Summary
De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.
Abstract
Het vermogen van CD4 T-cellen om effectorfuncties uitvoeren is afhankelijk van de snelle en efficiënte migratie van deze cellen in ontstoken perifere weefsels door middel van een vooralsnog ongedefinieerde mechanisme. De toepassing van multifoton microscopie voor de studie van het immuunsysteem een werktuig om de dynamiek van immuunresponsen in intacte weefsels te meten. Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beeldvorming van intravitale multifoton CD4 T-cellen in de ontstoken muisoor dermis. Gebruik van een aangepaste imaging platform en een veneuze katheter maakt de visualisatie van CD4 T-cel dynamica in de huid interstitium, met de mogelijkheid om deze cellen in real-time uitlezen via de toevoeging van blokkerende antilichamen tegen belangrijke moleculaire componenten betrokken bij motiliteit. Dit biedt voordelen ten opzichte van in vitro modellen en chirurgisch invasieve beeldvorming procedures. Het begrijpen van de paden die worden gebruikt door CD4 T-cellen voor de beweeglijkheid kan uiteindelijk geven inzicht in de basic functie van CD4 T-cellen en de pathogenese van zowel auto-immuunziekten en pathologie van chronische infecties.
Protocol
Alle procedures waarbij muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Rochester, en in strikte overeenstemming met de Animal Welfare Act en de Public Health Service Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren beheerd door de National Institutes uitgevoerd van Volksgezondheid, Office of Laboratory Animal Welfare.
1. Bereiding van effector CD4 T-cellen
LET OP: BALB / c TCR-transgene DO11.10 muizen die specifiek een peptide uit kippenei ovalbumine (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR) herkennen. Andere TCR-transgene systemen kunnen worden vervangen, met de juiste verwante peptide in plaats van Pova waar aangegeven.
- Zuiver naïeve CD4 T-cellen
- Euthanaseren 6-8 weken oude vrouwelijke DO11.10 BALB / c muizen door blootstelling aan 2 L / min CO 2 totdat de muis wijst erop dat beweging of ademhaling gedurende 1 min, gevolgd door cervicale dislocatie, of volgens derichtlijnen van de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite. Spuit de muis met een 70% ethanol-oplossing en maak ongeveer 7 cm incisie in de huid van de kin van de muis om 2/3 van de weg naar beneden de buik. Voeg 2-3 cm incisies vanaf het einde van de incisie in de buik naar de achterpoten. Wees voorzichtig niet in het buikvlies te snijden.
- Zorgvuldig scheiden de huid van het buikvlies door voorzichtig te trekken met een pincet. De inguinale lymfeknopen bevinden zich op de huid nabij de kruising van de achterpoten met het lichaam. Pak hiertoe en trekken met een pincet en plaats in 8 ml HBSS aangevuld met 2% serum van pasgeboren kalveren (NCS).
- Oogst de oksel en arm lymfeklieren van de muis door vast te pakken en voorzichtig te trekken met een pincet. Plaats de HBSS + 2% NCS de inguinale lymfeknopen.
- Oogst de diepe en oppervlakkige cervicale lymfeknopen in de hals van de muis met een tang en plaats in HBSS + 2% NCS de othaar lymfeklieren.
- Voorzichtig gesneden in het buikvlies, de zorg niet in de darmen te snijden. Pak de blindedarm en dikke darm met een pincet en bloot de mesenterische lymfeklieren die zich net langs de dikke darm. Haal de mesenterische lymfeklieren met een pincet en plaats met de andere lymfeklieren.
- Zoek de milt in de peritoneale holte en verwijder het, houden met een pincet en snijden het bindweefsel veranderen met een paar chirurgische schaar. Plaats de milt met de lymfeknopen.
- Bereid een enkele celsuspensie door overgieten HBSS + 2% NCS bevat de milt en lymfeklieren in een metalen zeef in een 60 x 15 mm kweekschaal. Voorzichtig wrijf de milt en lymfeknopen door de metalen zeef met de plunjer van een 10 ml spuit in de HBSS + 2% NCS.
- Met behulp van een pipet, zet de celsuspensie in een schone 50 ml centrifugebuis. Spoel de metalen zeef en cultuur schotel met een extra 10 ml van HBSS + 2% NCS, uzing een pipet, en plaats deze oplossing in dezelfde 50 ml centrifugebuis de celsuspensie.
- Spin de cellen bij 600 g gedurende 5 minuten om de cellen en resuspendeer pellet in 10 ml HBSS + 2% NCS door voorzichtig pipetteren. Tenzij anders aangegeven, moeten alle centrifugatie worden uitgevoerd bij 600 g gedurende 5 min.
- Verdun 10 ul van de celsuspensie in 90 pi 0,1% trypan blauw in PBS gedurende een 1:10 verdunning. Plaats 10 gl van de cellen in trypan blauw op een hemocytometer pipetteren de oplossing in de groef aan de rand van de hemocytometer. Tel de witte bloedcellen in het midden van het raster hemocytometer negeren erytrocyten die als iets kleiner lijken, round, rode-hued cellen en de dode blauw / stervende cellen. Vermenigvuldig het aantal cellen geteld met 10 4, met de verdunningsfactor (10), en door het volume van de cellen (10 ml) tot het totale aantal cellen verzameld in de 50 ml centrifugebuis bepalen.
- Te verrijken CD4 T-cellen gecentrifugeerdcellen tot pellet en resuspendeer de cellen op 2x10 7 cellen / ml in een oplossing die ongeveer 1 ug / ml anti-CD8 (kloon 3,155), 1 ug / ml anti-MHC klasse II (kloon M5 / 114) en 1 ug / ml anti-CD24 (kloon J11d) antilichamen in HBSS + 2% NCS door voorzichtig pipetteren.
OPMERKING: De antilichamen die in deze stap worden verkregen in-huis uit hybridoma cellijnen en concentraties worden benaderd. De concentratie en het volume van deze antilichamen ideaal voor complement lysis werd empirisch bepaald en zal variëren tussen laboratoria. Tevens verschillende in de handel verkrijgbare kits beschikbaar voor het zuiveren van naïeve CD4 T-cellen en kunnen worden vervangen door de complement lysis en CD62L + zuiveringsproces vertegenwoordigd. Bij gebruik van een andere methode om naïeve CD4 T-cellen te zuiveren, kan dit protocol worden voortgezet vanaf stap 1.2. - Incubeer op ijs gedurende 30 min. Aan het einde van deze incubatie snel ontdooien cavia complement door in een 37 ° C water bath ongeveer 2 min. Voeg 100 ul van complement voor elke 1 ml van cellen in de antilichaamoplossing pipetteren het complement direct in de celsuspensie. Incubeer cellen in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
- Voeg HBSS + 2% NCS aan de cellen tot een totaal volume van 20 ml in de centrifugebuis brengen. Laag in 8 ml RT dichtheidscentrifugatie medium (dichtheid 1,086 g / ml) onder de cellen. Onmiddellijk Centrifugeer de cellen bij 1400 xg bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met de rem van centrifuge.
- Verzamel cellen aan het grensvlak met behulp van een serologische pipet overgebracht cellen om een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Was de cellen door aanpassing van de hoeveelheid in de centrifugebuis 50 ml met HBSS + 2% NCS en centrifugeren.
- Resuspendeer de cellen in MACS buffer (PBS aangevuld met 2% NCS en 2 mM EDTA) door zachtjes te pipetteren en tellen als eerder, in stap 1.1.10.
- Te verrijken naïeve CD4 T-cellen, resuspendeer de cellen op 2x10 7 cellen / ml in een oplossingvan 2,5 ug / ml biotine-geconjugeerd anti-CD62L-antilichaam in MACS buffer, gebaseerd op het aantal getelde in stap 1.1.16. Incubeer gedurende 30 min op ijs.
- Was de cellen door toevoeging van 10 ml MACS-buffer en vervolgens centrifugeren van de cellen. Resuspendeer de cellen bij 10 7 cellen / 100 gl in MACS buffer en voeg streptavidine geconjugeerde magnetische scheiding bolletjes op een 1:10 verdunning direct naar de cellen. Incubeer op ijs gedurende 20 min.
- Was de cellen zoals eerder, in stap 1.1.17 en resuspendeer de cellen op 2x10 8 cellen / ml in MACS buffer, in een minimaal volume van 500 pl.
- Plaats een magnetische scheiding kolom in de magneet houder en spoel de kolom door te laten 3 ml MACS-buffer doorstromen. Breng de cellen aan de kolom met een pipet.
- Was de kolom met cellen die niet door de magnetische kolom gebonden verwijderen pipetteren 3 ml MACS buffer op de kolom en waardoor de MACS buffer doorstromen en herhaal 3 maal. Gooi de stroom door fractie.
- afneeme de kolom uit het magnetische stand houdt op een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Pipetteer 5 ml MACS buffer op de kolom en gebruik de plunjer omsloten met de kolom te duwen de MACS buffer door de kolom aan de kolom gebonden cellen los en laat de stroom door de verrijkte naïeve CD4 T-cellen bevat.
- Centrifugeer de cellen en resuspendeer in 10 ml RPMI aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 50 pM 2-mercaptoethanol (RPMI-10). Tel de cellen zoals eerder, in stap 1.1.10.
- Stel de eindconcentratie van de naïeve CD4 T-cellen om 5 6x10 / ml in RPMI-10.
- Zuiver T-cel depletie milt APC's
- Euthanaseren een 6-8 weken oude vrouwelijke wild-type BALB / c-muis als in stap 1.1.1.
- Spuit de muis met een 70% ethanoloplossing en bloot de milt door een ongeveer 3 cm incisie aan de linkerkant van abdome de muisn. Opengesneden de peritoneale af en verwijder de milt door voorzichtig met een pincet vast te pakken en snijden van het onderliggende bindweefsel met een chirurgische schaar.
- Plaats de milt in 8 ml HBSS + 2% NCS.
- Bereid een enkele celsuspensie door stampen de milt, wassen en tel de cellen, zoals eerder, in stappen 1.1.7-1.1.10
- Afbrekende T cellen door het draaien van de cellen bij 600 g gedurende 5 minuten tot pellet en resuspendeer de cellen op 2x10 7 in een oplossing van ongeveer 1 ug / ml anti-Thy1.2 antilichaam (kloon J1J) door voorzichtig pipetteren. Incubeer de cellen op ijs gedurende 30 min.
LET OP: Dit antilichaam was afgeleid in-huis van een hybridoma cellijn en de concentraton wordt benaderd. De concentratie en het volume van dit antilichaam ideaal voor complement lysis werd empirisch bepaald en zal variëren tussen laboratoria. Andere werkwijzen voor het zuiveren van APC splenocyten kan desgewenst worden vervangen. Naïeve T-cellen en APC's moet worden voorbereid op culture van stap 1,3. - Voeg cavia complement, broeden, en scheiden de cellen op een dichtheid centrifugeren media gradiënt als voorheen, in stappen 1.1.13-1.1.14.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml RPMI-10 en het bestralen APCs door het plaatsen van de cellen in een 50 ml centrifugebuis in een gamma bestraler voor een tijdsduur dat de cellen blootgesteld aan 25 Gy straling. Deze lengte van tijd zal variëren op basis van de stralingapparaat en zal moeten worden berekend telkens als cellen worden bestraald.
- Tel de cellen op een hemocytometer als voorheen, in stap 1.1.10 en pas de APC cellen tot een uiteindelijke concentratie van 2.4x10 6 cellen / ml in RPMI-10.
- Stimuleer cellen en CD4 T-cellen differentiëren tot een Th1-fenotype in een 5-daagse kweek.
Opmerking Hoewel wij hier presenteren een protocol voor het bereiden en het afbeelden Th1 effectoren gegenereerd uit naïeve CD4 T-cellen, kan dit protocol worden aangepast aan de naïeve cellen differentiëren naar een ander fenotype of to andere typen cellen, zoals CD8 T-cellen. Voorwaarden voor priming en differentiatie moet empirisch worden bepaald.- In elk putje van een 24 putjes kweekplaat, combineer 500 gl van de naïeve CD4 T-cellen en 500 ui van het bestraalde APC in elk putje, voor een totaal van 3x10 5 T-cellen en APCs 1.2x10 6 per putje.
- Bereid een oplossing in RPMI-10 met 2 uM cognate OVA peptide, 20 U / ml recombinant IL-2, 80 ug / ml anti-IL-4 (kloon 11B11) en 40 ng / ml recombinant IL-12 en het filter met een 0,2 urn spuitfilter. 1 ml van deze oplossing toegevoegd aan elk putje van cellen, voor een totaal volume van 2 ml in elk putje.
- Incubeer de cellen in een 37 ° C incubator bij 5% CO2 gedurende 3 dagen.
- Op dag 3, splitsen de kweken door voorzichtig pipetteren om cellen opnieuw te suspenderen en 1 ml verplaatsen van elk putje in een nieuwe kweekputje. Breng elk putje tot een eindvolume van 2 ml door toevoeging van 1 ml / putje van RPMI-10 + 20 U / ml recombinant IL-2. </ Li>
- Zet de platen in de incubator en laat de cellen groeien tot 5 dagen.
2. Overdracht van cellen en inductie van de ontsteking
OPMERKING: Voor optimale celaantallen voor beeldvorming moet 5x10 6 fluorescent gelabelde Th1 cellen worden overgebracht naar elke muis in een totaal volume van 200 pl PBS. Cellen hier gelabeld met de groene kleurstof CFSE of bijna-rode kleurstof CMTMR, alhoewel andere cel tracker kleurstoffen kunnen worden gebruikt. CFSE en CMTMR-gelabelde cellen samen worden overgedragen om voor het volgen van twee verschillende effector CD4 populaties.
- Label effector T-cellen met CFSE
- Oogst de cellen van de kweekschalen door krachtig pipetteren de cellen in elk putje en het overbrengen naar een steriele 50 ml centrifugebuis met een pipet. Tel de cellen als in stap 1.1.10, centrifugeer en resuspendeer de cellen bij 10 7 cellen / ml in PBS + 5% NCS.
- Verdun 5 mM voorraad CFSE oplossing 1: 100 inPBS. Voeg 110 ul CFSE oplossing bij 1 ml cellen door een druppel CFSE oplossing aan de zijde van de buis en vervolgens snel schommelen van de buis heen en weer grondig mengen.
- Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, onder afkoelen de CFSE door toevoeging van 5 ml foetaal kalfsserum (FCS) direct naar buis cellen. Breng het volume op 50 ml met PBS + 5% NCS.
- Centrifugeer de cellen en resuspendeer de pellet in 20 ml PBS + 5% NCS. Herhaal dit proces nog twee keer aan de cellen 3 keer in totaal wassen. Tel de cellen op een hemocytometer, zoals eerder, in stap 1.1.10 en resuspendeer de cellen in steriel PBS bij 2,5 x 10 7 cellen / ml voor overdracht naar muizen.
- Label effector T-cellen met CMTMR
- Oogst de cellen zoals beschreven in stap 2.1.1, tel dan gecentrifugeerd en resuspendeer de cellen bij 10 7 cellen / ml in RPMI-10.
- Voeg 10 mM voorraadoplossing CMTMR direct naar cellen voor een eindconcentratie van 10 uM. Snel pipet the cellen grondig te mengen in de CMTMR en precipitatie van de kleurstof te voorkomen.
- Incubeer 30 min in een 37 ° C waterbad. Was de cellen 3x in PBS + 5% NCS als hiervoor, in stap 2.1.3-2.1.4. Tel en resuspendeer de cellen in steriel PBS bij 7 2,5x10 cellen / ml voor overdracht naar muizen.
- Transfer effector T cellen naïeve 6-8 weken oude vrouwelijke BALB / c muizen.
- Teken de celsuspensie (stap 2.1.4 of 2.2.3) in een spuit, en zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen door de spuit naald side-up, voorzichtig flicking de zijkant van de spuit en de zuiger op en neer bewegen, indien nodig .
- Plaats muizen in een schone kooi en warmte zachtjes onder een warmtelamp totdat de staartader verschijnt vasodilated. Plaats de muis in een straatverbod apparaat en veeg de staart met een alcoholdoekje. Injecteer langzaam 200 ul van de celsuspensie in de laterale staartader. Er mag geen weerstand tegen injectie of toegankelijk borrelen onder de huid.
- Dermale ontsteking induceren door immunisatie met complete Freund's adjuvans (CFA)
LET OP: In dit protocol wordt een ontsteking veroorzaakt door intradermale injectie van CFA geëmulgeerd met ofwel verwant of niet-verwant antigeen. Andere inflammatoire modellen kunnen worden gesubstitueerd, hoewel het aantal cellen nodig voor overdracht en de timing van de beeldvorming moet empirisch worden aangepast.- Bereid een 200 uM oplossing van OVA peptide in steriele PBS in een microcentrifugebuis. Pipetteer een equivalent volume CFA bovenop de peptideoplossing.
- Emulgeren van de oplossing door het tekenen in een 28 G1 / 2 insulinespuit en stort de oplossing terug in de microcentrifugebuis vervolgens herhalen van deze handeling ongeveer 20 maal. Wanneer deze volledig geëmulgeerd zal het CFA en peptideoplossing een dikke en opake mengsel.
NB: het is noodzakelijk om een vaste naald insulinespuit gebruikt om de emulsie te vormen, zoals de emulsie verloren in de dode ruimte in een afwrijfbare needle spuit. - Test de emulsie door het droppen van een kleine hoeveelheid op het water geplaatst in een petrischaal. De emulsie moet intact blijven en niet verspreiden in het water.
- Teken de emulsie in een 300 ul 28 G1 / 2 insulinespuit en druk sterk gedaald op de zuiger om grote luchtbellen te verwijderen.
- Onmiddellijk na de overdracht van fluorescent gelabelde effector T-cellen, de muizen verdoven door ip injectie van 2,2,2-tribroomethanol bij 240 mg / kg. Beoordelen van verdoving door een zachte teen knijpen, het toedienen van meer 2,2,2-tribroomethanol in stappen van 1 mg, indien nodig.
LET OP: andere erkende anesthetica kan worden vervangen door de 2,2,2-tribroomethanol. - Plaats een huls aan de linker wijsvinger en voorzichtig grijpen oor van de muis tussen de linker duim en wijsvinger de ventrale oor naar boven. Controleer excessieve druk uitoefenen op het oor, die mechanische schade aan de huid veroorzaken.
- Schuif de naald met de CFA emulsion in de dermis, schuine kant naar boven, en injecteer langzaam 10 ul van de emulsie in het oor. Plaatsing van de injectie moet in de buitenste 1/3 van de oorschelp, enigszins excentrisch om optimale beeldvorming.
- Monitor muizen totdat de verdoving is uitgewerkt en muizen zijn in staat om zich rechts en zijn ambulante. Afbeelding muizen 3 dagen na immunisatie, waardoor de tijd voor ontsteking te ontwikkelen en de overgedragen T-cellen om verkeer naar het oor dermis.
LET OP: Muizen kunnen niet onbeheerd worden achtergelaten op elk moment tijdens het onder narcose.
3. Voorbereiding van de Mouse for Imaging
- Bereid een katheter
- Haal de metalen naald uit een 30 G1 / 2 tuberculine (TB) injectienaald met een tang en reinig het overtollige lijm, met behulp van een dissectie ruimte om te visualiseren dat de lijm volledig verwijderd.
- Snijd de tip van een andere 30 G1 / 2 TB injectienaald, ervoor te zorgen dat de resterende naald is nog steeds patent door visuele inspectie. Slip een 18 cm stuk PE-10 buis op de medische naald bijgesneden en plaats voorzichtig het onbedekte metaal naald ongeveer 5 mm in het andere uiteinde van de buis, waardoor een katheter.
- Spoel de katheter door het invullen van een 1 ml TB spuit met steriel PBS, het verwijderen van eventuele luchtbellen. Plaats voorzichtig de catheter op de punt van de spuit en druk PBS voorzichtig hoewel de katheter om eventuele luchtbellen in de slang te verwijderen.
Opmerking: bij het duwen vloeistof door de katheter, is het essentieel om de katheter te houden op de spuit te voorkomen fluïdumdruk van het indrukken van de katheter af van de injectiespuit. - Plaats muizen in een schone kooi en warmte zachtjes onder een warmtelamp totdat de staartader verschijnt vasodilated. Verdoven de muis met een mengsel van kamerlucht en isofluraan (5% inductie, 1-2% onderhoud, bij 2 l / min debiet), afgegeven door de neuskegel samenstel dat wordt gehecht aan de isofluraan vaporizer. Zorg ervoor dat de muis is verdoofd with een zachte teen knijpen. Stapsgewijs verhogen van de isofluraan debiet met 0,1% als beweging wordt waargenomen. Bedek de ogen met oogzalf om uitdroging en schade te voorkomen, terwijl de muis is verdoofd.
LET OP: Het is essentieel dat de muizen nooit onbeheerd achter tijdens narcose worden achtergelaten. Muizen moeten regelmatig worden gecontroleerd op voldoende verdoving door zachte teen knijpen. - Immobiliseer de staart aan de basis met een pincet, en veeg de staart met een alcoholdoekje. Schuif de katheter in de laterale staartader en laat doorgankelijkheid door zachtjes te duwen op de zuiger van de spuit. Er mag geen weerstand tegen beweging en geen zichtbare borrelen van PBS onder de huid als het goed is geplaatst. Bevestig de katheter aan de staart door toepassing 1-2 druppels cyanoacrylaat weefsellijm de injectieplaats en laten drogen, circa 30 sec.
- Zorgvuldig knippen van het haar van de achterkant en de zijkanten van het oor met een schaar, het verzorgen van de sk niet beschadigtin. Knip de snorharen ook. Met een wattenstaafje, bevochtigen het binnenoppervlak van het oor met PBS.
- Draai de muis en oor op een 24 x 50 mm No. 1.5 glazen afdekplaat slip. Met behulp van pincet voorzichtig plat het oor op het dekglas, de muis zo nodig opdat het oor gelijk ligt met het glas. Verwijder overtollige PBS uit het oor door zachtjes te deppen met een tissue af te vegen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat ook stevig niet te drukken op het oor, zoals de dunne huid gemakkelijk kan worden beschadigd met te hoge druk. - Met behulp van twee paar gebogen pincet, pak een ongeveer 20 mm lang stuk stof tape in de lengte op de bovenste hoeken. Plaats de onderzijde van de band op het dekglaasje boven in het oor van de muis en rol de tape over de rest van het oor, waardoor overtollig haar uit de weg met de tang indien nodig het oor om het dekglaasje aanbrengen. Druk voorzichtig op de band rond het oor met een droog wattenstaafje om een goede afdichting te garanderen, zorg ervoor dat u druk op het oor zelf.
- Bevestig de imaging platform om een 37 ° C verwarmen blok met plakband. Toepassen vacuüm vet aan weerszijden van het oor gebied van de imaging platform. Draai de muis om het dekglaasje te plaatsen op de imaging platform, zorg ervoor dat het oor te lijnen in het midden van het vilt.
LET OP: Zorg dat er geen vacuüm vet op de band, omdat dit zal leiden tot het komen los van de glazen afdekplaat slip. - Klik de isofluraan neuskegel in de houder van de imaging platform, ervoor te zorgen dat de neuskegel is veilig en volledig bedekken de neus van de muis. Verspreid het vacuüm vet onder de dekglaasje door stevig maar voorzichtig op de imaging platform te drukken op de dekglaasje met een schoon, droog wattenstaafje.
- Bevestig het dekglaasje op het platform met twee 20 mm stukken tape en twee langere stukken tape rond het bovenste gedeelte van het platform. Eventuele luchtbellen tussen het oor en het dekglaasje zijn, kunnen ze voorzichtig worden verwijderd door op het oor van onderen with een stuk van gevouwen papier.
NB: Het is belangrijk niet te papier dat te dik of stevig druk te gebruiken, omdat dit kan leiden tot weefsel blancheren en schade, complicerende resultaten. - Beweeg de muis om de microscoop podium en zet het platform met plakband. Spuit een dubbele laag vacuüm vet op het dekglaasje rond het oor te dienen als een reservoir voor het water immersie objectief.
- Wikkel een met water gevulde verwarming deken rond de muis door de imaging platform. Vul het reservoir met 37 ° C gedestilleerd water. Zorgen dat alles is bevestigd aan het podium met plakband en de spuit van de katheter gemakkelijk toegankelijk.
4. In vivo Time-lapse Imaging en Intraveneuze Antibody Administration
Let op: dit protocol vereist het gebruik van een multiphoton microscoop uitgerust met een Ti: Sa lasersysteem. Het doel wordt gebruikt is een 25x vergroting lens met 1,05 NA, aangebracht met een objective verwarmer ingesteld op 40 ° C. De optimale temperatuur voor de verwarming werd empirisch bepaald om de geschikte temperatuur om het oor dermis bij 37 ° C te handhaven, en moet worden aangepast voor gebruik in andere beeldvormingssystemen. De acquisitie software die gebruikt kan variëren tussen de instrumenten en aanpassingen van het protocol kan moeten worden gemaakt om te werken anders geconfigureerde systemen. Zorg ervoor dat de beelden in een formaat dat compatibel is met elke gewenste analyse software kan worden opgeslagen.
- Zoek de lederhuid door de oculairs door het zo objectief boven het midden van het oor en het doel verlaging slechts totdat deze het oppervlak van het water in het reservoir. Een externe lichtbron, kijk door de oculairs en blijven het doel langzaam laten zakken tot het oppervlak van het oor is scherpgesteld. Verlaag de binnenste en buitenste gordijnen rond de microscoop podium.
- Bepaal microscoop instellingen en zoek een ruimte voor imaging
- voordat Imaging, configureert de laser voor maximale excitatie en detectie van de gewenste fluoroforen door aanpassing van de lasergolflengte 900 nm in het venster MP laserbesturing, het laservermogen in de Verwerving Omgeving: Laser venster en de PMT voltages in de Image Acquisition Controlevenster .
OPMERKING: Deze procedure maakt gebruik van een excitatie golflengte van 900 nm met filters om de tweede harmonische generatie (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), en CMTMR (575-630 nm) op te sporen. Andere configuraties kunnen worden gebruikt om verschillende fluoroforen detecteren gewenst. - Stel de microscoop tot 512 x 512 pixel resolutie, met een 2 psec / pixel verblijftijd in de Acquisitie Omgeving: Size en Mode ramen. Activeer een live-imaging-modus om het scannen door het weefsel voor een gebied op de foto staan door te klikken op "XY herhalen". Idealiter moet het gebied relatief uniform zijn, zonder luchtbellen, en het vermijden van dichte gebieden haarfollikels.
LET OP: De CFA emulsie is helder autofluorescente in de groene en near-rode kanalen en moet worden vermeden. Een optimale veld staat meestal ongeveer 3 mm van de rand van de emulsie. Ongeveer 10-100 cellen kunnen worden bijgehouden in een enkel beeld. Als er te veel cellen aanwezig zijn, zal tracking-software in het algemeen fouten optreden in een poging om dicht in de buurt cellen te scheiden, wat leidt tot een kortere en / of onjuiste cel tracks. - Zodra een geschikte imaging gebied is gelegen, bepalen de Z regio die wordt afgebeeld door het lokaliseren van de cel 'hoogste' in de dermis, het instellen van de Z-positie op 0 door te klikken op de knop "Set 0", en naar beneden te scrollen in de Z richting gemeten hoogte van celdiepte. Een beeldvormende diepte van 35-75 urn is typisch. Stel de begin- en eindposities in de Acquisitie Omgeving: Microscope venster. Stel het instrument PMT voltages en laservermogen in het venster "heldere Z" naar visualisatie van de cellen te optimaliseren gehele diepte van het beeldveld.
LET OP: Vermijd het verhogen van de laser macht boven 25 mW bij het monster, kan zo hoog zijn vermogensniveaus schade warmte en steriele letsel aan de dermis veroorzaken. De geschikte maximale vermogensniveau voor elke microscoop variëren en te meten zal. Opgemerkt wordt dat het vergroten laservermogen of PMT voltages met weefseldiepte staat geen kwantitatieve vergelijking van beeldhelderheid op verschillende diepten in post-acquisitie analyse. - Controleer de "diepte" en "Time" knoppen onder de knop "Scannen" in de Image Acquisition Controle venster. Stel een Kalman filter om het beeld te scannen 3 keer per regel in de Image Acquisition controle: Filter Mode venster en stel de Z-slice diepte in de Image Acquisition: Microscope venster, zodat het duurt ongeveer 1 min tot een complete stack vast te leggen, zoals gezegd in het venster TimeView.
Opmerking: Het interval tussen stapels mag niet langer dan ongeveer 1 minuut, zoals langere intervallen voorkomen volgen van snel migrerende cellen. Afhankelijk the celtypen te beelden, moet dit interval worden gecorrigeerd voor de juiste cell tracking door analysesoftware. Z-slices mag niet meer dan 5 micrometer. Over het algemeen 15-18 Z-schijfjes tussen 2-5 urn dik zijn geschikt voor een 1 min beeldvorming interval.
- voordat Imaging, configureert de laser voor maximale excitatie en detectie van de gewenste fluoroforen door aanpassing van de lasergolflengte 900 nm in het venster MP laserbesturing, het laservermogen in de Verwerving Omgeving: Laser venster en de PMT voltages in de Image Acquisition Controlevenster .
- Leg het beeld van een pre-antilichaam time-lapse
- Het veroveren van een 5 min time-lapse beeld van het gebied om de stabiliteit van het weefsel te beoordelen door het instellen van het aantal herhalingen op "5" in het Acquisition Omgeving: TimeScan venster en klik op de knop "Scannen".
OPMERKING: Tissue "drift" kan worden veroorzaakt door voldoende tijd voor het oor om thermisch evenwicht, slechte oor preparaat te bereiken, of kan het gevolg zijn van plaatselijke drift in een regio van het oor niet toestaan. Als het beeld van de 5 min is niet stabiel, afbeelding een nieuwe regio in de dermis. Indien een tweede beeld in een nieuw gebied instabiel blijft, is het het beste om zorgvuldig herhalen oor bereiding en beeldvorming van stap 3.6 met een verse coverslip. - Als het weefsel stabiel imago van de 5 min in, verzamel afbeelding een 30-45 min time-lapse door het instellen van het aantal herhalingen tot tussen de 30 en 45 in de Overname Omgeving: TimeScan venster, controleren op eventuele kleine weefsel drift als het beeld verzameld. Sla het bestand in een formaat dat compatibel is met de analyse software te gebruiken is.
OPMERKING: Op dit punt in het protocol stappen 4.2.2 - 4.3.2 kan worden herhaald om het meerdere locaties in hetzelfde oor. Een enkele muis niet gehouden worden verdoofd langer dan 4 uur, zoals dood waarschijnlijker.
- Het veroveren van een 5 min time-lapse beeld van het gebied om de stabiliteit van het weefsel te beoordelen door het instellen van het aantal herhalingen op "5" in het Acquisition Omgeving: TimeScan venster en klik op de knop "Scannen".
- Injecteren blokkerende antilichamen en vast te leggen beeld van een post-antilichaam.
- Trek het antilichaam mengsel in een 1 ml TB spuit en verwijder de naald, en zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen. Druk op de plunjer zodat het antilichaam oplossing vormt een "druppel" aan het einde van de spuit.
- Til de gordijnen rond het podium en zoek de katheter. Verwijder het origineel PBS-containing spuit uit de katheter. Zonder de katheter naar beneden, zorgvuldig bevestig de nieuwe spuit met de antilichamen. Het uiteinde van de katheter op de spuit langzaam injecteer het antilichaam mengsel in de katheter. Zorg ervoor dat er geen weerstand tegen de injectie.
- Stel de katheter naar beneden en laat de gordijnen rond de microscoop podium. Let op het tijdstip van injectie en onmiddellijk beginnen met het verzamelen van een nieuw 20-40 min beeldvormingssequentie op dezelfde locatie met dezelfde instrumentinstellingen beeld als de pre-antilichaam. Sla het bestand op in een geschikt formaat voor de analyse software te gebruiken.
LET OP: Tussen time-lapse beelden, let op de muis voor voldoende anesthesie en ademhaling. Het is niet aan te raden om het meer dan één veld na toediening van antilichamen, kan er een variabele rente van de goedkeuring van het antilichaam.
- Injecteren fluorescent-gelabelde dextran om bloedvaten te lokaliseren, te beoordelen katheter doorgankelijkheid, en meet bLood vaartuig permeabiliteit
- Bereid een 2 mg / ml oplossing van fluorescent-geconjugeerde dextran (70.000 MW) in 100 pi steriel PBS en trekken in een spuit, het verwijderen van eventuele luchtbellen.
- Met dezelfde techniek als in stap 4.4.1-4.4.2, plaats de spuit aan de katheter en injecteert het dextranoplossing intraveneus.
- Leg één stapel bij 1024 x 1024 pixel resolutie door het veranderen van de resolutie in de instelling Overname: Mode venster, met dezelfde PMT en laser instellingen als voor de time-lapse beelden. Om het beeld te verzamelen, schakelt de "Time" knop onder de knop "Scan", en vervolgens te klikken op de knop "Scannen". Dit 3D beeld zal de uitsluiting T-cellen in het vaatstelsel en laten zien dat de catheter octrooi en correct geplaatst. De diffusie van fluorescerende dextran uit de vaten kunnen ook worden gebruikt voor lokale vasculaire permeabiliteit beoordelen.
LET OP: Deze hoge-resolutie (1024 x 1024) statisch beeld wordt gebruikt voor presentation doeleinden en kunnen bovendien worden gebruikt voor de analyse van het weefsel architectuur in hetzelfde gebied als de time-lapse beelden. Als alternatief kan een beeld van 512 x 512 worden genomen, die kunnen worden samengevoegd met de time-lapse beelden met behulp van beeldanalyse-software. Time lapse beeldvorming van het dextran toediening kan ook gewenst zijn, afhankelijk van het onderzoek behoeften van individuele laboratoria. In dit geval moet het beeld worden ingesteld als in stappen 4.2.3-4.3.2.
- Na beeldvorming is voltooid, voorzichtig de muis te verwijderen uit hoofde van de doelstelling en het uitpakken van de water deken. Verwijder de dekglaasje uit de imaging platform door het snijden van de tape en voorzichtig de opheffing van het glas totdat het loskomt. Terwijl de muis is nog steeds verdoofd, los het oor van het dekglaasje. Als dit een terminal procedure, euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie. Als het opslaan van deze muis voor herhaalde beeldvorming, terug te sturen naar een schone kooi te scheiden van andere muizen en observeren totdat de muis kan zich rechts en isambulante. Eenmaal hersteld van anesthesie kan de muis worden teruggestuurd naar een kooi met andere dieren.
- Importeer de imaging-bestanden in een beeldanalyse-programma en elke gewenste correcties uit te voeren. Vermijden van niet-lineaire verbeteringen en geautomatiseerde smoothing of ruisonderdrukking programma's en algoritmen aanbevolen. Typisch, afbeeldingen hoeft alleen maar een kleine achtergrond correctie door de zwarte punt van de afbeelding handmatig toenemende voor de analyse. Analyseer de beeldgegevens met behulp van een geautomatiseerde cel-tracking-programma met handmatige correctie, zoals in Overstreet, Gaylo et al 30.
LET OP: Er zijn veel beeldanalyse suites beschikbaar, zowel bedrijfseigen en open source, dat kan worden gebruikt om mobiele dynamiek te kwantificeren van de multiphoton beelden afgeleid van dit protocol. De exacte wijze van beeldanalyse en de optimale softwarepakketten worden zal afhangen van de onderzoeksbehoeften van elk laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen om immuunreacties in situ te bestuderen zonder dat het immuunsysteem milieu essentieel bestuderen real-time interactie van T-effectorcellen met een ontstoken weefsel. Beeldvorming van het intacte oor dermis van dit protocol geschetst in figuur 1A en B, maakt de visualisatie overgedragen fluorescent gelabelde T effectorcellen in de huid interstitium. Dit maakt zowel hoge-resolutie (figuur 1C) en time-lapse (figuur 1D, Film 1) beelden van effector T-cel dynamica in de ontstoken huid.
Figuur 1. Hoge-resolutie en 4D beeldvorming van T-effector cellen in de intacte huid interstitium. (A) Experimental omtrek. (B) Foto van een oor prepared voor beeldvorming met de plaats van de emulsie (zwarte stippellijn) en een optimaal gebied voor beeldvorming (rode lijn) aangegeven. (C) Maximale 3D-projectie van een hoge-resolutie stack tonen CFSE-gelabelde Th1-cellen (groen), tweede harmonische signaal van fibrillair collageen (blauw) en Texas Rood-dextran gelabeld vaatstelsel (rood). De witte pijl geeft aan een van de vele autofluorescente haarfollikels. Schaal bars vertegenwoordigt 50 pm (D) Trekkende paden van Th1-cellen gevolgd gedurende 30 min in de CFA-ontstoken dermis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze beeldprotocol vereist het gebruik van een gespecialiseerde imaging platform werd in-house, en een aangepaste nosecone voor de levering van inhalatie anesthesie tijdens beeldvorming. De imaging platform (Figuur 2A-B) bestaat of een aluminium bodemplaat met een verhoogde centrale gedeelte. Deze verhoogde sectie heeft een inzet deel bekleed met acryl voelde steun te verlenen aan het oor te bieden zonder te comprimeren en mogelijk schade aan de dunne weefsel. De geometrie van onze opstelling vereist de constructie van een flexibel en aanpasbaar neuskegel aan geïnhaleerde verdoving toedienen tijdens beeldvorming. Dit neuskegel, bestaande uit een gemodificeerde microcentrifugebuis verbonden met een punt 50 mm flexibele buis (figuur 2C), vastzit met een houder bestaande uit gemodificeerde microcentrifugebuizen (figuur 2D) en aangebracht op de beeldvormende platform via klittenband . Het gebruik van klittenband maakt de herpositionering van de neuskegel samenstel zodat beide oren van een muis kunnen worden afgebeeld, en kan optimaal worden gepositioneerd voor individuele muizen.
Figuur 2. Equipment voor intravitale beeldvorming. Op maat gemaakte imaging platform in de top (A) en aan de zijkant (B) bekeken. Neuskegel voor isofluraan administratie (C) en de neuskegel houder (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Catheterisatie van de staartader maakt continue toegang tot de circulatie antilichamen en andere kleine moleculen die uit de vasculatuur kunnen diffunderen of groter fluorescente moleculen zoals hoogmoleculaire moleculair dextran toedienen aan bloedvaten labelen. Na de toediening van 100 ug anti-β 1 en anti-β 3 integrine blokkerende antilichamen door de katheter eerder beweeglijke cellen arrestatie in de dermis (Film 2). Deze cellen hebben een verlaagde gemiddelde snelheid na antilichaam toediening (figuur 3A), en een significante daling van meanderende index, de verhouding van de totale verplaatsing naar de totale baanlengte (Figuur 3B).
Figuur 3. Toediening van anti-β 1 en anti-β 3 antilichamen inhibeert Th1 cellen migratie CFA-ontstoken huid. (A) De gemiddelde snelheid van Th1 cellen voor en na toediening van 100 ug anti-β 1 en anti-β 3 integrine blokkerende antilichamen. (B) Het kronkelen index van Th1-cellen voor en na antilichaam blokkade. Ongeveer 100 gevolgd cellen uit beelden voor en na antilichaam blokkade van een enkele muis in één representatief experiment. Statistieken door Mann Whitney.es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Omdat het haar niet uit het oppervlak van het oor wordt verwijderd, beeldvormingsartefacten van haar zijn normaal. Autofluorescentie van haarzakjes (Figuur 4A) en shadowing en autofluorescentie van bovenliggende haar (Figuur 4B) waar mogelijk moeten worden vermeden omdat ze T-cellen kunnen verduisteren en interfereren met geautomatiseerde beeldanalyse software. Op dezelfde manier kan luchtbellen gevangen tussen het oor oppervlak en het dekglaasje leiden tot imaging artefacten (Figuur 4C). Een goede voorbereiding van het oor moet het aantal en de omvang van eventuele resterende luchtbellen te minimaliseren.
Figuur 4. Gemeenschappelijke artefacten uit haar autofluorescentie en slechte oor preparation. (A) Autofluorescente haarfollikels. (B) Autofluorescente haar en haarfollikels (groen) en collageen (wit) met bovenliggende haar schaduwen, waardoor de donkere lijnen in het beeld. (C) Artifact van een luchtbel, die de rand van de ontheemden, autofluorescente keratinized epidermis (stippellijn). Schaal bars vertegenwoordigen 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bovendien kan het gebruik van meerdere warmtebronnen leiden tot problemen met de stabiliteit van het weefsel als gevolg van thermische uitzetting en krimp. Onjuiste thermostaat instellingen, bijvoorbeeld, kan leiden tot grote schommelingen tijdens de beeldvorming die de interpretatie van de resultaten moeilijk (Film 3) kan maken. Het is essentieel om de optimale instellingen te bepalen voor elk systeem dat een constante temperatuur ligt en de beste stabiliteit. UltimatEly, temperatuurgestuurde imaging kamer is de beste manier om variabiliteit van temperatuurschommelingen verwijderen.
Film 1. Th1-cellen migreren in de CFA-ontstoken dermis (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Afbeelding 30 min time-lapse tonen Th1-cellen (groen) migreren in de huid collageen netwerk (tweede harmonische generatie, blauw).
Movie 2. Th1-cellen arrestatie na blokkade van β 1 en P 3 integrines (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Cells (groen) werden afgebeeld gedurende 30 minuten vóór de administrantsoen blokkerende antilichamen en vervolgens belicht nog eens 20 min op dezelfde locatie.
Movie 3. Trillingen van een slecht gecontroleerde verwarmingsplaat (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). 30 min time-lapse beeld van Th1-cellen (groen) en de tweede harmonische generatie (blauw). Na dit beeld werd verzameld, werd de verwarmingsplaat bleek een defecte thermostaat, waardoor schommelingen in de temperatuur van de imaging platform daaropvolgend thermische uitzetting en krimp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betekenis
Hier presenteren wij u een protocol voor 4D visualisatie overgedragen, antigeen-specifieke effector Th1 cellen in het intacte muizenoor dermis. Deze werkwijze biedt voordelen ten opzichte van sommige van de huidige beeldvormingsmodaliteiten om verschillende redenen. Door de beeldvorming van de ventrale oor dermis, zijn we in staat om ontharing die nodig is voor de beeldvorming protocollen waarbij andere huid websites af te zien. Hoewel ontharingsmiddelen algemeen mild, bleken ze om verstoringen in de huidplaat 42, een werkwijze die een immuunrespons kan stimuleren 43,44. Door ook het vermijden van invasieve chirurgische procedures aan de dermis of onderhuid bloot te leggen, dit protocol voorkomt beschadiging geïnduceerde ontsteking en de snelle rekrutering van neutrofielen 37 en andere immuuncellen in de dermis. Het gebruik van een veneuze katheter in dit systeem blokkerende antilichamen biedt tegen sleutelmoleculen maakt real time uitlezing van de dynamic gedrag van CD4 T-cellen. Het gebruik van deze beeldprotocol blijkt kritische vereisten voor CD4 T cel interstitiële motiliteit 30 die niet gedetecteerd werden in vitro systemen 8.
Kritische stappen in de procedure
Een essentiële stap in een beeldvormingstechniek wordt een stabiele weefselpreparatie voor beeldvorming. Het is belangrijk dat er voldoende PBS tussen het oor en het dekglaasje dat er geen luchtbellen en het oor in contact met het glas, maar niet zo goed als voor zorgen dat de band naar de-gehecht uit het glas worden. Evenzo vermijden van contact tussen de band die het dekglaasje op het platform en eventuele vacuüm vet voorkomt dat de tape loskomt tijd. Temperatuur moet constant worden gehouden om oscillaties te vermijden en drift thermische samentrekking of uitzetting van het platform materialen.
Beperkingen en Modificaties
45. De resident immune populatie van het oor verschilt van de huid op de flank of voetzool 46, en het muizenoor heeft duidelijke vasculaire eigenschappen in vergelijking met andere sites 47. Dus voor sommige toepassingen, vergeleken oor beeldgegevens naar andere plaatsen op de huid moeilijk zijn.
Dit protocol vereist ook de daadwerkelijke migratie van overgedragen T effector cellen uit de bloedbaan en in de dermis. Dit beperkt het vermogen om cellen die defecten in homing of extravasatie hebben als ze niet in staat zijn de interstitiële ruimte betreden. bloeduitstortingkan worden omzeild door het injecteren van cellen direct in het oor dermis 37,48, hoewel dit enige mechanische schade en levering van cellen op deze wijze niet herhalen de lokalisatie of het gedrag van cellen die in vivo ondergaan extravasatie veroorzaken.
Het is ook kritisch overwegen om niet-gepigmenteerde ontvangende muizen voor beeldvorming experimenten, zoals BALB / c-stam hier of albino C57BL / 6- Tyr c-2J-muizen gebruikt. De melanine in gepigmenteerde muizen, naast het feit dat zeer autofluorescerend, warmt zelfs onder relatief laag vermogen excitatie van een multifoton laser 37. Dit kan thermische beschadiging van de huid en daaropvolgende ontsteking 36 of fluorescerende spikkels 31, complicerende resultaten opleveren. Dit kan fluoroforen die kunnen worden gebruikt in een multi-parameter imagingexperiment beperken. Echter, sommige zeer heldere of sterk uitgedrukt fluorescerende moleculen effectief opgewonden bij lage laservermogen zijn, allesals gevolg voor een effectieve visualisatie in gepigmenteerde muizen.
toekomstige toepassingen
Omdat dit een niet-invasieve procedure, kan het gemakkelijk worden aangepast voor longitudinale studies op muizen met sequentiële beeldvorming over langere tijdsintervallen. Terwijl tl-etikettering zoals hier beschreven zou verdwijnen na verloop van tijd perioden groter dan 3-4 dagen, het gebruik van endogeen fluorescerende cellen of fluorescerende reporter cellen elimineert dit probleem. Inderdaad hebben we eerder gebruikt dit protocol te sporen in vivo- gegenereerde antigeen-specifieke effectors dragende cytokine reporters, met inbegrip van de IFNy reporter Yeti 30,49 en IL-4 reporter 4get 50. We hebben bovendien gevisualiseerd endogene CD4-cellen in CD4-Cre ROSA26-stop-floxed EYFP fluorescerende reporter muizen 30. Als de fluorescerende eigenschappen van EYFP en andere fluorescerende eiwitten verschillen van chemische kleurstoffen zoals CFSE modificaties aan de beeldvormende parameters nodigefficiënte visualisatie. Veranderingen zoals het verhogen van de pixelverblijftijd kan fluorescentiesignaal van enkele dim fluoroforen verbeteren, en het verminderen van de tijd lapse beelden kan elk fotobleken die kunnen worden waargenomen beperken. Bij 900 nm excitatie, hebben we nog niet eerder waargenomen significant fotobleken van CFSE, CMTMR of EYFP over korte imaging intervallen.
Hoewel deze werkwijze is gericht op het meten van de dynamiek van CD4 effector T-cel motiliteit, is niet tot deze toepassing beperkt. Er wordt momenteel gewerkt aan de dynamische interactie van effector T-cellen te meten met antigeen presenterende cellen door het gebruik van fluorescerende reporter muizen en injectie van fluorescent geconjugeerde antilichamen in de dermis cellen of weefselstructuren vóór beeldvorming 51,52 labelen. Bovendien, terwijl dit protocol toont het gebruik van de katheter blokkerende antilichamen leveren en beeldvorming, andere verbindingen, zoals kleinmoleculige remmers, kanworden toegediend. Uiteindelijk is dit protocol een flexibel platform om immune dynamiek tijd meten, in vivo, in een niet-invasieve wijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de Universiteit van Rochester Multiphoton Microscope Core faciliteit voor hulp bij het live-imaging. Ondersteund door NIH AI072690 en AI02851 naar DJF; AI114036 naar AG en AI089079 te MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
