). En stigning i BSA-koncentration forårsagede en stigning af protein i supernatanten, mens en stigning i glutaraldehyd forårsagede et fald i opløst protein.
For at måle dissociation af denne opofrende materiale blev gummi vejet (våd basis), før du placerer det i contact med trypsin. Hvad der svarer til tørvægt af gummi anbragt i enzymfordøjelse opløsning blev bestemt under anvendelse af de der er vist i tillæg Figur 1. værdier Enzymopløsningen reagerede med BSA gummi, og således, solubiliseret proteinet. Gummiet er tilbage efter behandlingen blev lyofiliseret O / N og vejet. Figur 5 viser, at opløsningsmidlet påvirket dissociation af gummi. På samme koncentration af BSA og glutaraldehyd, 2x PBS opløsningsmidler gummi de beholdt mere af deres materiale i forhold til 1x PBS.
Tre faste støbeformdele blev fremstillet: Loop Mold (Supplement Figur 4A), Stability Piece (Supplement figur 4B), og Y Mold (figur 6A, venstre). Det rustfri stål Y skimmel stykke blev oprettet ved hjælp af Microlution maskinen (figur 6A, højre). Denne Formen blev reaktion injiceret med 30% BSA og 3% glutaraldehyde i 2x PBS (figur 6B, venstre). Gummiet fik lov at reagere O / N ved 4 ° C. Gummiet blev støbt med collagen (figur 6B, i midten) og derefter enzym spaltet (figur 6B, højre). Foreløbige data antydede, at ved pH 7,8 og en temperatur på 30 ° C i 15 timer, kan BSA gummi fordøjes med minimal indvirkning på kollagen stilladset. Efter 15 timer er gummiet svækket af enzymet og løs nok, at det efterlader kanalerne uden at påvirke de geometriske forhold ved kollagen. En 3D collagen stillads blev skabt, der har specifikke geometriske funktioner. Figur 6B (til højre) viser en diameter kanal 4 mm inde i en collagen hydrogel efter enzym fordøjelse af BSA gummi. Kanalen blev målt med en passer for at sikre, at den oprindelige dimension blev opretholdt. Det nye kanal i collagen hydrogel var 4 mm. BSA-gummi forme kan holde dimensioner så små som 300 um, der blev testet osing stabiliteten formen (figur 7). Disse skeletter blev testet for resterende glutaraldehyd og vi fandt ingen rester efter Mosconas vaske.
Figur 1. BSA gummi. (A) BSA gummi reaktion. Den glutaraldehyd tværbinder BSA ved at skabe covalente bindinger. (B) BSA Gummi. Forskellige koncentrationer af BSA, koncentrationer af glutaraldehyd og typen af opløsningsmiddel blev støbt på 24-brønds plader og reagerede O / N ved 4 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Stress-strain kurver af BSA gummier. Stress-strain kurver af BSA ru bbers. (A) 30% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS; (B) 30% BSA 3% glutaraldehyd i 1 x PBS; (C) 20% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS; og (D) 20% BSA 2% glutaraldehyd i 1 x PBS (3 cykler). Kurverne AC viser gummier, der har nogle DIFF, men vende tilbage til deres oprindelige form. Prøve D viser en gummi med en meget lav elasticitetsmodul, der let deformeres permanent under lastning og losning processer. Prøve A og B udviste en meget lignende opførsel som set under en lastning og losning cyklus på grafen E (repræsentant for en cyklus af hver prøve). Elasticiteten blev påvirket af koncentrationen af fiksativ og det anvendte opløsningsmiddel (F). Prøverne viste en signifikant stigning i modul med en stigning af salte (** p <0,05). En højere fiksativ koncentration forårsagede en signifikant stigning i elasticiteten af BSA-gummier (* p <0,05).Arget = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. reaktionshastigheden for opløsningen af BSA gummi. Som fikseringsmiddelpartiklerne stiger, falder reaktionshastigheden for alle prøver i 1x PBS (A), 2x PBS (B), og vand (C). De 40% BSA 2% glutaraldehyd i 2x PBS viser en af de højeste rater for reaktion. Dette skyldes de vanskeligheder i at gøre BSA-proteinet homogen. (blå: 20% BSA, lilla: 30% BSA, og rød: 40% BSA). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Protein kvantifi kation efter enzymfordøjelse. Som fikseringsmiddelpartiklerne stiger, proteinet opløst fra gummier aftager for alle prøver i 1x PBS (A), 2x PBS (B), og vand (C). (blå: 20% BSA, lilla: 30% BSA, og rød: 40% BSA). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Gummi fordøjelse. Vi bestemmes mængden af gummi fordøjet ved at sammenligne start- og slut tør basis produkter. Vi opnåede den mindste mængde af fordøjelsen på glutaraldehyd prøve 6% og mest ved 30% BSA 2% glutaraldehyd i 1x PBS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. forgrenede prototype. (A) Repræsentation af gren kar. Vist til venstre er den faste skabt i Mastercam der blev omdannet til G Code og fremstillet ved hjælp af Microlution 363-S, som ses til højre. Det rustfrie stål støbeformdel betegner en 4 mm indstrømning kanal med to 3mm udstrømningskanaler. (B) 3D collagen stillads. Vist til venstre er BSA gummi fremstillet ved anvendelse formen vist ovenfor. Centret viser gummi indlejret i kollagen hydrogel. Vist til højre er de kanaler tilbage i collagen stillads efter gummi blev enzymet fordøjes. Klik her for at se en større version af dette tal.
ftp_upload / 53.578 / 53578fig7.jpg "/>
Figur 7. BSA kanal. En 300 um BSA kanal blev fjernet fra stabilitet stykke skimmel. Der er et tyndt lag af slipmiddel omkring kanalen. Det ekstra område adskiller sig klart under et mikroskop, og kan nemt fjernes. Klik her for at se en større version af dette tal.
| BSA (%) | Glutaldehyde (%) |
| 20 | 2 |
| 20 | 3 |
| 20 | 6 |
| 30 | 2 |
| 30 | 3 |
| 30 | 6 |
| 40 | 2 |
| 40 | 3 |
| 6 |
. Tabel 1. BSA gummi parametre BSA og fiksativ blev blandet ved et 4: 1 forhold under anvendelse af tre forskellige opløsningsmidler.
| Prøve | Ledningsevne (mS / cm) | pH | |
| BSA (%) | opløsningsmiddel | ||
| 30 | 2x PBS | 11,43 | 7,06 |
| 30 | 1x PBS | 6,35 | 7,05 |
| 30 | DI | 2,39 | 6,76 |
| 20 | 2x PBS | 13.00 | 6,92 |
| 20 | 1x PBS | 8.67 | 7,09 |
| 20 | DI | 2,08 | |
Tabel 2. ledningsevne og pH BSA prøver. De ledningsevner og pH af BSA-opløsninger blev målt i nærvær af forskellige opløsningsmidler. En stigning i ledningsevne er vist mellem 2x og 1x PBS.
| BSA (%) | Glutaraldehyd (%) | opløsningsmiddel | Observationer | |||
| 20 | 2 | 1x PBS | Blød, let deformerbart materiale | |||
| 20 | 3 | 1x PBS | Blød men mere robuste end 2% glutaraldehyd | |||
| 20 | 6 | 1x PBS | Stiv, lidt skør | |||
| 30 | 2 | 1x PBS | god konsistens | |||
| 30 | 3 | 1x PBS | god konsistens | |||
| 30 | 6 | 1x PBS | Skør | |||
| 40 | 2 | 1x PBS | Meget inkonsekvent i at skabe en gel / gummi konsistens | |||
| 40 | 3 | 1x PBS | Konsistensen varierer langs prøven | |||
| 40 | 6 | 1x PBS | Skør | |||
| 20 | 2 | 2x PBS | Blød, let deformerbart materiale, men mere robust end 1x PBS prøve | |||
| 20 | 3 | 2x PBS | Blød men stivere end 2% | |||
| 20 | 6 | 2x PBS | god konsistens | |||
| 30 | 2 | 2x PBS | God konsistens, mere studry end med 1x PBS | |||
| 30 | 3 | 2x PBS | God konsistens, mere studry end med 1x PBS | |||
| 30 | 2x PBS | God blandbarhed men britle | ||||
| 40 | 2 | 2x PBS | Konsistensen varierer langs prøven | |||
| 40 | 3 | 2x PBS | Konsistensen varierer langs prøven | |||
| 40 | 6 | 2x PBS | Konsistensen varierer langs prøven, og det var skør | |||
| 20 | 2 | Vand | Ikke danne en gel / gummimateriale | |||
| 20 | 3 | Vand | Dannede en gel men synes stivere end than 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 20 | 6 | Vand | Dannede en gel men synes stivere end 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 30 | 2 | Vand | Ikke danne en gel / gummimateriale | |||
| 30 | 3 | Vand | Dannede en gel men synes stivere end 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 30 | 6 | Vand | Dannede en gel men synes stivere end 1x PBS og 2x PBS, inkonsekvent | |||
| 40 | 2 | Vand | Ikke danne en gel / gummi material | |||
| 40 | 3 | Vand | Konsistensen varierer langs prøven - stivere på toppen | |||
| 40 | 6 | Vand | Konsistensen varierer langs prøven - stivere på toppen | |||
Tabel 3. BSA gummi. Efter BSA gummi reagerede O / N, 8 mm biopsi dorn hul af prøven blev taget. Denne tabel indeholder nogle visuelle observationer af konsistens og udseende af prøverne.
Supplement Figur 1. Solid procentdel. Procentdelen af faste stoffer fra hver gummi blev bestemt (tørvægt / vådvægt). Opløsningsmidlet påvirkede ikke Percentage af faste stoffer (p> 0,05). Klik her for at downloade denne fil.
Supplement Figur 2. Sine bølge af 30% BSA 3% glutaraldehyd 2x PBS. Den trykbelastning og forskydning af prøven er vist som funktioner af den forløbne tid. Klik her for at downloade denne fil.
Supplement Figur 3. sinusbølge på 30% BSA 3% glutaraldehyd 2x PBS. Stress og belastning af prøven blev beregnet og afbildet som en funktion af forløbet tid. Der er en lille faseforskydning, indivejledende af den viskoelastiske opførsel af gummi. Klik her for at downloade denne fil.
Supplement Figur 4. Mastercam faste stoffer. (A) Loop og (B) stabilitet stykker. Efter at designe disse ved hjælp Mastercam blev G-kode importeret og et rustfrit stål eller messing stykke ved hjælp af Microlution maskine eller en PLA stykke ved hjælp af MakerBot 3D Replicator. Klik her for at downloade denne fil.
| grænser | Min | Max | ||
| -17 | 3 | | ||
| Forskydning (mm) | -1,5 | 0,3 | ||
| Bølge | Level 1 | niveau 2 | Frekvens (Hz) | Cyklus |
| Sine | -15 | -3 | 1 | 5.000 |
| Dataindsamling | ||||
| Scan tid | 1,008 | |||
| Scan punkter | 360 | |||
| Antal Scanner </ Td> | 5 | |||
| efterfølgende Scan | 1,008 sek mellem scanning | |||
Supplement Tabel 1. Compression test parametre. Ved hjælp af en sinusbølge, blev forholdet mellem belastning og forskydning bestemmes for de fire typer af gummi. Klik her for at downloade denne fil.
| ANOVA Resultater | |||||
| df | SS | FRK | F | betydning F | |
| Regression | 3 | 9.85E + 02 | 3.28E + 02 | 4.70E + 02 | 1.06E-18 |
| Resterende | 20 | 1.40E + 01 | 6.99E-01 | ||
| Total | 23 | 9.99E + 02 | |||
| Regression Analysis | |||||
| Koefficienter | standard Error | t Stat | P-værdi | ||
| Intercept | 1.74E + 00 | 8.23E-01 | 2.12E + 00 | 4.70E-02 | |
| BSA (%) | 7.82E-01 | 2.09E-02 | 3.74E + 01 | 5.49E-20 | |
| Glutaraldehyd (%) | 3.17E-01 </ Td> | 1.03E-01 | 3.09E + 00 | 5.71E-03 | |
| opløsningsmiddel | 2.61E + 01 | 2.22E + 01 | 1.18E + 00 | 2.53E-01 | |
Supplement Tabel 2. Statistisk analyse af den procentdel af faste stoffer i BSA gummi. BSA og glutaraldehyd væsentligt påvirket procentdelen af faste stoffer. Opløsningsmidlet påvirkede ikke procentdelen af faste stoffer. Klik her for at downloade denne fil.
| ANOVA Resultater | |||||
| df | SS | FRK | F | betydning F | |
| Regression | 3 | 3.06E + 05 | 1.02E + 05 | 1.18E + 01 | 4.00E-03 |
| Resterende | 7 | 6.07E + 04 | 8.67E + 03 | ||
| Total | 10 | 3.67E + 05 | |||
| Regression Analysis | |||||
| Koefficienter | standard Error | t Stat | P-værdi | ||
| Intercept | 6.50E + 02 | 4.25E + 01 | 1.53E + 01 | 1.23E-06 | |
| BSA (%) | 4.67E + 00 | 3.80E + 01 | 1.23E-01 | 9.06E-01 | |
| opløsningsmiddel | 1.02E + 02 | 3.80E + 01 | 2.67E + 00 | 3.20E-02 | |
| Glutaraldehyd (%) | 1.16E + 02 | 5.70E + 01 | 2.03E + 00 | 8.21E-02 | |
Supplement tabel 3. Statistisk analyse af elasticitetsmodulet relateret til PBS koncentration. PBS koncentration væsentligt påvirket elasticitetsmodulet. Stigningen af salte i opløsningsmidlet forårsagede en stigning i den elastiske modulus. Klik her for at downloade denne fil.
| ANOVA Resultat | |||||
| df | SS | FRK | F | betydning F | |
| Regression | 3 | 6.15E-15 | 2.05E-15 | 3.68E + 00 | 1.67E-02 |
| Resterende | 60 | 3.34E-14 | 5.57E-16 | ||
| Total | 63 | 3.96E-14 | |||
| Regression Analysis | |||||
| Koefficienter | standard Error | t Stat | P-værdi | ||
| Intercept | 3.74E-08 | 1.37E-08 | 2.74E + 00 8.03E-03 | ||
| BSA (%) | 3.89E-10 | 3.62E-10 | 1.07E + 00 | 2.88E-01 | |
| Glutaraldehyd (%) | -5.92E-09 | 1.83E-09 | -3.23E + 00 | 2.02E-03 | |
| opløsningsmiddel | -6.78E-08 | 3.76E-07 | -1.80E-01 | 8.58E-01 | |
Supplement Tabel 4. Statistisk analyse af reaktionshastigheden efter 15 timers enzym fordøjelse. Koncentrationen glutaraldehyd væsentligt påvirket reaktionshastigheden for fordøjelse af gummi ved at formindske ved højere koncentrationer glutaraldehyd. Klik her for at downloade denne fil.
| ANOVA Resultater | |||||
| df | SS | FRK | F | betydning F | |
| Regression | 3 | 7.36E-15 | 2.45E-15 | 3.62E + 01 | 1.21E-13 |
| Resterende | 62 | 4.20E-15 | 6.78E-17 | ||
| Total | 65 | 1.16E-14 | |||
| Regression Analysis | |||||
| Koefficienter | standard Error | t Stat | |||
| Intercept | 2.98E-08 | 4.77E-09 | 6.25E + 00 | 4.22E-08 | |
| BSA (%) | 4.56E-10 | 1.26E-10 | 3.62E + 00 | 6.03E-04 | |
| Glutaraldehyd (%) | -6.04E-09 | 6.15E-10 | -9.82E + 00 | 3.00E-14 | |
| opløsningsmiddel | -6.57E-08 | 1.31E-07 | -5.02E-01 | 6.17E-01 | |
Supplement tabel 5. Statistisk analyse af reaktionshastigheden efter 24 timer enzym fordøjelse. Koncentrationen af BSA og glutaraldehyd påvirkede signifikant reaktionshastigheden for fordøjelsen af gummiet. Ved højere koncentrationer glutaraldehyd, er der et fald i than reaktionshastigheden. Ved højere BSA-koncentrationer, er der en stigning i reaktionshastigheden. Klik her for at downloade denne fil.
| ANOVA Resultater | |||||
| df | SS | FRK | F | betydning F | |
| Regression | 3 | 3.10E-15 | 1.03E-15 | 2.74E + 01 | 1.64E-11 |
| Resterende | 64 | 2.42E-15 | 3.78E-17 | ||
| Total | 67 | 5.52E-15 | |||
| Regression Analysis | |||||
| Koefficienter | standard Error | t Stat | P-værdi | ||
| Intercept | 2.17E-08 | 3.50E-09 | 6.20E + 00 | 4.55E-08 | |
| BSA (%) | 2.13E-10 | 9.20E-11 | 2.31E + 00 | 2.39E-02 | |
| Glutaraldehyd (%) | -3.94E-09 | 4.53E-10 | -8.70E + 00 | 1.90E-12 | |
| opløsningsmiddel | 3.04E-08 | 9.57E-08 | 3.18E-01 | 7.51E-01 | |
Supplement Table6. Statistisk analyse af reaktionshastigheden efter 48 timers enzym fordøjelse. BSA og glutaraldehyd-koncentrationen påvirkede signifikant reaktionshastigheden for fordøjelsen af gummiet. Ved højere koncentrationer glutaraldehyd, der er et fald i reaktionshastigheden. Klik her for at downloade denne fil.
| ANOVA Resultater | |||||
| df | SS | FRK | F | betydning F | |
| Regression | 3 | 2.19E-15 | 7.29E-16 | 3.05E + 01 | 3.56E-12 |
| Resterende | 61 | 1.46E-15 2.39E-17 | |||
| Total | 64 | 3.64E-15 | |||
| Regression Analysis | |||||
| Koefficienter | standard Error | t Stat | P-værdi | ||
| Intercept | 1.05E-08 | 2.84E-09 | 3.69E + 00 | 4.80E-04 | |
| BSA (%) | 3.61E-10 | 7.48E-11 | 4.83E + 00 | 9.48E-06 | |
| Glutaraldehyd (%) | -3.07E-09 | 3.69E-10 | -8.33E + 00 | 1.21E-11 | |
| Sålvent | 3.97E-08 | 7.80E-08 | 5.09E-01 | 6.12E-01 | |
Supplement Tabel 7. Statistisk analyse af reaktionshastigheden efter 72 timer enzym fordøjelse. Koncentrationen af BSA og glutaraldehyd påvirkede signifikant reaktionshastigheden for fordøjelsen af gummiet. Ved højere koncentrationer glutaraldehyd, er der et fald i reaktionshastigheden. Ved højere BSA-koncentrationer, er der en stigning i reaktionshastigheden. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofabrication er et meget tværfagligt felt, hvor biologi og tekniske principper fusionere til at generere komplekse materialer, der efterligner native væv. For at opnå dette, er der behov for at udvikle teknikker, der bruger de indsamlede oplysninger fra in vivo-væv og omsætte den til en in vitro stillads. På denne måde kan en platform konstrueres der ligner de arkitektoniske, funktionelle og mekaniske egenskaber in vivo væv. Den optimale stilladser materiale bør besidde visse egenskaber, såsom at være biokompatible, efterligner de mekaniske egenskaber af vævet af interesse, være i stand til kontrolleret nedbrydning, kan støtte cellelevedygtighed, og i stand til at tillade væv remodeling 2,3.
Et væld af fremstillingsteknik er blevet udviklet til at generere levedygtige, tredimensionale konstruktioner. Disse teknologier falder i to hovedkategorier: konventionel end avancerede. De konventionelle teknikker omfatter anvendelsen af syntetiske og naturlige traditionelle materialer til at gøre porøse strukturer. Nogle eksempler er solvent-casting, frysetørring, og smelte støbning. Ulemper ved disse teknikker omfatter dårlig styring af porøsitet i strukturen (porestørrelse og pore sammenkobling) og svært ved at gøre interne kanaler inden for stilladser. Avancerede teknikker omfatter stereolitografi, støbning, 3D-print, og elektrospinning, blandt andre 1. Disse teknikker har ulemper, såsom manglende langtrækkende mikroarkitektur kanaler, materialevalg for at tilvejebringe optimal mekanisk styrke og samtidig være i stand til at afgive gennem dyser med lille diameter, optimering afhænger af materialet, kræver omfattende efterbehandling, der kan være toksiske, og restriktion i designet af indre arkitekturer i en in vitro-konstrukt. En væsentlig ulempe i 3D-print er tilgængeligheden af biomaterialer, der er tilstrækkelige celle luftfartsselskaberOg samtidig har de mekaniske egenskaber, som kræves for at opretholde et defineret arkitektonisk organisation 12. Teknologien præsenteres her inkorporerer både konventionelle og avancerede fremstillingsteknik. Det bedste fra begge verdener er afledt af konvergensen af computerstøttet produktion at skabe, eller import, den ønskede arkitektur med udviklingen af et enzym-labil gummi. De rustfrie forme stål blev oprettet ved hjælp af en fræsemaskine, men deres fremstilling er ikke begrænset til denne teknik. Ved hjælp af en 3D printer (f.eks MakerBot), blev de samme forme fremstillet af polymælkesyre (PLA). De negative forme blev formalet ved hjælp arkitektoniske direktiver designet af CAD-program, der giver solide forme, der skaber en nem og pålidelig overførsel af funktioner til ethvert materiale. Denne teknologi er signifikant ved, at den ikke kun tillader kontrol af den eksterne væv sammensætning, men også af den meget komplekse interne arkitektur. Arbejdet præsenteres herfokuserer primært på karakteriseringen af BSA gummi, som kan blandes homogent, er let fordøjeligt i en rimelig tid, var resistent over for ændringer i sin struktur, og er i stand til at efterligne minut funktioner, mens du holder dets stabilitet under støbeprocessen . Begrænsningen ved denne teknik blev testet og det hellige materiale beslutning kan opretholde dimensioner så små som 300 um i diameter. Imidlertid Figur 7 viser, at kanalen er omgivet af et tyndt lag af slipmiddel. Ved mikroskopi dette ekstra område er sådanne og kan fjernes for at have den ønskede dimension. Denne biofabrication teknik tillader replikation af en lang række interne strukturer, der spænder fra makro- til mikroskala.
Serumalbumin er det mest rigelige protein i kredsløbet. Da proteinerne er polyelektrolytter, blev opløselighed bestemt ved elektrostatiske interaktioner 15-17. Det er blevet vist, at ved lave saltkoncentrationer, der er en saltning-in effekt på protein lette dets opløselighed 18. Glutaraldehyd er et tværbindingsmiddel, der forårsager ændringer i egenskaberne af albumin. Farveændringen ses i figur 1 tilskrives dannelsen af aldimin bindinger 19-21. Den glutaraldehyd reagerer overvejende med BSA gennem aminogrupperne i lysin til dannelse af de intermolekylære kovalente bindinger 14. Dataene viser, at stigningen af salte forbedret elasticitet gummi (fra 1x PBS til 2x PBS). Den højere koncentration glutaraldehyd producerer stivere geler, der sætter tidligere sammenlignet med lav koncentration dem. Men de er vanskeligere at dispensere, blandes homogent, og de danner sprøde geler. For at levere den passende mængde af BSA gummi i formene, skal alle dele af samlingen holdes koldt, fordi højere temperaturer fremskynder glutaraldehyd og BSA reaktion.Den ideelle gummi (30% BSA 3% glutaraldehyd i 2x PBS eller 1x PBS) opfører sig som et viskoelastisk materiale, der kan modstå belastning uden permanent at deformere. Dette bliver meget vigtigt, når håndtering og støbning materiale omkring BSA gummi struktur.
Trypsin er en serinprotease, som hydrolyserer proteiner. Trypsin er en meget anvendt enzym, der har høj spaltningsspecificitet. Det spalter peptidkæder hovedsagelig på carboxylsiden af aminosyrerne lysin og arginin 22. BSA er letopløselig ved lave koncentrationer i vand, og trypsin let fordøjet BSA gummi forlader kollagen intakt og relativt uberørt. Materialet vil ikke have nogen kontakt med celler. Konstruktionen blev testet for tilstedeværelsen af frit glutaraldehyd og der var ingen spor af dette fixativ. Dette viser effektiviteten af BSA gummi som en opofrende materiale til biofabrication. I denne protokol, blev collagen anvendes som stillads materiale, men enhver othendes materiale, der er resistent over for trypsin fordøjelse kunne anvendes.
Det fremtidige arbejde vil være fokuseret på rekonstituering de vaskulære komponenter inden for de hydrogeler ved at pode stilladset med endotel og fibroblastceller. En af udfordringerne er at skabe en ensartet fordeling af celler i hele indersiden af kanalerne, der efterligner den native 3D distribution. For at løse dette problem, er en strategi blive udviklet, som tillader forsegling eller tilstopning af kanalerne og injektionen af cellesuspensionen. Det afprøvede materiale er Pluronic F127, som er en termoreversibel gel, flydende ved 4 ° C og en fast over 30 ° C 23,24. En høj koncentration af pluronic var lykkedes at skabe den nødvendige tidsmæssige segl. Efter cellesuspensionen inden kanalerne i stilladset, er den enhed roteret i en bestemt mængde tid, indtil cellerne overholder alle sider af 3D-strukturen. Den indvendige kanal vil have tilstrækkelig medier for at opretholdecelleoverlevelse. Pluronic fastholder sin gelform og er letopløselig i et vandigt miljø. Når cellerne klæber, vil hydrogelen blive oversvømmet med medier, og kan dyrkes i stationære eller strømningsforhold, afhængigt af formålet med undersøgelsen. Denne metode vil blive yderligere vurderet og bliver opfølgeren til denne publikation. Den biofabrication her beskrevne teknik anvendes for tiden til at udvikle et stillads replika af en human renal arterie. Samme fremgangsmåde kunne gøres med andre typer af væv, såsom hjerte-, at udvide anvendeligheden af denne teknik til en bred vifte af kliniske anvendelser.
Den biofabrication teknik udviklet her er et skridt fremad i dannelsen af in vitro-stilladser, der kan rekapitule- iboende geometriske funktioner hurtigt og pålideligt. En naturlig materiale, såsom collagen, blev valgt, fordi det giver optimal kemisk og fysiske signaler til celler frem syntetiske materialer. Disse narelle materialer kan anvendes til terapeutisk forskning, som in vitro-modeller for udvikling, misdannelse, og sygdom væv, samt til udskiftning af beskadigede væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I | Collagen extracted from calf hide | ||
| Hydrocloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) | MP Biomedical | U5378 | 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS |
| Albumium from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Glutaraldehyde | Sigma -Aldrich | G5882 | Toxic |
| Lard | Fields | 3090 | |
| Stainless Steel Molds | Milled using Microlution Machine | ||
| Air Brush Kit | Central Pneumatic | 47791 | |
| Mixing Tip for double syringe | Medmix | ML2.5-16-LLM | Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med |
| Small O ring for double syringe | Medmix | PPB-X05-04-02SM | Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural |
| Double Syringe cap | Medmix | VLX002-SM | Cap, 4:1/10:1, PE brown, med |
| Big O ring for double syringe | Medmix | PPA-X05-04-02SM | Piston A, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe | Medmix | SDL X05-04-50M | Double syringe, 5 ml, 4:1 |
| Double Syringe Dispenser | Medmix | DL05-0400M | Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain |
| Laminim | 3.6 mg/ml - extracted USC lab | ||
| 20 ml Syringe Luer Lock Tip | BD | 302830 | |
| Luer Lock Caps | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma -Aldrich | H4034 | |
| Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) | Life Technologies | 1143-030 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV Crosslinker | Spectroline UV | XLE1000 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Fisher | S271-10 | To prepare Mosconas |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma -Aldrich | P5405-250 | To prepare Mosconas |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328-500 | To prepare Mosconas |
| Glucose | Sigma -Aldrich | G-8270 | To prepare Mosconas |
| Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S-7907 | To prepare Mosconas |
| Sterile Filter for syringes | Corning | 431224 |
References
- Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
- Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
- Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
- Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
- Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
- Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
- Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
- Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
- Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
- Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
- Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
- Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
- Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
- Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
- Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
- Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
- Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
