Summary
המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.
Abstract
היכולת של תאי CD4 T לבצע פונקציות מפעיל תלויה ההגירה המהירה ויעילה של תאים אלה ברקמות פריפריה מוסתות באמצעות מנגנון שטרם מוגדר. היישום של מיקרוסקופיה multiphoton לחקר מערכת החיסון מספק כלי למדוד את הדינמיקה של תגובה חיסונית בתוך רקמות ללא פגע. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multiphoton intravital לא פולשנית של תאים מסוג CD4 T בדרמיס האוזן העכבר מוסת. שימוש פלטפורמת הדמיה מותאם אישית צנתר ורידים מאפשר ההדמיה של דינמיקת תא CD4 T ב interstitium עורי, עם היכולת לחקור תאים אלה בזמן אמת באמצעות התוספת של חסימת נוגדנים לרכיבים מולקולריים מפתח המעורבים תנועתיות. מערכת זו מספקת יתרונות על פני הן במבחנת מודלים ונהלי הדמיה פולשנית כירורגית. הבנת מסלולים בשימוש על ידי תאים מסוג CD4 T עבור תנועתיות עשוי בסופו של דבר לספק תובנה בשיאפונקציה ג תאי CD4 T וכן בפתוגנזה של שתי המחלות והפתולוגיה אוטואימוניות מדלקות כרוניות.
Protocol
כל הנהלים הקשורים עכברים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת רוצ'סטר, ובוצע בהתאם קפדנית עם חוק צער בעלי-חיים ואת מדיניות השירות לבריאות הציבור על טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה מנוהל על ידי ה- National Institutes הבריאות, משרד הרווחה בחיות מעבדה.
1. הכנת תאי המפעיל CD4 T
הערה: עכברים DO11.10 TCR-מהונדס BALB / ג שדווקא להכיר פפטיד מ ovalbumin ביצת תרנגולת (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). מערכות TCR-מהונדסות אחרות ניתן להחליף, באמצעות הפפטיד מאותו המקור המתאים במקום pOVA בם מצוינות.
- לטהר תאים מסוג CD4 T נאיבי
- להרדים עכברה DO11.10 בן שבוע 6-8 BALB / ג ידי חשיפת עד 2 ליטר / דקה CO 2 עד שהעכבר לא מראה סימנים של תנועה או נשימה דקות 1, ואחריו נקע בצוואר הרחם, או על פיהנחיות ועדת אשפוז במוסד סיעודי וטיפול בבעלי חיים לשימוש מקומי. תרסיס העכבר עם פתרון אתנול 70% ולעשות חתך כ 7 ס"מ על העור מפני הסנטר של העכבר כדי 2/3 הדרך לאורך הבטן. הפוך 2-3 חתכים בעור ס"מ מהקצה של חתך בבטן לכיוון הרגליים האחוריות. היזהר שלא לחתוך לתוך הצפק.
- הפרד בזהירות את העור מפני הצפק על ידי משיכת בעדינות עם מלקחיים. בלוטות הלימפה מפשעתי ממוקמות על העור ליד הצומת של רגליים האחוריות עם הגוף. הסר ידי אחיזה ומשיכה עם מלקחיים ומניחים 8 מ"ל של HBSS בתוספת סרום עגל בן יומו 2% (NCS).
- קציר את בלוטות בית השחי והלימפה הזרוע מן העכבר תוך כדי אחיזה ומשיכה בעדינות עם מלקחיים. מקום NCS HBSS + 2% עם בלוטות הלימפה מפשעתי.
- קציר את הבלוטות לימפה צוואריות עמוקות ושטחים הממוקמות בצוואר של העכבר עם מלקחיים ומניחים NCS HBSS + 2% עם otבלוטות הלימפה שלה.
- בעדינות וחותכי הצפק, נזהרים שלא לחתוך לתוך המעיים. אחוז cecum והמעי הגס עם מלקחיים ולחשוף את בלוטות לימפה mesenteric, הנמצאים לאורך המעי הגס. מוציא בזהירות את הבלוטות לימפה mesenteric עם מלקחיים ומניחים עם בלוטות הלימפה האחרות.
- אתר את הטחול בתוך חלל הבטן ובזהירות להסיר אותו, מחזיק עם מלקחיים חיתוך הרקמה החיבורית משם עם זוג מספריים כירורגיות. מניחים את הטחול עם בלוטות הלימפה.
- כן השעית תא בודד על ידי מזיגת NCS HBSS + 2% המכיל צומת הטחול לימפה לתוך מסננת מתכת להציב צלחת תרבות 60 x 15 מ"מ. בעדינות ומועכים את בלוטות הטחול הלימפה דרך מסננת מתכת עם הבוכנה של מזרק 10 מ"ל לתוך% HBSS + 2 NCS.
- בעזרת פיפטה, להעביר את ההשעיה תא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל נקי. יש לשטוף את מסננת מתכת צלחת תרבות עם 10 מ"ל נוספים של HBSS + 2% NCS, uלשיר פיפטה, והנח פתרון זה בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל זהה ההשעיה תא.
- ספין התאים ב 600 XG במשך 5 דקות עד גלולה התאים ו resuspend ב 10 מ"ל HBSS + 2% NCS ידי pipetting בעדינות. אלא אם צוין אחרת, כל צנטריפוגה צריכה להתבצע ב 600 XG במשך 5 דקות.
- לדלל 10 μl של ההשעיה תא 90 μl של כחול 0.1% trypan ב PBS עבור דילול 1:10. מקום 10 μl של תאים בכחול trypan גבי hemocytometer על ידי pipetting הפתרון לתוך החריץ בקצה של hemocytometer. ספירת תאי הדם הלבנים ברשת במרכז hemocytometer, התעלמות אריתרוציטים שנראים כמו קצת יותר קטן, עגול, תאים אדומים-גוני ואת התאים המתים / גוסס כחול. הכפל את מספר התאים נספר על ידי 10 4, על ידי גורם לדילול (10), ועל ידי נפח של התאים (10 מ"ל) כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים שנאספו צינור צנטריפוגות 50 מ"ל.
- כדי להעשיר את תאי CD4 T, בצנטריפוגהלתאים גלולה, ו resuspend התאים ב מ"ל / 2x10 7 תאים בתמיסה המכילה כ 1 מיקרוגרם / מ"ל אנטי CD8 (שיבוט 3.155), 1 מיקרוגרם / מ"ל השנייה מחלקה אנטי MHC (שיבוט M5 / 114), ו 1 מיקרוגרם / מ"ל אנטי CD24 (שיבוט J11d) נוגדנים HBSS + 2% NCS ידי pipetting בעדינות.
הערה: הנוגדנים המשמשים שלב זה נגזרים ללא צורך במיקור חוץ מ שורות תאי hybridoma וריכוזיות הם מקורבים. הריכוז והנפח של נוגדנים אלה אידיאליים עבור תמוגה משלה נקבעו באופן אמפירי ינועו בין מעבדות. לחלופין, כמה ערכות זמינות מסחרי זמינות לטיהור של תאים נאיביים CD4 T ניתן להחליף עבור תמוגה משלים תהליך טיהור CD62L + מיוצגת כאן. אם בשיטה אחרת כדי לטהר תאים מסוג CD4 T נאיבי, פרוטוקול זה יכול להיות המשך משלב 1.2. - דגירה על קרח למשך 30 דקות. בסוף הדגירה זה, במהירות להפשיר השלמה שרקן ידי בנייה ואחר ב 37 מעלות צלזיוס מיםATH כ 2 דק '. הוספת 100 μl של השלמה עבור כל 1 מ"ל של תאים בתמיסה נוגדנים על ידי pipetting המשלים ישירות לתוך ההשעיה תא. דגירת תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הוספת HBSS + 2% NCS להביא את התאים כדי בהיקף כולל של 20 מ"ל בצינור צנטריפוגות. שכבה ב 8 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה צפיפות RT (צפיפות 1.086 גרם / מ"ל) מתחת תאים. מיד בצנטריפוגה תאים ב 1400 XG ב RT במשך 15 דקות עם הבלם צנטריפוגות כבוי.
- איסוף תאים על הממשק בעזרת פיפטה והעביר סרולוגיות תאים לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. שוטפים את התאים על ידי הבאת את עוצמת הקול בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל עם HBSS + 2% NCS ו צנטריפוגה.
- Resuspend התאים חיץ MACS (PBS בתוספת 2% NCS ו -2 מ"מ EDTA) על ידי pipetting בעדינות ולספור כמו בעבר, בשלב 1.1.10.
- כדי להעשיר את תאי CD4 נאיבי T, resuspend התאים ב מ"ל / 2x10 7 תאים בתמיסהשל נוגדן anti-CD62L 2.5 מיקרוגרם / מ"ל מצומדות ביוטין חיץ MACS, בהתבסס על מספר נספר בשלב 1.1.16. דגירה במשך 30 דקות על קרח.
- שוטפים את התאים על ידי הוספת חיץ 10 מ"ל MACS, אז צנטריפוגה התאים. Resuspend התאים ב 10 7 תאים / 100 μl חיץ MACS ולהוסיף חרוזים הפרדה מגנטי מצומדות streptavidin ב דילול 1:10 ישירות אל התאים. דגירה על קרח למשך 20 דקות.
- שוטפים את התאים כמו קודם, בשלב 1.1.17, ו resuspend התאים ב מ"ל / 2x10 8 תאים חיץ MACS, בהיקף מינימלי של 500 μl.
- מניחים טור הפרדה מגנטי בעל מגנט ולשטוף את הטור ידי ומאפשרות חיץ 3 מ"ל MACS לזרום. החל את התאים בעמודה עם טפטפת.
- לשטוף את העמודה כדי להסיר תאים לא מחויבים לפי העמודה המגנטית על ידי pipetting 3 MACS מיליליטר חיץ על הטור ומאפשר למאגר MACS לזרום, וחוזר 3 פעמים. מחק את הזרימה דרך שבריר.
- removדואר בעמודה מהדוכן המגנטי וחזקה מעל צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. Pipet 5 מיליליטר של חיץ MACS על הטור ולהשתמש הבוכנה מצורפת בעמודה לדחוף את MACS חיץ דרך העמודה כדי לשחרר את התאים מאוגדים בעמודה לאסוף את הזרימה דרך שמכיל את תאי CD4 T הנאיביים המועשרים.
- צנטריפוגה את התאים resuspend ב 10 מ"ל RPMI בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), 100 IU / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol (RPMI-10). ספירת התאים כמו קודם, בשלב 1.1.10.
- התאם את הריכוז הסופי של תאי CD4 T נאיבי 6x10 5 / מ"ל ב RPMI-10.
- לטהר נגמ"שים T-מדולדל תא הטחול
- להרדים עכבר BALB / ג wild-type נקבה בת שבוע 6-8 כמו בשלב 1.1.1.
- תרסיס העכבר עם פתרון אתנול 70% ולחשוף את הטחול על ידי ביצוע חתך כ 3 ס"מ בצד שמאל של abdome העכברn. גזור לפתוח את שכבת הצפק ולהסיר את הטחול ידי אחיזה אותו בעדינות עם מלקחיים לחתוך אותו מן רקמת חיבור הבסיסית עם מספרי כירורגיות.
- מניחים את הטחול לתוך 8 מ"ל של HBSS + 2% NCS.
- כן השעית תא בודד מוחצי הטחול, לשטוף, לספור את התאים, כמו קודם, בצעדי 1.1.7-1.1.10
- לרוקן תאי T על ידי ספינינג התאים ב 600 XG במשך 5 דקות כדי גלולה, ו resuspend התאים ב 2x10 7 בתמיסה של כ 1 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן אנטי Thy1.2 (שיבוט J1J) על ידי pipetting בעדינות. דגירת התאים על קרח למשך 30 דקות.
הערה: נוגדן זה נגזר ללא צורך במיקור חוץ משורת תאי hybridoma ואת concentraton הוא מקורב. ריכוז ונפח אידיאלי נוגדן זה תמוגה המשלים נקבע באופן אמפירי ינועו בין מעבדות. שיטות אחרות נגמ"שים לטיהור מ splenocytes ניתן להחליף אם תרצה בכך. תאים ונגמ"שים T נאיביים צריכים להיות מוכנים כתיור משלב 1.3. - להוסיף השלמה שרקן, דגירה, ולהפריד את התאים על שיפוע תקשורת צנטריפוגה צפיפות כמו קודם, בצעדים 1.1.13-1.1.14.
- Resuspend התאים 10 מ"ל של RPMI-10 ו מקרינים את נגמ"שים ידי הצבת התאים שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגות לתוך irradiator גמא עבור משך הזמן שבו יחשוף את התאים 25 קרינה Gy. משך הזמן זה ישתנה בהתאם על irradiator ויהיה צורך להיות מחושבים בכל פעם תאים הם מוקרנים.
- ספירת התאים על hemocytometer כמו קודם, בשלב 1.1.10, ולהתאים את תאי APC לריכוז סופי של תאים / 2.4x10 6 מ"ל ב RPMI-10.
- לעורר תאים ולבדל תאי CD4 T כדי פנוטיפ Th1 בתרבות 5 ימים.
הערה: למרות שאנו מציגים כאן פרוטוקול להכנה והדמית effectors Th1 המופק מתאי CD4 T נאיביים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבדל את התא הנאיבי פנוטיפ שונה, או לאo להשתמש סוגי תאים אחרים, כגון תאי CD8 T. תנאים תחול והבחנה יצטרכו להיקבע באופן אמפירי.- בכל טוב של תרבות צלחת 24 גם, לשלב 500 μl של תאים מסוג CD4 T נאיבי 500 μl של נגמ"שים מוקרן בכל טוב, עבור סכום כולל של 3x10 5 T תאים 1.2x10 6 נגמ"שים לכל טוב.
- הכן פתרון ב RPMI-10 המכיל 2 מיקרומטר פפטיד OVA מאותו מקור, 20 U / ml רקומביננטי IL-2, 80 מיקרוגרם / מ"ל אנטי-IL-4 (שיבוט 11B11) ו -40 ng / ml רקומביננטי IL-12 ולסנן באמצעות 0.2 מסנן מזרק מיקרומטר. הוסף 1ml של פתרון זה היטב בכל התאים, בהיקף כולל של 2 מ"ל בכל טוב.
- דגירה התאים 37 ° C חממה ב 5% CO 2 למשך 3 ימים.
- ביום 3, לפצל את תרבויות ידי pipetting בעדינות resuspend תאים ומרגש 1 מ"ל מכל טוב לתוך תרבות חדשה היטב. תביאו כל טוב לנפח סופי של 2 מ"ל על ידי הוספת 1 מ"ל / טוב של RPMI-10 + 20 U / ml רקומביננטי IL-2. </ Li>
- החזר את הצלחות אל האינקובטור ולאפשר לתאים להרחיב עד היום 5.
העברת 2. של תאי אינדוקציה של דלקת
הערה: לקבלת מספרים אופטימליים תא הדמיה, 5x10 6 שכותרתו fluorescently תאי Th1 יועברו כל עכבר בנפח כולל של 200 μl PBS. תאים כאן הם שכותרתו עם CFSE הצבע הירוק או CMTMR לצבוע כמעט אדום, למרות צבעי גשש תאים אחרים יכולים לשמש. CFSE ותאי CMTMR שכותרתו יכולים להיות שותף עבירה כדי לאפשר מעקב של שתי אוכלוסיות CD4 מפעיל ברור.
- תאי תווית מפעיל T עם CFSE
- קציר התאים מן הכלים תרבות על ידי pipetting התאים נמרצות בכל טוב והעברת צינור צנטריפוגות 50 מ"ל סטרילי עם pipet. ספירת התאים כמו בשלב 1.1.10, אז צנטריפוגות resuspend התאים ב 10 7 תאים / מ"ל ב PBS + 5% NCS.
- לדלל פתרון CFSE המניה 5 מ"מ 1: 100 בPBS. להוסיף 110 פתרון CFSE μl עבור כל 1 מ"ל של תאים על ידי הצבת ירידה של פתרון CFSE בצד של הצינור ואז במהירות נדנדה הצינור הלוך ושוב לערבב ביסודיות.
- דגירה התאים למשך 5 דקות ב RT, אז להרוות את CFSE על ידי הוספת 5 מ"ל של העובר עגל בסרום (FCS) ישירות אל הצינור של תאים. תביאו את הנפח ל 50 מ"ל עם PBS + 5% NCS.
- צנטריפוגה תאים resuspend גלולה ב 20 מ"ל PBS + 5% NCS. חזור על תהליך זה פעמים נוספות כדי לשטוף את התאים 3 פעמים בסך הכל. ספירת התאים על hemocytometer, כמו קודם, בשלב 1.1.10, ו resuspend התאים PBS סטרילי ב 2.5 x 10 מ"ל 7 תאים / להעברת לעכברים.
- לייבל מפעיל T תאים עם CMTMR
- קציר התאים כנ"ל בשלב 2.1.1, ואז לספור, צנטריפוגה ו resuspend התאים ב 10 7 תאים / מ"ל ב RPMI-10.
- הוסף 10 פתרון המניות מ"מ CMTMR ישירות אל התאים ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. במהירות ה pipetתאי דואר לערבב ביסודיות CMTMR ולמנוע משקעים של צבע.
- דגירה 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. שטפו תאים 3x ב PBS + 5% NCS כמו קודם, בשלב 2.1.3-2.1.4. הרוזן resuspend התאים PBS סטרילית 2.5x10 7 תאים / מ"ל להעברת לעכברים.
- העברת מפעיל T לתאים נאיבי 6-8 בשבוע נקבה בת עכברים BALB / ג.
- צייר את השעית התא (שלב 2.1.4 או 2.2.3) לתוך מזרק, מקפיד להסיר את כל הבועות על ידי לחיצה על בצד למעלה מחט המזרק, בעדינות מצליפה בצדי המזרק והזזת הבוכנה למעלה ולמטה, אם יהיה צורך בכך .
- מניחים עכברים בכלוב וחום נקי בעדינות מתחת לפנס חום עד וריד הזנב מופיע vasodilated. מניחים את העכבר בהתקן ריסון ולנגב את הזנב עם ספוגית אלכוהול. לאט לאט להזריק 200 μl של השעיה התא לתוך וריד הזנב לרוחב. לא צריך להיות שום התנגדות זריקה או מבעבע גלוי מתחת לעור.
- להשרות דלקת עורי על ידי חיסון עם Adjuvant של פרוינד השלם (CFA)
הערה: בפרוטוקול זה, דלקת הוא המושרה על ידי הזרקה תוך-עורית של CFA לתחליב או עם אנטיגן מאותו מקור או שאינם מאותו מקור. מודלים דלקתיים אחרים ניתן להחליף, אם כי מספר התאים הדרושים להעברה ועיתוי ההדמיה יהיה צריך להיות מותאם באופן אמפירי.- כן פתרון 200 מיקרומטר של הפפטיד OVA ב PBS סטרילי בתוך שפופרת microcentrifuge. Pipet בהיקף שווה ערך של CFA על גבי הפתרון פפטיד.
- חלב את הפתרון על ידי ציור אותו לתוך מזרק 28 G1 / 2 אינסולין ואז צולל הפתרון בחזרה לתוך צינור microcentrifuge, וחזר על פעולת פעולה זו כ 20 פעמים. כאשר לתחליב במלואה, CFA פתרון פפטיד יהוו תערובת סמיכה ואטומים.
הערה: חשוב להשתמש מזרק אינסולין קבוע מחט כדי ליצור את התחליב, כמו התחליב יאבד במרחב המת needl לא קבועמזרק דואר. - בדוק את התחליב על ידי הטלת כמות קטנה על מים להציב בצלחת פטרי. התחליב צריך להישאר על כנם ולא להתפזר לתוך המים.
- צייר את התחליב לתוך מזרק אינסולין 300 μl 28 G1 / 2 ומהדקים בחדות על הבוכנה כדי להסיר בועות אוויר גדולות.
- מיד לאחר העברת fluorescently שכותרתו תאים מפעיל T, להרדים את העכברים בזריקה ip של 2,2,2-tribromoethanol ב 240 מ"ג / ק"ג. להעריך הרדמה על ידי קמצוץ הבוהן עדין, ניהול 2,2,2-tribromoethanol יותר במרווחים של 1 מ"ג, במידת הצורך.
הערה: הרדמה אושרה אחרת עשויה להיות תחליף 2,2,2-tribromoethanol. - מניח אצבעון על אצבע המורה השמאלית ובזהירות לתפוס את האוזן של העכבר בין האגודל השמאלי לאצבע עם אוזן הגחון כלפי מעלה. ודא שלא להפעיל לחץ מוגזם על אזניים, שיכול לגרום נזק מכני העור.
- חלק את המחט המכילה את דואר CFAmulsion לתוך הדרמיס, הצד שיפוע כלפי מעלה, לאט להזריק 10 μl של אמולסיה לתוך האוזן. המיקום של הזריקה צריך להיות החיצוני 1/3 פינה, מעט מחוץ למרכז, כדי לאפשר הדמיה אופטימלית.
- צג עכברים עד ההרדמה יש נשחק ועכברים מסוגלים לתקן עצמם והם אמבולטורי. עכברים 3 ימים תמונה הבאים חיסון, מתן זמן לדלקת להתפתח לתאי T הועבר תנועה הדרמיס האוזן.
הערה: עכברים אינם יכולים להישאר ללא השגחה בכל עת לאחר הרדמה.
3. הכנת עכבר הדמיה
- כן קטטר
- מוציאים בזהירות את המחט מתכת מ מחט מזרק 30 G1 / 2 טוברקולין (TB) עם צבת הסירו כל דבק עודף, באמצעות היקף הניתוחים לדמיין כי הדבק נמחק לחלוטין.
- חותך את הקצה של אחר מחט מזרק 30 G1 / 2 TB, להבטיח כי המחט הנותרת עדיין patent ידי בדיקה ויזואלית. Slip חתיכת 18 ס"מ של צינורות רפואי PE-10 על מחט גזוז, ובזהירות במקום מחט מתכת חשופה כ 5 מ"מ לתוך הקצה השני של הצינור, יצירת קטטר.
- רוקן את הקטטר על ידי מילוי מזרק 1 TB מ"ל עם PBS סטרילי, הסרת כל בועות האוויר. הנח בעדינות את הקטטר על קצה המזרק ולדחוף PBS בעדינות אך הקטטר כדי להסיר בועות כל בצינור.
הערה: כאשר דוחפים הנוזל דרך קטטר, חיוני לקיים את הקטטר על המזרק כדי למנוע לחץ נוזלים מן לדחוף את הקטטר הנחה של מזרק. - מניחים עכברים בכלוב וחום נקי בעדינות מתחת לפנס חום עד וריד הזנב מופיע vasodilated. להרדים את העכבר עם תערובת של אוויר חדר isoflurane (אינדוקצית 5%, תחזוקת 1-2%, ב -2 L / קצב זרימת דקות), מועבר דרך הרכבת nosecone כי כבר מצורפת המאדה isoflurane. ודא כי העכבר הוא מורדם with קמצוץ בוהן עדין. בהדרגה להגביר את קצב זרימת isoflurane ב -0.1% אם התנועה הוא ציין. מכסה את העיניים עם משחת עיניים כדי למנוע התייבשות או פציעה בזמן שהעכבר הוא מורדם.
הערה: זה חיוני כי עכברים לא להשאיר ללא השגחה בעת בהרדמה. עכברים צריכים להיות במעקב תכוף עבור הרדמה מספיק ידי קמצוץ בוהן עדין. - לשתק את הזנב בבסיס עם זוג מלקחיים, ולאחר מכן לנגב את הזנב עם ספוגית אלכוהול. החלק בזהירות את קטטר לתוך וריד הזנב לרוחב ולבדוק patency ידי דוחף בעדינות על הבוכנה של המזרק. לא צריך להיות שום התנגדות לתנועה ואין מבעבע גלוי של PBS מתחת לעור אם היא ממוקמת כראוי. הצמד את הקטטר אל זנב ידי החלת 1-2 טיפות של דבק רקמות cyanoacrylate על הזריקה ולאפשר לו להתייבש, כ -30 שניות.
- בזהירות לקצץ את השיער מאחור ובצדדים של האוזן עם זוג מספריים, נזהרת שלא לפגוע skב. חתוך את השפם גם כן. באמצעות מקלון צמר גפן, ללחלח את המשטח הפנימי של האוזן עם PBS.
- סובב את העכבר האוזן על גבי תלוש כיסוי זכוכית 24 x 50 מ"מ מס '1.5. בעזרת מלקחיים, לשטח את האוזן בעדינות על להחליק את המכסה, הזזת העכבר במידת הצורך על מנת להבטיח כי האוזן הוא מיושר עם זכוכית. הסרת עודפי PBS מהאוזן ידי סופג בעדינות עם טישו לנגב.
הערה: ודא שלא ללחוץ חזק מדי על האוזן, כמו העור הדק עלול להיפגע בקלות עם לחץ רב מדי. - באמצעות שני זוגות מלקחיים מעוקלים, לתפוס פיסה כ 20 מ"מ אורך של סרט בד לאורכו בפינות העליונות. מניחים בתחתית קלטת על coverslip בראש של האוזן של העכבר וגלגל את הקלטת על פני שאר האוזן, דוחפים שיער עודף מהדרך עם מלקחיים במידת הצורך לצרף את האוזן אל coverslip. לחץ בעדינות על הקלטת סביב האוזן עם מקלון צמר גפן יבש כדי להבטיח חותם חזק, נזהר שלא ללחוץ על האוזן עצם.
- צרף פלטפורמת ההדמיה כדי בלוק חימום 37 מעלות צלזיוס עם סרט דביק. למרוח משחת ואקום משני צדים באזור האוזן של פלטפורמת ההדמיה. סובב את העכבר כדי למקם את coverslip על גבי פלטפורמת הדמיה, מקפיד ליישר את האוזן במרכז הלבד.
הערה: להימנע מקבלת גריז ואקום בקלטת, כמו זה יגרום לו לבוא במנותק להחליק את מכסה זכוכית. - הצמד את nosecone isoflurane לתוך מחזיק על פלטפורמת הדמיה, להבטיח כי nosecone מאובטחת וחינם לחלוטין כיסוי האף של העכבר. מורחים את המשחה ואקום תחת coverslip ידי בחוזקה אך בזהירות לחיצה על coverslip על גבי פלטפורמת הדמיה עם מקלון צמר גפן נקי ויבש.
- הצמד את coverslip לפלטפורמה עם שני 20 מ"מ חתיכות של נייר ושתי חתיכות יותר של קלטת הכרוכה סביב החלק העליון של הרציף. אם כל בועות אוויר נוכחים בין האוזן לבין coverslip, הם ניתן להסיר בעדינות על ידי לחיצה על האוזן מלמטה with פיסת נייר מקופל.
הערה: זה חיוני לא להשתמש בנייר עבה מדי או ללחוץ בחוזקה, כמו זה יכול לגרום לרקמה לבנה וניזק, שמסבך תוצאות. - הזז את העכבר על הבמה מיקרוסקופ ולאבטח את הפלטפורמה עם סרט דביק. צנרת בשכבה כפולה של שומן ואקום על coverslip סביב האוזן לשמש כמאגר מטרת הטבילה במים.
- לעטוף בשמיכת חימום מלא מים סביב העכבר באמצעות פלטפורמת ההדמיה. מלאו את מיכל עם 37 מעלות מים מזוקקים C. לוודא שהכל מאובטח על הבמה עם דבק וכי המזרק של הקטטר הוא נגיש בקלות.
4. זמן לשגות הדמיה Vivo ומינהל נוגדן תוך ורידי
הערה: פרוטוקול זה מחייב שימוש במיקרוסקופ multiphoton מצויד Ti: מערכת לייזר Sa. המטרה בשימוש היא עדשה 25x הגדלה עם 1.05 NA, מודבקת עם אובייקטדוד אייב להגדיר עד 40 ° C. הטמפרטורה האופטימלית עבור דוד זה נקבע באופן אמפירי להיות בטמפרטורה המתאימה כדי לשמור על הדרמיס האוזן על 37 מעלות צלזיוס, ואולי צריך להיות מותאם לשימוש במערכות הדמיה אחרות. תוכנת הרכישה בשימוש עשוי להשתנות בין מכשירים והתאמות הפרוטוקול ייתכן שתהיה צורך להתבצע לעבוד על אחרת מערכות מוגדרות. ודא כי תמונות ניתן לשמור בפורמט תואם עם כל תוכנה לניתוח רצויה.
- אתר את הדרמיס הדרך העינית ידי צבת המטרה מעל מרכז האוזן והוריד המטרה רק עד שהוא קשר את פני השטח של המים במאגר. השימוש במקור אור חיצוני, להסתכל דרך העיניים ולהמשיך להוריד את המטרה לאט עד פני השטח של האוזן מתחדדים. מנמיכים את הווילונות הפנימיים והחיצוניים סביב הבמה מיקרוסקופ.
- לקבוע הגדרות מיקרוסקופ ולאתר שטח הדמיה
- לפני imaging, להגדיר את הליזר עבור עירור מקסימאלי וזיהוי של fluorophores הרצוי על ידי התאמה אורך גל הליזר עד 900 ננומטר בחלון Controller ליזר MP, כוח הליזר בסביבת הרכישה: חלון ליזר, ואת מתחי PMT בחלון בקרת רכישת התמונה .
הערה: הליך זה משתמש גל עירור של 900 ננומטר עם מסננים כדי לזהות דור הרמוני שני (420-460 ננומטר), CFSE (495-540 ננומטר), ו CMTMR (575-630 ננומטר). ניתן להשתמש תצורות אחרות כדי לזהות fluorophores שונים לפי הצורך. - הגדר את המיקרוסקופ 512 x 512 פיקסלים ברזולוציה, עם זמן להתעכב 2 μsec / פיקסל הגדרת הרכישה: חלונות גודל והמצב. הפעל מצב הדמיה לחיות כדי לאפשר סריקה דרך הרקמה עבור שטח לתדמית ידי לחיצה על "חזור XY". באופן אידיאלי, באזור צריך להיות אחיד יחסית, ללא בועות אוויר, והימנעות תחומי זקיקי שיער צפוף.
הערה: תחליב CFA הוא autofluorescent במאור בירוק ו near-אדום ערוצים יש להימנע. שדה אופטימלי בדרך כלל ניתן למצוא כ 3 מ"מ מהקצה של התחליב. כ -10 - 100 תאים ניתן לעקוב בתמונה אחת. אם יותר מדי תאים נוכחים, תוכנת מעקב תהיה בדרך כלל נתקלת שגיאה בניסיון להפריד תאים סמוכים זה לזה, מה שמוביל מסלולי תא מקוצרים ו / או לא מדויקים. - ברגע בתחום הדמיה מתאים אותר, לקבוע באזור Z כי יהיה צלם באמצעות איתור התא "גבוה" בדרמיס, הגדרה-העמדה ת 0 על ידי לחיצה על כפתור "קבע 0", וגלילה למטה Z כיוון למדוד מידת עומק התא. עומק הדמיה של 35-75 מיקרומטר אופייני. הגדר את עמדות מוצא וסופם הגדרת הרכישה: חלון מיקרוסקופ. התאם את מתח המכשיר PMT וכוח לייזר בחלון "Z מוארת" כדי לייעל להדמיה של תאים ברחבי עומק בתחום ההדמיה.
הערה: הימנע העלאת lasכוח אה מעל 25 מגה ואט עם המדגם, רמות הספק גבוה ככל יכול לגרום נזק חום פציעה סטרילית הדרמיס. דרגת ההספק המרבית המתאימה לכל מיקרוסקופ תשתנה צריכה להימדד. יצוין כי הגדלת כוח לייזר או מתח PMT עם עומק הרקמה אינו מאפשר השוואה כמותית של בהירות התמונה בעומקים שונים בניתוח שלאחר הרכישה. - בדוק את "עומק" ו "זמן" כפתורים מתחת ללחצן "סריקה" בחלון בקרת הרכישה תמונה. גדר מסננת קלמן כדי לסרוק את התמונה 3 פעמים בכל שורה בחוק פיקוח רכישת התמונה: חלון מצב סינון לכוונן את העומק-פרוסת Z של רכישת התמונה: חלון מיקרוסקופ כך זה לוקח בערך 1 דקות כדי ללכוד ערימה שלמה, כפי שצוין בחלון TimeView.
הערה: המרווח בין ערימות לא צריך לקחת זמן רב יותר מאשר כ 1 דק, כמו מרווחי זמן למנוע מעקב של תאים נודדים במהירות. בהתאם ההסוג של תאי דואר להיות הדמיה, זמן זה עשוי צריך להיות מותאם על מנת לאפשר מעקב תאים תקין על ידי תוכנת ניתוח. לא צריכות להיות-פרוסות Z יותר מ -5 מיקרומטר. באופן כללי 15-18 Z-פרוס בין 2-5 מיקרומטר עבה מתאימים מרווח הדמיה 1 דקות.
- לפני imaging, להגדיר את הליזר עבור עירור מקסימאלי וזיהוי של fluorophores הרצוי על ידי התאמה אורך גל הליזר עד 900 ננומטר בחלון Controller ליזר MP, כוח הליזר בסביבת הרכישה: חלון ליזר, ואת מתחי PMT בחלון בקרת רכישת התמונה .
- לכידת תמונה מראש נוגדן זמן לשגות
- לכידת תמונת 5 דקות הזמן לשגות של האזור כדי להעריך את היציבות של הרקמה על ידי קביעת מספר החזרות ל "5" בתוך מסגרת הרכישה: חלון TimeScan ולחיצה על הכפתור "הסרוק".
הערה: רקמות "להיסחף" יכול להיגרם על ידי לא לאפשר מספיק זמן עבור האוזן כדי להגיע לשיווי משקל תרמי, כנת אוזן עניה, או יכולה להיות נובעות מהסטייה מקומית באזור אחד של האוזן. אם תמונת 5 דקות הוא לא יציב, תמונה חבל ארץ חדשה בדרמיס. אם דימוי נוסף באזור חדש נשאר יציב, עדיף לחזור על הכנת האוזן בזהירות הדמיה משלב 3.6 עם cov טריerslip. - אם הרקמה היא יציבה בתמונת 5 דקות, לאסוף תמונת 30-45 דקות הזמן לשגות על ידי קביעת מספר החזרות בין 30 ל 45 ב Setting הרכישה: חלון TimeScan, ניטור לכל להיסחף רקמות קטין כתמונה היא שנאסף. שמור את הקובץ בתבנית התואמת את תוכנת הניתוח לשמש.
הערה: בשלב זה בפרוטוקול, צעדים 4.2.2 - 4.3.2 ניתן לחזור ליעדים רבים תמונה באותה אוזן. עכבר בודד לא צריך להישמר מורדם יותר מ -4 שעות, כמו מוות הוא צפוי להתרחש.
- לכידת תמונת 5 דקות הזמן לשגות של האזור כדי להעריך את היציבות של הרקמה על ידי קביעת מספר החזרות ל "5" בתוך מסגרת הרכישה: חלון TimeScan ולחיצה על הכפתור "הסרוק".
- להזריק נוגדני חסימה ללכוד תמונת פוסט-נוגדן.
- צייר את תערובת נוגדנים לתוך מזרק 1 TB מ"ל ולהסיר את המחט, הקפד להסיר את כל בועות האוויר. לחץ על הבוכנה כך שפתרון הנוגדן יוצר "אגל" בסוף המזרק.
- הרם את וילונות סביב הבמה ולאתר את הקטטר. הסר את PBS-conta המקורימזרק ining מן קטטר. ללא הגדרה את הקטטר למטה, לצרף את המזרק החדש בזהירות המכיל נוגדנים. החזק את קצה הצנתר על המזרק לאט להזריק את תערובת הנוגדן לקטטר. ודא כי אין התנגדות זריקה.
- הגדר את הקטטר למטה ולהוריד את הווילונות סביב הבמה מיקרוסקופ. הערה בזמן ההזרקה ומייד להתחיל לאסוף רצף הדמיה 20-40 דקות חדש באותו המיקום באמצעות אותן גדרות מכשיר כתמונה מראש הנוגדן. שמור את הקובץ בפורמט מתאים עבור תוכנת הניתוח לשמש.
הערה: בין זמן לשגות תמונות, לצפות את העכבר עבור הרדמה ונשימה מספיק. זה לא מומלץ תמונה יותר משדה אחד לאחר נטילה של נוגדנים, כמו שם יכול להיות בשיעורים משתנים של פינוי של הנוגדן.
- להזריק dextran fluorescently שכותרתו לאתר כלי הדם, להעריך patency קטטר, ולמדוד בחדירות כלי lood
- הכן פתרון 2 מ"ג / מ"ל של dextran fluorescently- מצומדות (70,000 מגוואט) ב 100 μl PBS סטרילית לצייר לתוך מזרק, הסרת כל בועות האוויר.
- שימוש באותה טכניקה כמו בשלב 4.4.1-4.4.2, יש להכניס את המזרק על הקטטר להזריק את הפתרון dextran לווריד.
- לכידה בערימה אחת ברזולוציה פיקסל 1024 x 1024 על ידי שינוי רזולוצית הגדרת הרכישה: חלון המצב, עם אותן גדרות PMT ליזר ובאשר הזמן לשגות תמונות. כדי לאסוף את התמונה, בטל את כפתור "הזמן" מתחת ללחצן "סריקה", ולאחר מכן לחיצה על כפתור "סרוק". תמונת 3D זה תאפשר תא דרת T ממוקם בכלי הדם ולהראות כי הקטטר היה פטנט הוכנס כראוי. דיפוזיה של dextran ניאון מתוך הכלי יכול לשמש גם כדי להעריך חדירות כלי דם מקומיות.
הערה: זה ברזולוציה גבוהה (1024 x 1024) תמונה סטטית משמשת prלמטרות esentation ובנוסף ניתן להשתמש לצורך ניתוח של מבנה רקמה באותו אזור כמו זמן לשגות תמונות. לחלופין, תמונה 512 x 512 ניתן לקחת, אשר ניתן למזג עם זמן לשגות תמונות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. הדמית הזמן לשגות של ממשל dextran יכולה גם להיות רצויה, בהתאם לצרכי המחקר של מעבדות פרט. במקרה זה, התמונה צריכה להיות להגדיר בתור בצעדים 4.2.3-4.3.2.
- לאחר השלימה הדמיה, להסיר בזהירות את העכבר מתחת אובייקטיבי לגולל את שמיכת המים. הסר את coverslip מפלטפורמת ההדמיה על ידי חיתוך הקלטת והרמת הכוס בעדינות עד שהוא מתנתק. בעוד העכבר הוא עדיין מורדם, לנתק את האוזן מן coverslip. אם זה להיות הליך מסוף, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. אם חיסכון העכבר הזה עבור הדמיה חוזרת ונשנית, להחזיר אותו לכלוב נקי להפריד מעכברים אחרים ולבחון עד העכבר יכול לתקן את עצמו והואאמבולטורי. לאחר התאושש מההרדמה, העכבר ניתן להחזיר לכלוב עם בעלי חיים אחרים.
- לייבא את קבצי ההדמיה לתוך תכנית ניתוח תמונה ולבצע תיקונים רצויים. הימנעות של שיפורים שאינם ליניארי ותוכניות הפחתה החלקה או רעש אוטומטי ואלגוריתמים מומלצת. בדרך כלל, תמונות צריכות רק תיקון רקע קטין על ידי הגדלה ידנית הנקודה השחורה של התמונה לפני הניתוח. לנתח את הנתונים הדמיה באמצעות תוכנית תא-מעקב אוטומטי עם תיקון ידני, כמו אוברסטריט, Gaylo ואח 30.
הערה: יש תמונה רבות סוויטות ניתוח זמינות, הוא מקור הקניינים פתוח, שניתן להשתמש בם כדי לכמת דינמיקת תא מתמונות multiphoton נגזרו בפרוטוקול זה. השיטה המדויקת של ניתוח תמונה ואת חבילות תוכנה האופטימליות לשמש יהיו תלויות צרכי המחקר של מעבדות פרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת ללמוד תגובות חיסוניות באתרו מבלי לשנות את הסביבה החיסונית חיונית בלימוד אינטראקציות בזמן אמת של תאי מפעיל T עם רקמה דלקתית. הדמיה של הדרמיס האוזן ללא פגע על ידי פרוטוקול זה, המתואר באיור 1 א 'וב', מאפשרת ההדמיה של תאי מפעיל T שסומנו הועברו fluorescently ב interstitium עורי. הליך זה יגרום גם ברזולוציה גבוהה (איור 1 ג) ו הזמן לשגות (האיור 1D, סרט 1) תמונות של דינמיקת תא מפעיל T בדרמיס המוסת.
איור 1. ברזולוציה גבוהה הדמית 4D של תאי מפעיל T ב interstitium עורי ללא פגע. (א) מתאר ניסיוני. צילום (B) של prepar אוזןed הדמיה עם האתר של התחליב (שחור קו מקווקו) ואזור אופטימלי עבור הדמיה (קו אדום) מצוין. (C) הקרנת 3D המקסימאלי של ערימה ברזולוציה גבוהה מראה תאי Th1 CFSE שכותרתו (ירוק), אות הרמונית שנייה קולגן הסיבי (כחולה) וטקסס האדומה-Dextran שכותרתו כלי דם (אדום). החץ הלבן מצביע אחד מכמה זקיקי שיער autofluorescent. ברי סולם מייצגים 50 מיקרומטר (D) נתיבי נדידה של תאי Th1 במעקב למשך 30 דקות בדרמיס-דלקה CFA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרוטוקול הדמיה זה מחייב שימוש פלטפורמת הדמיה מיוחדת שנבנתה בתוך הבית, כמו גם nosecone מותאם עבור המשלוח של הרדמה נשאפת תוך הדמיה. פלטפורמת ההדמיה (איור 2 א-ב) מורכב of צלחת בסיס אלומיניום עם קטע מרכזי עלה. סעיף גייסה זה יש חלק הבלעה מרופד אקריליק הרגיש לספק תמיכה לאוזן מבלי לדחוס ואפשרות פגיעה ברקמה הדקה. הגיאומטריה של ההגדרה שלנו נדרש לבניית nosecone גמישה מתכווננת לספק הרדמה בשאיפה במהלך ההדמיה. Nosecone זה, מורכב צינור microcentrifuge שונה מחובר סעיף 50 מ"מימ של צינורות גמישים (איור 2 ג), מאובטח במקום עם בעל מורכב צינורות microcentrifuge שונה (איור 2 ד) ו מודבק פלטפורמת ההדמיה באמצעות קרס אטב לולאה . שימוש אטב קרס בלולאה מאפשר מחדש של אסיפת nosecone כך גם אוזן של עכבר ניתן הדמיה, והוא יכול להיות ממוקם בצורה אופטימלית עבור עכברים בודדים.
איור 2. שוהpment הדמיה intravital. פלטפורמת הדמיה בהתאמה אישית ב העליון (א) ו בצד (B) נופים. Nosecone עבור הממשל isoflurane (C) בעל nosecone (ד '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צנתור של וריד הזנב מאפשר גישה רציפה אל המחזור לנהל נוגדנים ומולקולות קטנות אחרות שיכולים לנטרל מתוך כלי הדם, או מולקולות ניאון גדולות כגון dextran משקל מולקולרי גבוה לתייג כלי דם. לאחר השימוש של 100 מיקרוגרם של אנטי-β 1 ואנטי-β 3 integrin חסימת נוגדנים דרך קטטר, מעצר תאי ניע בעבר בתוך הדרמיס (סרט 2). יש תאים אלה יש מהירות ממוצעת ירד לאחר נוגדן ממשל (איור 3 א), וכן ירידה משמעותית במדד מתפתל, היחס בין העקירה המוחלטת אורך המסלול הכולל (איור 3 ב).
מנהל איור 3. של-β נגד 1 ואנטי-β 3 נוגדנים מעכבים גירת תאי Th1 בעור-דלק CFA. (א) מהירות ממוצעת של תאי Th1 לפני ואחרי מתן 100 מיקרוגרם integrin אנטי β 1 ואנטי-β 3 חסימת נוגדנים. (ב) מדד מתפתל של תאי Th1 לפני ואחרי מצור נוגדן. כ 100 תאי מעקב הם מתמונות לפני ואחרי מצור נוגדן מתוך עכבר אחת בניסוי אחת מייצג. סטטיסטיקות על ידי מאן ויטני.es / ftp_upload / 53,585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בגלל השיער לא הוסר מפני השטח של האוזן, חפצי הדמיה מהשיער נפוצים. Autofluorescence מן זקיקי השיער (איור 4 א) ו הצללה ו autofluorescence מהשיער שמעליה (איור 4B) יש להימנע במידת האפשר כפי שהם יכולים לטשטש תאי T ולהפריע תוכנת ניתוח התמונה אוטומטית. באופן דומה, בועות אוויר שנלכדו בין משטח האוזן ואת coverslip יכולות להוביל חפצי הדמיה (איור 4C). הכנה נכונה של האוזן צריכה לצמצם את המספר והגודל של כל בועות נותרות.
איור 4. ממצאים נפוצים מ autofluorescence שיער מראש אוזן ענייםparation. (א) זקיקי השיער autofluorescent. (ב) זקיקי שיער ושיער autofluorescent (ירוק) וקולגן (לבן) עם צללי שיער שמעליה, גרימת קווים כהים בתמונה. (ג) חפץ מן בועת אוויר, מראה את קצה האפידרמיס keratinized העקור, autofluorescent (קו מקווקו). ברי סולם מייצגים 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בנוסף, השימוש של מקורות החום מרובים יכול לגרום לבעיות עם יציבות של הרקמה עקב התפשטות תרמית והתכווצות. הגדרות תרמוסטט שגויות, למשל, יכולות להוביל תנודות גדולות במהלך הדמיה שיכולה לעשות פרשנות של תוצאות קשות (סרט 3). זה חיוני כדי לקבוע את ההגדרות האופטימליות עבור כל מערכת המספקת טמפרטורה קבועה למקסימום יציבות. ultimatאיליי, תא הדמיה טמפרטורה מבוקרת היא הדרך הטובה ביותר להסיר השתנות משינויים בטמפרטורה.
סרט 1. תאי Th1 נודדים בדרמיס CFA-הדלקתית (קליק ימני להוריד). 30 דקות זמן לשגות תמונה מראה תאי Th1 (ירוק) נודדים ברשת הקולגן בדרמיס (דור הרמוני שני, כחול).
סרט 2. מעצר תאי Th1 על המצור של β 1 ובטא 3 integrins (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). תאים (ירוק) היו צילמו במשך 30 דק 'לפני administמנה של נוגדנים חוסמים, ולאחר מכן צלמתי במשך 20 דקות אחרות באותו המיקום.
סרט 3. תנודות מתוך צלחת חימום מבוקר היטב (קליק ימני להוריד). 30 דקות זמן לשגות תמונה של תאי Th1 (ירוק) ו דור הרמונית השני (כחול). אחרי תמונה זו נאספה, צלחת החימום בשימוש נמצאה תרמוסטט פגום, גרימת תנודות בטמפרטורה של פלטפורמת הדמית התפשטות תרמית עוקבת והתכווצות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מַשְׁמָעוּת
כאן אנו מציגים פרוטוקול מלא עבור להדמית 4D של עבירה, מפעיל-specific antigen תאי Th1 בדרמיס אוזן עכבר השלם. שיטה זו מספקת יתרונות על פני כמה שיטות הדמיה נוכחיות מכמה סיבות. על ידי הדמית הדרמיס אוזן הגחון, אנו מסוגלים לוותר על הסרת שיער כי נדרשה עבור פרוטוקולי הדמיה מעורבים אתרי עור אחרים. למרות מסירי שיער הם קלים בדרך כלל, הם הוכחו לגרום להפרעת מחסום העור 42, תהליך שיכול לעורר תגובה חיסונית 43,44. By גם הימנעות ניתוחים פולשניים לחשוף הדרמיס או hypodermis, פרוטוקול זה מונע דלקת הנגרמת הנזק ואת גיוס מהיר של נויטרופילים 37 ותאי חיסון אחרים לתוך הדרמיס. השימוש צנתר ורידי במערכת זו כדי לספק נוגדנים חוסמים נגד מולקולות מפתח מאפשר לחקירה בזמן אמת של DYNA התנהגות מיקרופון של תאי CD4 T. השימוש בפרוטוקול הדמיה זו חשפה דרישות קריטיות עבור תנועתיות ביניים תא CD4 T 30 כי לא התגלו מערכות במבחנה 8.
צעדים קריטיים בהליך
צעד חיוני בכל פרוטוקול הדמית הבטחת הכנת רקמות יציבה הדמיה. חשוב לוודא שיש מספיק PBS בין האוזן לבין coverslip כי אין בועות אוויר לאוזן, היא במגע עם הזכוכית, אבל לא כל כך הרבה כמו לגרום הקלטת להיות דה-דבק ממשטח הזכוכית. בדומה לכך, הימנעות ממגע בין הסרט מחזיק את coverslip לפלטפורמה וכל גריז ואקום ימנע את סרט התרופפות לאורך זמן. הטמפרטורה חייבת להיות גם נשמרה קבועה כדי למנוע תנודות ולהיסחף מהתכווצות או התפשטות תרמית של חומרי הפלטפורמה.
מגבלות ושינויים
תחת = "jove_content"> הדמיה על ידי פרוטוקול לא פולשנית זו מוגבלת לאזורי עור כי הם דקים מספיק כדי לאפשר הדמיה אפקטיבית של קרינה באמצעות עירור multiphoton. האוזן היא יתרון בשל קלות ההכנה ויכולת להיות מבודד תנועות הנשימה, ויש בו נעשה שימוש כמודל הדמיה זמן לשגות intravital מאז 1980 45. עם זאת, האוכלוסייה החיסונית תושב האוזן היא נבדל עור בכנף או השודדת 46, ואת אוזן העכבר בעל תכונות וסקולרית מובהקות בהשוואה לאתרים אחרים 47. לכן, עבור יישומים מסוימים, השוואה של נתוני הדמית אוזן לאתרי עור אחרים עלולה להיות קשה.
פרוטוקול זה דורש גם את ההגירה היעילה של תאי מפעיל T הועברו מתוך זרם הדם לתוך הדרמיס. זה מגביל את היכולת להשתמש בתאים שיש פגמים ביות או extravasation כפי שהם לא יוכלו להיכנס במרחב הבין תחומי. extravasationאפשר לעקוף על ידי הזרקת תאים ישירות לתוך הדרמיס האוזן 37,48, אם כי זה יהיה לגרום נזק מכני ואספקה של תאים בדרך זו לא יכול לשחזר את לוקליזציה או התנהגותם של תאים שעוברים ב extravasation vivo.
זה גם קריטי לשקול שימוש בעכברים הנמען הלא פיגמנט לניסויים הדמיה, כגון זן BALB / c משמש כאן או אלבינו C57BL / 6- Tyr עכברים ג-2J. המלנין בעכברים פיגמנט, בנוסף להיותו autofluorescent מאוד, מתחמם מתחת אפילו יחסית עירור צריכת חשמל נמוכה מלייזר multiphoton 37. זה יכול לגרום לנזק תרמי על דלקת העור ולאחר 36 או פלורסנט שניקרו 31, שמסבך תוצאות. הדבר עלול להגביל fluorophores שניתן להשתמש בהם בניסוי הדמיה רב פרמטר. עם זאת, כמה מולקולות ניאון בהירות מאוד או מאוד הביעו יכולות להיות נרגשות ביעילות בהספק ליזר נמוך, כלבשל להדמיה יעילה בעכברים פיגמנט.
יישומים עתידיים
מכיוון שמדובר בהליך לא פולשני, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור מחקרים ארוכים טווח על עכברים עם הדמיה רציפה על פני תקופות זמן ממושכות. בעוד תיוג פלורסנט כמתואר כאן יימוגו על פני תקופות זמן רבים יותר מאשר 3-4 ימים, שימוש בתאי ניאון אנדוגני או תאי כתב ניאון מבטל את הבעיה. אכן, יש לנו בעבר השתמשו בפרוטוקול זה כדי לעקוב אחר שנוצר vivo- effectors אנטיגן ספציפי נושאות לכתבים ציטוקינים, כולל הכתב IFNγ Yeti 30,49 ו- IL-4 לכתב 4get 50. בנוסף יש לנו דמיינו תאי CD4 אנדוגני בעכברים כתב ניאון CD4-Cre ROSA26-stop-floxed EYFP 30. ככל תכונות הניאון של EYFP וחלבוני ניאון אחרים נבדלות בצבעים כימיים כגון CFSE, שינויים בפרמטרי ההדמיה עשויים להיות נחוציםלהדמיה יעילה. שינויים כגון הגדלת זמן להתעכב פיקסל יכול לשפר אות הניאון של כמה fluorophores עמום, ולהקטין את משך תמונות זמן לשגות יכולים להמתיק כל photobleaching כי אפשר לראות. ב 900 עירור ננומטר, שלא הבחנו photobleaching משמעותי בעבר של CFSE, CMTMR, או EYFP על מרווחי הדמיה קצר.
למרות הליך זה מתמקד במדידת הדינמיקה של תנועתיות תא CD4 מפעיל T, זה אינו מוגבל בבקשה זו. העבודה נמשכת כיום למדידת אינטראקציות הדינמיות של תאי T מפעיל עם אנטיגן הצגת תאים באמצעות עכברי כתב ניאון הזרקת נוגדני מצומדות fluorescently לתוך הדרמיס לתייג תאים או מבני רקמות לפני הדמית 51,52. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הקטטר כדי לספק נוגדנים חוסמים תוך הדמיה, תרכובות אחרות, כולל מעכבי מולקולה קטנה, יכוללהינתן. בסופו של דבר, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה גמישה למדוד דינמיקה חיסונית לאורך זמן, in vivo, באופן לא פולשני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים אוניברסיטת מתקן Core רוצ'סטר multiphoton מיקרוסקופ לעזרה עם הדמיה לחיות. נתמך על ידי NIH AI072690 ו AI02851 כדי DJF; AI114036 כדי AG ו AI089079 כדי MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
