Summary
De mekanismer, der styrer det interstitielle motilitet af CD4-T-celler ved steder med inflammation er relativt ukendt. Vi præsenterer en ikke-invasiv metode til at visualisere og manipulere in vitro -primet CD4 T-celler i de inflammerede øre dermis, hvilket tillader undersøgelse af den dynamiske opførsel af disse celler in situ.
Abstract
Evnen af CD4 T-celler til at udføre effektorfunktioner afhænger af hurtig og effektiv migration af disse celler i betændte perifere væv gennem en endnu udefineret mekanisme. Anvendelsen af multifoton mikroskopi til studiet af immunsystemet tilvejebringer et værktøj til at måle dynamikken i immunresponser i intakte væv. Her præsenterer vi en protokol for ikke-invasiv intravital multifoton billeddannelse af CD4 T-celler i de betændte mus øre dermis. Brug af en tilpasset imaging platform og et venekateter muliggør visualisering af CD4 T-celle dynamik i den dermale interstitium, med evnen til at forespørge disse celler i realtid via tilsætning af blokerende antistoffer til centrale molekylære komponenter, der medvirker i motilitet. Dette system giver fordele i forhold til både in vitro modeller og kirurgisk invasive billeddiagnostiske procedurer. Forståelse af de veje, der bruges af CD4 T-celler til motilitet kan i sidste ende give indblik i de basic funktion af CD4 T-celler samt patogenesen af både autoimmune sygdomme og patologi af kroniske infektioner.
Protocol
Alle procedurer, der involverer mus blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Rochester, og udføres i nøje overensstemmelse med dyreværnsloven Public Health Service Policy på Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og administreres af National Institutes Sundhedsstyrelsen, Kontoret for Laboratory Animal Welfare.
1. Fremstilling af Effector CD4 T-celler
BEMÆRK: BALB / c TCR-transgene DO11.10 mus, der specifikt genkender et peptid fra kylling æg ovalbumin (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Andre TCR-transgene systemer kan være substitueret, anvendelse af det passende beslægtede peptid i stedet for pOVA er angivet.
- Oprens naive CD4 T-celler
- Aflive en 6-8 uger gammel kvinde DO11.10 BALB / c-mus ved at udsætte til 2 l / min CO 2, indtil musen viser ingen tegn på bevægelse eller vejrtrækning i 1 min, efterfulgt af cervikal dislokation, eller ifølgeretningslinjer for den lokale Institutional Animal Care og brug udvalg. Spray musen med en ethanolopløsning 70% og gøres næsten 7 cm incision i huden fra hagen af musen til 2/3 af vejen ned i maven. Gør 2-3 cm snit i huden fra enden af snit i maven mod bagtæerne. Pas på ikke at skære ind i bughinden.
- Omhyggeligt adskille huden fra peritoneum ved forsigtigt at trække med en pincet. De inguinale lymfeknuder er placeret på huden nær krydset af bagbenene med kroppen. Fjerne ved at gribe og trække med pincet og sted i 8 ml HBSS suppleret med 2% nyfødt kalveserum (NCS).
- Høste aksil og brachialis lymfeknuder fra musen ved at gribe og trække forsigtigt med en pincet. Placer i HBSS + 2% NCS med de inguinale lymfeknuder.
- Høst de dybe og overfladiske cervikale lymfeknuder placeret i halsen på mus med pincet og sted i HBSS + 2% NCS med othendes lymfekirtler.
- skæres forsigtigt ind i bughinden, pas på ikke at skære ind i tarmene. Tag fat i coecum og colon med pincet og udsætte mesenteriallymfeknuder, der er placeret lige langs tyktarmen. Fjern forsigtigt mesenteriallymfeknuder med pincet og placere med de andre lymfeknuder.
- Find milten i bughulen og forsigtigt fjerne det, besiddelse med pincet og skære bindevævet væk med et par kirurgiske sakse. Placer milten med lymfeknuderne.
- Der fremstilles en enkelt cellesuspension ved at hælde HBSS + 2% NCS indeholdende milt og lymfeknuder i en metal si anbragt i et 60 x 15 mm dyrkningsskål. Forsigtigt mash milten og lymfeknuderne gennem metal si med stemplet fra en 10 ml sprøjte i HBSS + 2% NCS.
- Ved hjælp af en pipette, flytte cellesuspensionen til et rent 50 ml centrifugerør. Skyl metal si og dyrkningsskålen med yderligere 10 ml HBSS + 2% NCS, usynge en pipette og placere denne opløsning i den samme 50 ml centrifugerør som cellesuspensionen.
- Spin cellerne ved 600 x g i 5 min for at pelletere cellerne og resuspenderes i 10 ml HBSS + 2% NCS ved forsigtigt at pipettere. Medmindre andet er angivet, bør alle centrifugering udføres ved 600 xg i 5 min.
- Fortynd 10 pi af cellesuspensionen i 90 pi 0,1% trypanblåt i PBS i en 1:10 fortynding. Til 10 pi af cellerne i trypanblåt på et hæmocytometer ved pipettering af opløsningen i rillen ved kanten af hæmocytometeret. Tæl de hvide blodlegemer i midten gitter af hæmocytometeret, ignorerer erytrocytter, der vises som lidt mindre, runde, røde minimalistisk celler og de blå døde / døende celler. Gange antallet af celler tælles af 10 4, med fortyndingsfaktoren (10), og med volumenet af cellerne (10 ml) for at bestemme det samlede antal celler indsamlet i 50 ml centrifugerør.
- At berige for CD4 T-celler, centrifugeresceller at pelletere, og resuspender cellerne ved 2x10 7 celler / ml i en opløsning indeholdende ca. 1 pg / ml anti-CD8 (klon 3.155), 1 ug / ml anti-MHC klasse II (klon M5 / 114), og 1 ug / ml anti-CD24 (klon J11d) antistoffer i HBSS + 2% NCS ved forsigtigt at pipettere.
BEMÆRK: De til denne trin-antistoffer er afledt internt fra hybridomcellelinjer og koncentrationer er tilnærmet. Koncentrationen og mængden af disse antistoffer ideel til komplementlyse blev bestemt empirisk og vil variere mellem laboratorier. Alternativt flere kommercielt tilgængelige kits er tilgængelige til oprensning af naive CD4 T-celler og kan anvendes i stedet for komplementlyse og CD62L + rensningsproces gengivet her. Hvis du bruger en anden metode til at rense naive CD4 T-celler, kan denne protokol fortsættes fra trin 1.2. - Der inkuberes på is i 30 minutter. Ved afslutningen af denne inkubation hurtigt tø marsvinekomplement ved anbringelse i et 37 ° C varmt BATH i ca. 2 min. Tilsæt 100 pi komplement til hver 1 ml celler i antistofopløsningen ved pipettering komplementet direkte i cellesuspensionen. Cellerne inkuberes i et 37 ° C vandbad i 30 min.
- Tilføj HBSS + 2% NCS at bringe cellerne til et totalvolumen på 20 ml i centrifugeglasset. Lag i 8 ml RT densitetscentrifugering medier (massefylde 1,086 g / ml) under cellerne. centrifugeres straks cellerne ved 1400 xg ved stuetemperatur i 15 minutter med centrifugen bremsen.
- Indsamle celler ved grænsefladen anvendelse af en serologisk pipette og overføre cellerne til et nyt 50 ml centrifugerør. Vask cellerne ved at bringe volumen i centrifugeglasset til 50 ml med HBSS + 2% NCS og centrifugering.
- Resuspender cellerne i MACS buffer (PBS suppleret med 2% NCS og 2 mM EDTA) ved forsigtigt pipettering og tælle som tidligere, i trin 1.1.10.
- At berige for naive CD4 T-celler, resuspenderes cellerne ved 2x10 7 celler / ml i en opløsningpå 2,5 ug / ml biotin-konjugeret anti-CD62L-antistof i MACS buffer, baseret på antallet tælles i trin 1.1.16. Der inkuberes i 30 minutter på is.
- Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml MACS buffer, derefter centrifugering af cellerne. Resuspender cellerne ved 10 7 celler / 100 pi i MACS buffer og tilføj streptavidin-konjugeret magnetisk separation perler på en 1:10 fortynding direkte til cellerne. Der inkuberes på is i 20 minutter.
- Vask cellerne som før i trin 1.1.17, og resuspender cellerne ved 2x10 8 celler / ml i MACS buffer, i et minimalt volumen på 500 pi.
- Placer en magnetisk separation kolonne i holderen magneten og vaske kolonnen ved at lade 3 ml MACS buffer flyde igennem. Påfør cellerne til søjlen med en pipette.
- Vask kolonne for at fjerne celler, der ikke er bundet af den magnetiske kolonne ved pipettering 3 ml MACS buffer på søjlen og lade MACS buffer at strømme igennem, og gentag 3 gange. Kassér gennemstrømningsfraktionen.
- afte kolonnen fra den magnetiske stå og holde over en ny 50 ml centrifugerør. Pipetter 5 ml MACS buffer på søjlen og bruge stemplet vedlagt kolonnen at skubbe MACS buffer gennem søjlen for at frigøre kolonnen bundne celler og indsamle strømningen gennem der indeholder de berigede naive CD4 T-celler.
- Centrifuger cellerne og resuspenderes i 10 ml RPMI suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 50 uM 2-mercaptoethanol (RPMI-10). Tæl celler som før, i trin 1.1.10.
- Juster slutkoncentration af naive CD4 T-celler til 6x10 5 / ml i RPMI-10.
- Oprense T-celle-depleteret milt-APC'er
- Aflive en 6-8 uger gammel kvinde vildtype BALB / c-mus som i trin 1.1.1.
- Spray musen med en ethanolopløsning 70% og eksponere milten ved at gøre et ca. 3 cm incision i venstre side af musens abdomen. Skær åbne peritoneal lag og fjern milten ved forsigtigt gribe det med pincet og skære det væk fra den underliggende forbinder væv med en kirurgisk saks.
- Placer milten i 8 ml HBSS + 2% NCS.
- Forbered en enkelt celle suspension ved mæskning milten, vask, og tælle cellerne, som før, i trin 1.1.7-1.1.10
- Depletere T-celler ved centrifugering af cellerne ved 600 x g i 5 min til pellet, og cellerne resuspenderes ved 2x10 7 i en opløsning af ca. 1 pg / ml anti-Thy1.2 antistof (J1J klon) ved forsigtigt at pipettere. Inkubér cellerne på is i 30 minutter.
BEMÆRK: Dette antistof blev afledt internt fra en hybridomacellelinie og Koncentrationsgraden approksimeres. Koncentrationen og volumenet af dette antistof ideel til komplementlyse blev bestemt empirisk og vil variere mellem laboratorier. Andre fremgangsmåder til oprensning af APC'er fra splenocytter kan substitueres, hvis det ønskes. Naive T-celler og APC'er bør udarbejdes i kulture fra trin 1.3. - Tilføj marsvinekomplement, inkuber og adskille cellerne på en densitetscentrifugering medie gradient som før, i trin 1.1.13-1.1.14.
- Resuspender cellerne i 10 ml RPMI-10 og bestråle APC'er ved at anbringe cellerne i et 50 ml centrifugerør i et gamma strålerøret til en tid, vil udsætte cellerne for 25 Gy stråling. Denne tid vil variere baseret på strålerøret og bliver nødt til at blive beregnet hver gang celler bestråles.
- Tæl cellerne på et hæmocytometer som før i trin 1.1.10, og justere APC-celler til en slutkoncentration på 2.4x10 6 celler / ml i RPMI-10.
- Stimulere celler og differentiere CD4 T-celler til en Th1-fænotype i en 5-dages kultur.
BEMÆRK: Selvom vi præsenterer her en protokol for at forberede og billeddannelse Th1 effektorer genereret fra naive CD4 T-celler, kan denne protokol indstilles til at differentiere de naive celler til en anden fænotype, eller to anvende andre celletyper, såsom CD8 T-celler. Betingelser for priming og differentiering skal bestemmes empirisk.- I hver brønd i en 24-brønds dyrkningsplade, kombinere 500 pi af naive CD4 T-celler og 500 pi de bestrålede APC'er i hver brønd, for i alt 3x10 5 T-celler og 1.2x10 6 APC'er per brønd.
- Der fremstilles en opløsning i RPMI-10 indeholdende 2 uM beslægtet OVA-peptid, 20 U / ml rekombinant IL-2, 80 ug / ml anti-IL-4 (klon 11B11) og 40 ng / ml rekombinant IL-12 og filteret under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter. Tilføj 1 ml af denne opløsning til hver brønd af celler, til et samlet volumen på 2 ml i hver brønd.
- Inkubér cellerne i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2 i 3 dage.
- På dag 3 opdele kulturerne ved forsigtigt at pipettere at resuspendere celler og flytte 1 ml fra hver brønd i en ny kultur godt. Bringe hver brønd til et slutvolumen på 2 ml ved tilsætning af 1 ml / brønd af RPMI-10 + 20 U / ml rekombinant IL-2. </ Li>
- Retur pladerne til inkubatoren og tillade cellerne at ekspandere indtil dag 5.
2. Overførsel af celler og induktion af inflammation
BEMÆRK: For at opnå optimale celleantal til billeddannelse, bør 5x10 6 fluorescensmærkede Th1-celler overføres til hver mus i et samlet volumen på 200 pi PBS. Celler her er mærket med grønt farvestof CFSE eller nær-røde farvestof CMTMR, selvom der kan anvendes andre celle tracker farvestoffer. CFSE og CMTMR-mærkede celler kan co-overført for at muliggøre sporing af to særskilte effektor CD4 populationer.
- Label effektor T-celler med CFSE
- Cellerne høstes fra dyrkningsskålene ved kraftig afpipettering af celler i hver brønd og overførsel til et sterilt 50 ml centrifugerør med en pipette. Tæl cellerne som i trin 1.1.10, derefter centrifugeres og cellerne resuspenderes ved 10 7 celler / ml i PBS + 5% NCS.
- Fortynd 5 mM stamopløsning CFSE opløsning 1: 100 iPBS. Tilføj 110 pi CFSE løsning for hver 1 ml celler ved at anbringe en dråbe CFSE opløsning på den side af røret, og derefter hurtigt rokkende røret frem og tilbage til grundigt at blande.
- Inkubér cellerne i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter bratkøle CFSE ved tilsætning af 5 ml føtalt kalveserum (FCS) direkte til røret af celler. Bring rumfang på 50 ml med PBS + 5% NCS.
- Centrifuger cellerne og pellet resuspenderes i 20 ml PBS + 5% NCS. Gentag denne proces to gange for at vaske cellerne 3 gange i alt. Tæl cellerne på et hæmocytometer, som før i trin 1.1.10, og cellerne resuspenderes i sterilt PBS ved 2,5 x 10 7 celler / ml for overførsel til mus.
- Label effektor T-celler med CMTMR
- Cellerne høstes som ovenfor i trin 2.1.1, derefter tælle, centrifuge og cellerne resuspenderes ved 10 7 celler / ml i RPMI-10.
- Tilsæt 10 mM CMTMR stamopløsning direkte til cellerne i en slutkoncentration på 10 uM. Hurtigt pipette the-celler blandes grundigt i CMTMR og forhindre udfældning af farvestoffet.
- Inkuber 30 min i et 37 ° C vandbad. Vask cellerne 3x i PBS + 5% NCS som før i trin 2.1.3-2.1.4. Tæl og cellerne resuspenderes i sterilt PBS ved 2.5x10 7 celler / ml for overførsel til mus.
- Overfør effektor T-celler til naive 6-8 uger gamle BALB / c-mus.
- Tegn cellesuspensionen (trin 2.1.4 eller 2.2.3) i en sprøjte, idet man fjerne alle boblerne ved at holde kanylen side-up, forsigtigt flicking den side af sprøjten og bevæge stemplet op og ned, hvis det er nødvendigt .
- Placer mus i en ren bur og varme forsigtigt under en varmelampe, indtil halevenen vises vasodilated. Placer musen i en fastholdende anordning og tør halen med en spritserviet. Langsomt injicere 200 pi af cellesuspensionen i den laterale halevene. Der bør ikke være nogen modstand til injektion eller synlige bobler under huden.
- Inducere dermal inflammation ved immunisering med Freunds komplette adjuvans (CFA)
BEMÆRK: I denne protokol, er betændelse fremkaldt af intradermal injektion af CFA emulgeret med enten beslægtet eller ikke-beslægtet antigen. Andre inflammatoriske modeller kan være substitueret, selv om antallet af celler, der kræves for overførsel og timingen af billeddannelse vil skulle justeres empirisk.- Der fremstilles en 200 uM opløsning af OVA-peptid i steril PBS i et mikrocentrifugerør. Pipetter et ækvivalent volumen CFA oven af peptidet opløsning.
- Emulgere opløsningen ved at trække den ind i en 28 G1 / 2 insulinsprøjte og derefter kaster opløsningen tilbage i mikrocentrifugerør, derefter gentage denne handling ca. 20 gange. Når den er fuldt emulgeret, vil CFA og peptidopløsning danne en tyk og uigennemsigtig blanding.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge en fast nål insulinsprøjte at danne emulsionen, da emulsionen vil gå tabt i det døde rum i en løstsiddende needle sprøjte. - Test emulsionen ved at dryppe en lille mængde på vand anbringes i en petriskål. Emulsionen bør forblive intakt og ikke spredes i vand.
- Tegn emulsionen til en 300 gl 28 G1 / 2 insulinsprøjte og tryk ned skarpt på stemplet for at fjerne store luftbobler.
- Umiddelbart efter overførslen af fluorescensmærket effektor T-celler, bedøver musene ved ip injektion af 2,2,2-tribromethanol ved 240 mg / kg. Vurdere bedøvelse af en blid tå knivspids, administration mere 2,2,2-tribromethanol i spring på 1 mg, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: andre godkendte anæstetika kan erstatte den 2,2,2-tribromethanol. - Placer et fingerbøl på venstre pegefinger og forsigtigt fat i musen øre mellem venstre tommelfinger og pegefinger med den ventrale øre opad. Sørg for ikke at trykke for hårdt på øret, som kan forårsage mekanisk skade på huden.
- Skub nålen indeholdende CFA emulsion ind i dermis, smig side opad, og langsomt injicere 10 pi af emulsionen ind i øret. Placering af injektionen bør være i den ydre 1/3 af pinna, lidt off-center for at muliggøre optimal billeddannelse.
- Overvåg mus, indtil bedøvelsen er ophørt og mus er i stand til at rette sig selv og er ambulant. Billede mus 3 dage efter immunisering, der giver tid til betændelse at udvikle og de overførte T-celler til trafik til øret dermis.
BEMÆRK: Mus kan ikke efterlades uden opsyn på noget tidspunkt, mens under anæstesi.
3. Forberedelse af Mouse for Imaging
- Forbered et kateter
- Fjern forsigtigt metal nål fra en 30 G1 / 2 Tuberculin (TB) sprøjte nål med en tang og rengør overskydende lim ved hjælp af en dissekere mulighed for at visualisere, at limen er helt fjernet.
- Skær spidsen af en anden 30 G1 / 2 TB sprøjtenål, der sikrer, at den resterende nålen stadig patent ved visuel inspektion. Slip en 18 cm stykke af PE-10 medicinske slanger på trimmede nål, og anbring forsigtigt det bare metal nålen ca. 5 mm ind i den anden ende af røret, hvilket skaber et kateter.
- Skyl kateteret ved at fylde en 1 ml TB sprøjte med sterilt PBS, fjerne eventuelle luftbobler. Anbring forsigtigt kateteret på spidsen af sprøjten og skubbe PBS forsigtigt selvom kateteret for at fjerne eventuelle bobler i slangen.
BEMÆRK: Når skubbe væske gennem kateteret, er det vigtigt at holde katetret på sprøjten for at forhindre fluidumtrykket i at skubbe kateteret ud af sprøjten. - Placer mus i en ren bur og varme forsigtigt under en varmelampe, indtil halevenen vises vasodilated. Bedøver musen med en blanding af rumluften og isofluran (5% induktion, 1-2% vedligeholdelse, ved 2 l / min flow rate), der leveres gennem næsekegle forsamling, der er blevet knyttet til isofluran fordamper. Sørg for, at musen er bedøvet with en blid tå knivspids. Gradvist øge isofluran flow med 0,1%, hvis der observeres bevægelse. Dæk øjnene med oftalmologiske salve for at forhindre udtørring og skade, mens musen er bedøvet.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at mus aldrig efterlades uden opsyn, mens bedøvede. Mus skal monitoreres hyppigt tilstrækkelige anæstesi ved forsigtig tå knivspids. - Immobilisere halen i bunden med et par pincet, og derefter tørre halen med en spritserviet. Skub forsigtigt kateteret i den laterale halevene og check åbenhed ved forsigtigt at skubbe på stemplet af sprøjten. Der bør ikke være nogen modstand mod bevægelse og ingen synlig bobling af PBS under huden, hvis det hensigtsmæssigt placeres. Anbringer kateteret til halen ved at anvende 1-2 dråber cyanoacrylat vævslim for injektionsstedet og lad det tørre, ca. 30 sek.
- trim forsigtigt hår fra bagsiden og siderne af øret med en saks, pas på ikke at beskadige ski. Trim knurhår så godt. Ved hjælp af en vatpind, fugte den indre overflade af øret med PBS.
- Drej musen og øre på en 24 x 50 mm No. 1.5 dækglas. Med pincet, blidt flade øret på dækglasset, bevæge musen eventuelt for at sikre, at øret flugter med glasset. Fjern overskydende PBS fra øret ved at duppe forsigtigt med en serviet tørre.
BEMÆRK: Sørg for ikke at trykke for hårdt på øret, da den tynde hud kan nemt blive beskadiget med stort tryk. - Brug to par buede pincet, gribe en cirka 20 mm lange stykke stof tape på langs på de øverste hjørner. Placer bunden af tapen på dækglasset på toppen af musens øre og rulle båndet over resten af øret, skubber overskydende hår ud af vejen med pincet eventuelt at anbringe øre til dækglasset. Tryk forsigtigt på båndet rundt om øret med en tør vatpind til at sikre en tæt forsegling, pas på ikke at trykke på selve øret.
- Fastgør billeddannende platformen til et 37 ° C varmeblok med tape. Påfør vakuum fedt på hver side af øret område af den billeddannende platformen. Drej musen til at placere dækglasset på imaging platform, idet man justere øret i centrum af filten.
BEMÆRK: Undgå at få vakuum fedt på båndet, da dette vil få det til at komme løsrevet fra glasset dækglas. - Snap isofluran næsekegle i holderen på imaging platform, der sikrer, at den Næsekeglen er sikker og helt dækker musens næse. Spred vakuum fedt under dækglasset ved fast, men forsigtigt trykke dækglasset på imaging platform med en ren, tør vatpind.
- Anbringe dækglasset til platformen med to 20 mm stykker tape og to længere stykker tape viklet omkring den øvre del af platformen. Hvis der er luftbobler mellem øret og dækglasset, kan de fjernes forsigtigt ved at trykke på øret nedefra with et stykke foldet papir.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at bruge papir, der er for tyk eller for at trykke fast, da dette kan forårsage væv blanchering og skader, komplicerer resultater. - Flyt musen til mikroskopet scenen og sikre platform med tape. Pipe et dobbelt lag af vakuum fedt på dækglasset omkring øret for at tjene som et reservoir for nedsænkning i vand mål.
- Wrap en vandfyldt varmetæppe omkring musen gennem den billeddannende platformen. Fyld beholderen med 37 ° C destilleret vand. Sikre, at alt er fastgjort til scenen med tape, og at sprøjten af kateteret er let tilgængelig.
4. In vivo Time-lapse Imaging og intravenøs Antibody Administration
BEMÆRK: Denne protokol kræver brug af en multifoton mikroskop udstyret med en Ti: Sa laser system. Målet anvendes, er en 25x forstørrelse linse med 1,05 NA, fastgjort med en genstandive varmelegeme indstillet til 40 ° C. Den optimale temperatur for denne varmelegeme blev bestemt empirisk til at være en passende temperatur for at opretholde øret dermis ved 37 ° C, og kan være nødvendigt at justere til brug i andre billedsystemer. Købet software, der bruges, kan variere mellem instrumenter og justeringer af protokollen skal måske til at fungere på en anden måde konfigurerede systemer. Sørg for, at billeder kan gemmes i et format, der er kompatibelt med enhver ønsket analyse software.
- Find dermis gennem okularerne ved at placere det mål over midten af øret og sænke målet lige indtil det kommer i kontakt med overfladen af vandet i reservoiret. Brug af en ekstern lyskilde, se gennem okularerne og fortsat langsomt sænke målet indtil overfladen af øret kommer i fokus. Sænk de indre og ydre gardiner omkring mikroskopbordet.
- Bestem mikroskop indstillinger og find et område for billeddannelse
- Før imaging, konfigurere laseren for maksimal excitation og detektion af de ønskede fluoroforer ved at justere laser bølgelængde til 900 nm i vinduet MP Laser Controller, laser magt i Acquisition Setting: Laser vinduet, og PMT spændinger i vinduet Image Acquisition Kontrol .
BEMÆRK: Denne procedure bruger en excitationsbølgelængde på 900 nm med filtre til at opdage anden harmoniske generation (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), og CMTMR (575-630 nm). Andre konfigurationer kan anvendes til at detektere forskellige fluoroforer som ønsket. - Indstil mikroskopet til 512 x 512 pixel opløsning, med en 2 mikrosekunder / pixel opholdstid i Acquisition Indstilling: Størrelse og Mode vinduer. Aktiver en live imaging tilstand for at tillade scanning gennem vævet for et område på billedet ved at klikke på "XY repeat". Ideelt set skal området være relativt ensartet, uden luftbobler, og undgå områder med tætte hårsækkene.
BEMÆRK: CFA emulsion er lyst autofluorescerende i den grønne og near-rød kanaler og bør undgås. En optimal felt kan normalt findes ca. 3 mm fra kanten af emulsionen. Ca. 10 - 100 celler kan spores i et enkelt billede. Hvis for mange celler til stede, vil tracking software generelt støder på fejl i forsøget på at separere nært beliggende celler, hvilket fører til kortere og / eller unøjagtige celle spor. - Når en passende imaging felt er blevet placeret, bestemme Z-regionen, der vil blive afbildet ved at placere celle "højeste" i dermis, indstilling af Z-position til 0 ved at klikke på knappen "Set 0", og rulle ned i Z retning for at måle omfanget af celle dybde. Et billeddannende dybde på 35-75 um er typisk. Indstil start- og slut positioner i Acquisition Indstilling: Mikroskop vindue. Juster instrumentet PMT spændinger og lasereffekt i "lyse Z" vinduet for at optimere visualisering af cellerne i hele dybden af det billeddannende område.
BEMÆRK: Undgå at hæve lasis power over 25 mW ved prøven, kan så høje effektniveauer forårsage varmeskader og sterilt skade dermis. Den passende maksimalt effektniveau for hver mikroskop vil variere og vil skulle måles. Det skal bemærkes, at stigende laser magt eller PMT spændinger med væv dybde ikke tillader kvantitativ sammenligning af billedets lysstyrke i forskellige dybder i post-erhvervelse analyse. - Check "Depth" og "Time" knapper under knappen "Scan" i vinduet Image Acquisition Control. Indstil et Kalman filter til at scanne billedet 3 gange per linje i Image Acquisition Control: Filter Tilstand vindue og justere Z-slice dybde i Image Acquisition: Mikroskop vindue, så det tager ca 1 min at fange en komplet stak, som bemærket i vinduet TimeView.
BEMÆRK: Intervallet mellem stakke bør ikke tage længere tid end ca. 1 min, da længere intervaller forhindre sporing af hurtigt migrerende celler. Afhængigt af the type celler, der afbildes, kan være nødvendigt at justere for at sikre passende celle sporing ved analyse software dette interval. Z-skiver bør ikke være mere end 5 um. Generelt 15-18 Z-skiver mellem 2-5 um tykke er passende til en 1 min billeddannelse interval.
- Før imaging, konfigurere laseren for maksimal excitation og detektion af de ønskede fluoroforer ved at justere laser bølgelængde til 900 nm i vinduet MP Laser Controller, laser magt i Acquisition Setting: Laser vinduet, og PMT spændinger i vinduet Image Acquisition Kontrol .
- Fang en pre-antistof time-lapse billede
- Fang en 5 min time-lapse billede af området for at vurdere stabiliteten af vævet ved at indstille antallet af gentagelser til "5" i Acquisition Indstilling: TimeScan vindue og klikke på knappen "Scan".
BEMÆRK: Tissue "drift" kan være forårsaget af ikke at tillade tilstrækkelig tid til øret for at nå termisk ligevægt, dårlig forberedelse øre, eller kan skyldes lokal drift i en region af øret. Hvis 5 min billede ikke er stabilt, billede en ny region i dermis. Hvis et andet billede i en ny region stadig er ustabil, er det bedst at omhyggeligt gentage forberedelse øre og billeddannelse fra trin 3.6 med en frisk coverslip. - Hvis vævet er stabil i 5 min billedet, indsamle en 30-45 min time-lapse billede ved at indstille antallet af gentagelser til mellem 30 og 45 i Acquisition Indstilling: TimeScan vindue, overvågning for enhver mindre væv afdrift som billedet er indsamlet. Gem filen i et format, der er foreneligt med analysen software, der skal anvendes.
BEMÆRK: På dette tidspunkt i protokollen, trin 4.2.2 - 4.3.2 kan gentages til billede flere steder i samme øre. En enkelt mus bør ikke holdes bedøvet i mere end 4 timer, da døden er mere tilbøjelige til at forekomme.
- Fang en 5 min time-lapse billede af området for at vurdere stabiliteten af vævet ved at indstille antallet af gentagelser til "5" i Acquisition Indstilling: TimeScan vindue og klikke på knappen "Scan".
- Injicer blokerende antistoffer og fange en post-antistof billede.
- Tegn antistoffet blandingen i en 1 ml TB sprøjte og fjern kanylen, og sørg for at fjerne alle luftbobler. Tryk på stemplet, således at antistoffet løsning danner en "dråbe" i slutningen af sprøjten.
- Løft gardinerne rundt om scenen og find kateteret. Fjern originalen PBS-contalingen sprøjte fra kateteret. Uden indstilling af kateteret ned, omhyggeligt vedhæfte den nye sprøjte indeholdende antistofferne. Hold enden af kateteret på sprøjten og sprøjt forsigtig antistof blandingen ind i kateteret. Sikre, at der ikke er nogen modstand mod injektion.
- Indstil kateteret ned og sænk gardiner omgiver mikroskopbordet. Bemærk tidspunktet for injektion og straks begynde at indsamle en ny 20-40 min imaging sekvens på samme sted med de samme instrument indstillinger som præ-antistof-billede. Gem filen i et passende format til analyse software, der skal anvendes.
BEMÆRK: Mellem time-lapse billeder, observere musen for tilstrækkelig anæstesi og vejrtrækning. Det anbefales ikke at billedet mere end ét felt efter administration af antistoffer, da der kan være variable hastigheder for clearance af antistoffet.
- Sprøjt fluorescens-mærket dextran at lokalisere blodkar, vurdere kateter åbenheden, og måle bpermeabilitet lood fartøj
- En 2 mg / ml opløsning af fluorescens-konjugeret dextran (70.000 MW) i 100 pi sterilt PBS og trække i en sprøjte, fjerne eventuelle luftbobler.
- Under anvendelse af samme teknik som i trin 4.4.1-4.4.2, læg sprøjten oven på kateteret og sprøjt dextran opløsning intravenøst.
- Fang en enkelt stak på 1024 x 1024 pixel opløsning ved at ændre opløsningen i Acquisition Setting: Tilstand vindue, med de samme PMT og laser indstillinger som for time-lapse billeder. At indsamle billedet, fjerne markeringen på knappen "Time" under knappen "Scan", og derefter klikke på knappen "Scan". Dette 3D-billede vil give mulighed for udelukkelseskriterierne T-celler placeret i karrene og viser, at kateteret var patent og isat korrekt. Diffusionen af fluorescerende dextran ud af beholderne kan også anvendes til at vurdere lokal vaskulær permeabilitet.
BEMÆRK: Denne høj opløsning (1024 x 1024) statisk billede bruges til PResentation formål og kan yderligere anvendes til analyse af vævet arkitektur i samme område som de time-lapse billeder. Alternativt kan en 512 x 512 billede tages, som kan flettes med time-lapse billeder med billedanalyse software. Time lapse billeddannelse af dextran indgivelse kan også være ønsket, afhængigt af forskningsbehov enkelte labs. I dette tilfælde bør det billede sættes op som i trin 4.2.3-4.3.2.
- Efter billeddannelse er færdig, skal du forsigtigt fjerne musen fra under målet og udpakning vandet tæppe. Fjern dækglasset fra det billeddannende platformen ved at skære tapen og forsigtigt løfte glasset, indtil det frigøres. Mens musen stadig bedøvet, frigøre øret fra dækglasset. Hvis dette skal være en terminal procedure, aflive musen ved cervikal dislokation. Hvis du gemmer denne mus til gentagen billedbehandling, returnere det til en ren bur adskilt fra andre mus og observere, indtil musen kan rette sig og erambulant. Når genvundet fra anæstesi, kan musen blive returneret til et bur med andre dyr.
- Importer de billeddannende filer i et billede analyseprogram og udføre de ønskede rettelser. Undgåelse af ikke-lineære forbedringer og automatiserede udjævning eller støj programmer og algoritmer reduktion anbefales. Typisk billeder behøver kun en mindre baggrund korrektion ved manuelt at øge det sorte punkt i billedet før analysen. Analyser billeddata ved hjælp af en automatiseret celle-sporing program med manuel korrektion, som i Overstreet, Gaylo et al 30.
BEMÆRK: Der er mange billedanalyse suiter til rådighed, både proprietære og open source, der kan bruges til at kvantificere celle dynamik fra multifotonexcitation billeder afledt af denne protokol. Den nøjagtige fremgangsmåde til billedanalyse og de optimale softwarepakker, der skal anvendes, vil afhænge af den forskning behovene i de enkelte laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til at studere immunresponser in situ uden at ændre immun miljø er afgørende i at studere realtid interaktioner af T effektorceller med en betændt væv. Imaging af de intakte øre dermis af denne protokol, skitseret i figur 1A og B, giver mulighed for visualisering af overførte fluorescensmærkede T effektor celler i huden interstitium. Dette tillader både høj opløsning (figur 1C) og time-lapse (Figur 1D, Movie 1) billeder af effektor T-celle-dynamik i de betændte dermis.
Figur 1. høj opløsning og 4D billeddannelse af T effektor celler i den intakte dermal interstitium. (A) Eksperimentel skitse. (B) Fotografi af en øre prepared til billeddannelse med webstedet af emulsionen (sort stiplet linie) og optimal område for billeddannelse (rød linje) er angivet. (C) Maksimal 3D projektion af en høj opløsning stack viser CFSE-mærkede Th1-celler (grøn), anden harmoniske signal fra fibrillært kollagen (blå) og Texas Red-Dextran mærket vaskulatur (rød). Den hvide pil angiver en af flere autofluorescerende hårsækkene. Scale søjler repræsenterer 50 um (D) migrerende stier af Th1-celler spores i 30 min i CFA-betændte dermis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Denne billedbehandling protokol kræver brug af en specialiseret imaging platform, der blev bygget i huset, samt en tilpasset næsekegle for levering af inhaleret anæstesi mens billeddannelse. Det billeddannende platform (figur 2A-B) består of en aluminium bundplade med en hævet central sektion. Dette rejste sektion har en indsat del foret med akryl følte at yde støtte til øret uden at komprimere og potentielt skadeligt for tynde væv. Geometrien af vores setup krævede opførelsen af et fleksibelt og justerbart næsekegle at levere inhaleret anæstesi under billeddannelse. Denne næsekegle, bestående af en modificeret mikrocentrifugerør forbundet til et afsnit af fleksibelt rør (figur 2C) 50 mm, er fastgjort på plads med en holder bestående af modificerede mikrocentrifugerør (figur 2D) og fastgjort til billeddannelse platform via burrelukkesystem . Anvendelsen af burrelukkesystem muliggør repositionering af næsekegle samling, således at begge ører på musen kan afbildes, og kan optimalt placeret for individuelle mus.
Figur 2. Equipment for intravital billeddannelse. Specialbyggede imaging platform i toppen (A) og (B) synspunkter side. Næsekegle for isofluran administration (C) og næsekegle holder (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Kateterisering af halevenen muliggør kontinuerlig adgang til kredsløbet for at administrere antistoffer og andre små molekyler, der kan diffundere ud af vaskulaturen, eller større fluorescerende molekyler, såsom høj molekylvægt dextran at mærke blodkar. Efter administration af 100 ug af anti-β 1 og anti-β 3 integrin blokerende antistoffer gennem kateteret, der tidligere bevægelige celler arrest inden dermis (Film 2). Disse celler har en nedsat gennemsnitlig hastighed efter antistof administration (figur 3A), samt et signifikant fald i bugtet indeks er forholdet mellem den totale forskydning til den samlede banelængde (figur 3B).
Figur 3. Indgivelse af anti-β 1 og anti-β 3-antistoffer inhiberer Th1-celler migration i CFA-betændt hud. (A) Gennemsnitlig hastighed af Th1-celler før og efter administration af 100 ug anti-β 1 og anti-β 3 integrin blokerende antistoffer. (B) Meandering indeks for Th1-celler før og efter antistof blokade. Ca. 100 sporede celler er fra billeder før og efter antistof blokade fra en enkelt mus i et repræsentativt eksperiment. Statistik fra Mann Whitney.es / ftp_upload / 53.585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Fordi håret ikke er fjernet fra overfladen af øret, imaging artefakter fra håret er almindelige. Autofluorescens fra hårsækkene (Figur 4A) og shadowing og autofluorescens fra overliggende hår (figur 4B) bør så vidt muligt undgås, da de kan skjule T-celler og forstyrre automatiseret billedanalyse software. Tilsvarende kan luftbobler fanget mellem øret overflade og dækglasset føre til billedbehandling artefakter (figur 4C). Korrekt forberedelse af øret bør minimere antallet og størrelsen af eventuelle resterende bobler.
Figur 4. Fælles artefakter fra hår autofluorescens og dårlig øre preparation. (A) autofluorescerende hårsækkene. (B) autofluorescerende hår og hårsække (grøn) og kollagen (hvid) med overliggende hår skygger, der forårsager mørke linier i billedet. (C) Artifact fra en luftboble, der viser kanten af fordrevne, autofluorescensproteiner keratiniserede epidermis (stiplet linje). Scale søjler repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Derudover kan brugen af flere varmekilder føre til problemer med stabiliteten af væv på grund af termisk udvidelse og sammentrækning. Forkerte termostatindstillinger, for eksempel, kan føre til store svingninger under billedbehandling, der kan gøre fortolkningen af resultaterne vanskelige (Film 3). Det er vigtigt at bestemme de optimale indstillinger for ethvert system, der giver en konstant temperatur og maksimerer stabilitet. ultimately, et temperaturstyret imaging kammer er den bedste måde at fjerne variabilitet fra ændringer i temperaturen.
Movie 1. Th1 celler migrerer i CFA-betændte dermis (Højreklik for at downloade). 30 min time-lapse billede, der viser Th1-celler (grøn) migrerer i dermal kollagen netværket (anden harmoniske generation, blå).
Movie 2. Th1 celler anholdelse ved blokade af β 1 og p 3 integriner (højreklik for at downloade). Cells (grøn) blev afbildet i 30 min før Administration af blokerende antistoffer, og derefter afbildes i yderligere 20 minutter på samme sted.
Movie 3. Svingninger fra en dårligt kontrolleret varmeplade (Højreklik for at downloade). 30 min time-lapse billede af Th1-celler (grøn) og anden harmoniske generation (blå). Efter dette billede blev opsamlet, blev varmepladen anvendes sig at have en defekt termostat, forårsager svingninger i temperaturen af den billeddannende platformen og efterfølgende termisk udvidelse og sammentrækning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydning
Her præsenterer vi en komplet protokol for 4D visualisering af overførte, antigen-specifikke effektor Th1 celler i de intakte mus øre dermis. Denne metode giver fordele i forhold til nogle aktuelle billeddiagnostiske modaliteter af flere grunde. Ved billeddannelse de ventrale øre dermis, er vi i stand til at give afkald hårfjerning, der er nødvendig for imaging-protokoller, der involverer andre hud sites. Selvom hårfjerningsmidler er generelt milde, har de vist sig at forårsage forstyrrelser i hudens barriere 42, en proces, der kan stimulere et immunrespons 43,44. Ved også at undgå invasive kirurgiske procedurer til at afsløre dermis eller hypodermis, denne protokol forhindrer skader-induceret inflammation og den hurtige rekruttering af neutrofiler 37 og andre immunceller i dermis. Anvendelsen af en venekateter i dette system til at levere blokerende antistoffer mod nøglemolekyler muliggør tidstro søgning i dynamic opførsel af CD4 T-celler. Brugen af denne imaging protokol har afsløret kritiske krav til CD4 T-celle interstitiel motilitet 30, som ikke blev påvist i in vitro systemer 8.
Kritiske trin i proceduren
Et væsentligt skridt i enhver imaging protokol er at sikre et stabilt væv forberedelse til billedbehandling. Det er vigtigt at sikre, at der er tilstrækkelig PBS mellem øret og dækglasset at der ikke er luftbobler og øret er i kontakt med glasset, men ikke så meget, at de bringer tapen til at blive de-klæbet fra glasset. Tilsvarende undgå kontakt mellem båndet holder dækglasset til platformen, og enhver vakuum fedt vil forhindre tapen i at løsne sig med tiden. Temperaturen skal også holdes konstant for at undgå svingninger og glider fra termisk sammentrækning eller udvidelse af platformens materialer.
Begrænsninger og Ændringer
45. Men den residente immun øret er forskellig fra huden på flanken eller trædepuden 46, og musen øre har forskellige vaskulære egenskaber sammenlignet med andre steder 47. Således til nogle anvendelser, kan sammenligning af øret billeddata til andre hudområder være svært.
Denne protokol kræver også den effektive migration af overførte T effektor celler ud af blodet og ind i dermis. Dette begrænser muligheden for at bruge celler, der har fejl i homing eller ekstravasation, da de ikke vil være i stand til at komme ind i interstitielle rum. ekstravasationkan omgås ved at injicere celler direkte ind i øret dermis 37,48, selv om dette vil medføre nogle mekaniske skader og levering af celler på denne måde kan kun gentages lokaliseringen eller opførsel af celler, der undergår in vivo ekstravasation.
Det er også afgørende at overveje at bruge ikke-pigmenterede recipientmus for billeddannelse eksperimenter, såsom BALB / c-stamme bruges her eller Albino C57BL / 6- Tyr c-2J-mus. Melanin i pigmenterede mus, ud over at være yderst autofluorescerende, opvarmer under selv relativt energibesparende excitation fra en multifoton laser 37. Dette kan forårsage termiske skader på huden og efterfølgende betændelse 36 eller fluorescerende speckling 31, komplicerer resultater. Dette kan begrænse fluoroforer, der kan anvendes i en multi-parameter imaging eksperiment. Dog kan nogle meget lyse eller meget udtrykte fluorescerende molekyler effektivt ophidset ved lav lasereffekt, allegrund for effektiv visualisering i pigmenterede mus.
Fremtidige anvendelser
Da dette er en ikke-invasiv procedure, kunne det let tilpasses til langsgående undersøgelser af mus med sekventiel billeddannelse over lange tidsrum. Mens fluorescerende mærkning, som beskrevet her, vil blegne med perioder på mere end 3-4 dage, brug af endogent fluorescerende celler eller fluorescerende reporter celler eliminerer dette problem. Faktisk har vi tidligere brugt denne protokol til at spore i vivo- genererede antigen-specifikke effektorer bærer cytokine reportere, herunder IFNy reporter Yeti 30,49 og IL-4 reporter 4get 50. Vi har desuden visualiseret endogene CD4-celler i CD4-Cre ROSA26-stop-floxet EYFP fluorescerende reporter mus 30. Som de fluorescerende egenskaber af EYFP og andre fluorescerende proteiner forskellige fra kemiske farvestoffer, såsom CFSE, kan der være behov modifikationer billeddannelsesparametrenetil effektiv visualisering. Ændringer såsom at øge pixel opholdstid kan forbedre fluorescerende signal af nogle dunkle fluoroforer, og mindske længden af tid bortfalder billeder kan afbøde eventuelle fotoblegning, der kan observeres. Ved 900 nm excitation, har vi ikke tidligere observeret betydelig fotoblegning af CFSE, CMTMR eller EYFP over korte imaging intervaller.
Selv om denne procedure fokuserer på måling af dynamikken i CD4 effektor T cellemotilitet, er den ikke begrænset til denne anvendelse. Der pågår arbejde at måle den dynamiske interaktion af effektor T-celler med antigen-præsenterende celler ved anvendelse af fluorescerende reporter mus og injektion af fluorescens konjugerede antistoffer i dermis til at mærke celler eller vævsstrukturer før billeddannelse 51,52. Og mens denne protokol demonstrerer brugen af kateteret til at levere blokerende antistoffer, mens billeddannelse, andre forbindelser, herunder småmolekylære inhibitorer, kanadministreres. I sidste ende, denne protokol giver en fleksibel platform til at måle immun dynamik over tid, in vivo, i en ikke-invasiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker University of Rochester multifotonexcitation Microscope Core facilitet for hjælp til direkte billedvisning. Støttet af NIH AI072690 og AI02851 til DJF; AI114036 til AG og AI089079 til MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
