Summary
I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.
Abstract
La capacità delle cellule T CD4 per svolgere funzioni effettrici dipende dalla migrazione rapida ed efficiente di queste cellule in tessuti periferici infiammati attraverso un meccanismo non ancora definito. L'applicazione della microscopia multiphoton allo studio del sistema immunitario fornisce uno strumento per misurare la dinamica delle risposte immunitarie all'interno tessuti intatti. Qui vi presentiamo un protocollo per l'imaging non invasivo intravitale multifotonica delle cellule T CD4 nel derma per le orecchie del mouse infiammate. Uso di una piattaforma di imaging personalizzato e un catetere venoso permette la visualizzazione delle dinamiche di cellule CD4 T nell'interstizio dermico, con la possibilità di interrogare queste cellule in tempo reale mediante l'aggiunta di anticorpi bloccanti di componenti molecolari coinvolti nella motilità. Questo sistema fornisce vantaggi rispetto ai due modelli in vitro e procedure di imaging invasivi di tipo chirurgico. La comprensione dei percorsi utilizzati dalle cellule T CD4 per la motilità può infine fornire una conoscenza delle basifunzione c di cellule CD4 T e patogenesi di entrambe le malattie autoimmuni e patologia da infezioni croniche.
Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Rochester, e condotte in stretta conformità con la legge sulla protezione degli animali e la politica Public Health Service su Humane cura e l'uso di animali da laboratorio amministrato dal National Institutes della Salute, Ufficio di laboratorio Animal Welfare.
1. Preparazione di cellule effettrici T CD4
NOTA: BALB / c topi DO11.10 TCR-transgenici che riconoscono specificamente un peptide da ovalbumina uovo di gallina (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Altri sistemi di TCR-transgenici possono essere sostituiti, con il peptide cognate appropriata al posto di POVA dove indicato.
- Purificare cellule T CD4 naive
- Eutanasia un 6-8 settimane di età femminile / c del mouse DO11.10 BALB esponendolo alla 2 L / min CO 2 fino a quando il mouse non mostra segni di movimento o di respirazione per 1 min, seguita da dislocazione cervicale, o in relazione allale linee guida della Commissione istituzionale cura degli animali e uso locale. Spruzzare il mouse con una soluzione di etanolo al 70% e fare un'incisione circa 7 cm di pelle dal mento del topo a 2/3 della discesa dell'addome. Rendere 2-3 incisioni cm pelle dall'estremità dell'incisione nell'addome verso i piedi posteriori. Fare attenzione a non tagliare nel peritoneo.
- separare con cura la pelle dal peritoneo tirando delicatamente con una pinza. I linfonodi inguinali si trovano sulla pelle vicino alla giunzione delle zampe posteriori con il corpo. Togliere afferrando e tirando con una pinza e posto in 8 ml di HBSS integrate con il 2% di siero di vitello neonato (NCS).
- Raccogliere le ascellari e linfatici brachiale nodi dal mouse afferrando e tirando delicatamente con una pinza. Mettere in HBSS + 2% NCS con i linfonodi inguinali.
- Raccogliere i linfonodi cervicali profondi e superficiali situate nel collo del mouse con una pinza e posto in HBSS + 2% NCS con l'oti suoi linfonodi.
- Delicatamente tagliare nel peritoneo, facendo attenzione a non tagliare nell'intestino. Afferrare il cieco e del colon con una pinza ed esporre i linfonodi mesenterici che si trovano proprio lungo il colon. Rimuovere con attenzione i linfonodi mesenterici con una pinza e posizionare con gli altri linfonodi.
- Individuare la milza nella cavità peritoneale e rimuovere con cautela, tenendola con una pinza e taglio del tessuto connettivo via con un paio di forbici chirurgiche. Posizionare la milza con linfonodi.
- Preparare una sospensione di cellule singole versando i + 2% NCS HBSS contenenti i milza e nei linfonodi in un colino di metallo collocato in un piatto di coltura di 60 x 15 mm. schiacciare delicatamente i milza e nei linfonodi attraverso il filtro metallico con lo stantuffo di una siringa da 10 ml in HBSS + 2% NCS.
- Utilizzando una pipetta, spostare la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml centrifuga pulita. Lavare il filtro in metallo e piatto di cultura, con altri 10 ml di HBSS + 2% NCS, ucantare una pipetta e posizionare questa soluzione nello stesso 50 ml provetta da centrifuga come sospensione cellulare.
- Spin le cellule a 600 xg per 5 minuti per agglomerare le cellule e risospendere in 10 ml di HBSS + 2% NCS pipettando delicatamente. Salvo diversa indicazione, tutti centrifugazione deve essere eseguita a 600 xg per 5 min.
- Diluire 10 ml di sospensione cellulare in 90 ml di 0,1% trypan blu in PBS per una diluizione 1:10. Trasferire 10 ml di cellule in trypan blu su un emocitometro pipettando la soluzione nella scanalatura sul bordo del emocitometro. Contare le cellule bianche del sangue nella griglia centro del emocitometro, ignorando gli eritrociti che appaiono come leggermente più piccolo, rotondo, globuli rossi-color e blu morti / cellule morenti. Moltiplicare il numero di cellule contate da 10 4, per il fattore di diluizione (10), e il volume delle celle (10 ml) per determinare il numero totale di cellule raccolte nella provetta da centrifuga da 50 ml.
- Per arricchire di cellule T CD4, centrifugare lacelle a pellet e risospendere le cellule a 2x10 7 cellule / ml in una soluzione contenente circa 1 ug / ml di anti-CD8 (clone 3.155), 1 mg / ml di anti-MHC di classe II (clone M5 / 114), e 1 mg / ml di anti-CD24 (clone) J11d anticorpi in HBSS + 2% NCS pipettando delicatamente.
NOTA: Gli anticorpi utilizzati in questa fase sono derivati in-house da linee cellulari di ibridoma e le concentrazioni sono approssimate. La concentrazione e il volume di questi anticorpi ideali per complemento lisi sono stati determinati empiricamente e varieranno tra laboratori. In alternativa, diversi kit disponibili in commercio sono disponibili per la purificazione delle cellule CD4 T naive e possono essere sostituiti per la lisi del complemento e processo di purificazione CD62L + qui rappresentata. Se si utilizza un altro metodo per purificare le cellule CD4 T naive, questo protocollo può essere continuata a partire dal punto 1.2. - Incubare in ghiaccio per 30 min. Alla fine di questa incubazione, rapidamente scongelare complemento di cavia mettendo a 37 ° C dell'acqua bath per circa 2 min. Aggiungere 100 ml di complemento per ogni 1 ml di cellule in soluzione di anticorpo pipettando complemento direttamente nella sospensione cellulare. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min.
- Aggiungere HBSS + 2% NCS per portare le cellule ad un volume totale di 20 ml in provetta da centrifuga. Strato in 8 ml di RT supporti densità centrifugazione (densità 1,086 g / ml) sotto le cellule. centrifugare immediatamente le cellule a 1400 xg a temperatura ambiente per 15 minuti con il freno centrifuga off.
- Raccogliere le cellule a livello di interfaccia utilizzando un sierologici cellule pipetta e trasferire in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Lavare le cellule portando il volume nella provetta da centrifuga da 50 ml con HBSS + 2% NCS e centrifugazione.
- Risospendere le cellule in tampone MACS (PBS integrato con il 2% NCS e 2 mm EDTA) pipettando delicatamente e contare come in precedenza, al punto 1.1.10.
- Per arricchire di cellule T CD4 naive, sospendere nuovamente le cellule a 2x10 7 cellule / ml in una soluzionedi 2,5 ug / ml biotina-coniugato anticorpo anti-CD62L in tampone MACS, in base al numero contato nel passaggio 1.1.16. Incubare per 30 minuti in ghiaccio.
- Lavare le cellule aggiungendo 10 ml MACS buffer, centrifugazione le cellule. Risospendere le cellule a 10 7 cellule / 100 microlitri di tampone MACS e aggiungere perline separazione magnetica streptavidina coniugata ad una diluizione 1:10 direttamente alle cellule. Incubare in ghiaccio per 20 min.
- Lavare le cellule come prima, nel passaggio 1.1.17, e risospendere le cellule a 2x10 8 cellule / ml in tampone MACS, in un volume minimo di 500 microlitri.
- Inserire una colonna di separazione magnetica nel supporto del magnete e lavare la colonna lasciando 3 ml MACS buffer di fluire attraverso. Applicare le cellule per la colonna con una pipetta.
- Lavare la colonna per rimuovere le cellule non vincolati dalla colonna magnetica pipettando 3 ml MACS tampone sulla colonna e permettendo il buffer MACS di fluire attraverso, e ripetere per 3 volte. Gettare il flusso attraverso frazione.
- Remove la colonna dal supporto magnetico e rinviare un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Pipettare 5 ml di tampone MACS nella colonna e utilizzare lo stantuffo in dotazione con la colonna per spingere i MACS tampone attraverso la colonna per liberare le celle della colonna legato e raccogliere il flusso attraverso che contiene le cellule T CD4 naive arricchito.
- Centrifugare le cellule e risospendere in 10 ml RPMI supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 IU / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 50 mM 2-mercaptoetanolo (RPMI-10). Contare le celle di prima, al punto 1.1.10.
- Regolare la concentrazione finale delle cellule T CD4 naive a 6x10 5 / ml in RPMI-10.
- Purificare T-cellule impoverito APC milza
- Euthanize un 6-8 settimane di età femminile wild-type BALB / c del mouse come al punto 1.1.1.
- Spruzzare il mouse con una soluzione di etanolo al 70% ed esporre la milza facendo un'incisione di circa 3 cm sul lato sinistro della abdome del topon. Taglio aperto lo strato peritoneale e rimuovere la milza afferrandola delicatamente con una pinza e taglio via dal tessuto connettivo sottostante con un paio di forbici chirurgiche.
- Posizionare la milza in 8 ml di HBSS + 2% NCS.
- Preparare una sospensione di cellule singole schiacciando milza, lavare e contare le cellule, come prima, in passi 1.1.7-1.1.10
- Deplezione delle cellule T dal giro delle cellule a 600 xg per 5 min a pellet, e risospendere le cellule a 2x10 7 in una soluzione di circa 1 mg / ml anticorpo anti-Thy1.2 (J1J clone) pipettando delicatamente. Incubare le cellule in ghiaccio per 30 min.
NOTA: L'anticorpo è stato derivato in-house da una linea cellulare di ibridomi e la concentraton è approssimata. La concentrazione e il volume di questo anticorpo ideale per complemento lisi è stato determinato empiricamente e varieranno tra laboratori. Altri metodi per APC di purificazione da splenociti possono essere sostituiti se lo si desidera. le cellule T naive e APC devono essere preparati in cultoure dal punto 1.3. - Aggiungere complemento cavia, incubare, e separare le cellule su un supporto gradiente di densità centrifugazione come prima, nei passaggi 1.1.13-1.1.14.
- Risospendere le cellule in 10 ml di RPMI-10 e irradiare le APC ponendo le cellule in una provetta da centrifuga da 50 ml in un irradiatore gamma per una lunghezza di tempo che esporre le cellule a 25 Gy radiazioni. Questo periodo di tempo può variare in base alla irradiatore e dovrà essere calcolato ogni volta che le cellule sono irradiate.
- Contare le cellule su un emocitometro come prima, nel passaggio 1.1.10, e regolare le cellule APC ad una concentrazione finale di 2.4x10 6 cellule / ml in RPMI-10.
- Stimolare le cellule e differenziare le cellule T CD4 ad un fenotipo Th1 in una cultura di 5 giorni.
NOTA: Anche se vi presentiamo qui un protocollo per la preparazione e l'imaging effettori Th1 generati dalle cellule CD4 T naive, questo protocollo può essere regolato per differenziare le cellule naive ad un fenotipo diverso, o to utilizzare altri tipi di cellule, come le cellule T CD8. Condizioni per priming e differenziazione dovranno essere determinati empiricamente.- In ogni pozzetto di un piatto della cultura 24 pozzetti, unire 500 ml di cellule CD4 T naive e 500 l di APC irradiati in ogni pozzetto, per un totale di 3x10 5 cellule T e 1.2x10 6 APC per bene.
- Preparare una soluzione in RPMI-10 contenente 2 mM cognate peptide OVA, 20 U / ml IL-2 ricombinante, 80 ug / ml di anti-IL-4 (clone 11B11) e 40 ng / ml ricombinante IL-12 e del filtro con un 0,2 Filtro siringa micron. Aggiungere 1 ml di questa soluzione in ogni pozzetto di cellule, per un volume totale di 2 ml in ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° al 5% di CO 2 per 3 giorni.
- Il giorno 3, dividere le culture pipettando delicatamente per risospendere le cellule e lo spostamento 1 ml di ogni bene in una nuova cultura bene. Portare ciascun pozzetto per un volume finale di 2 ml aggiungendo 1 ml / pozzetto di RPMI-10 + 20 U / ml IL-2 ricombinante. </ Li>
- Riportare le piastre per l'incubatore e permettono alle cellule di espandersi fino al giorno 5.
2. Il trasferimento di cellule e induzione di infiammazione
NOTA: per il numero di cellule ottimali per l'imaging, 5x10 6 cellule Th1 fluorescente dovrebbero essere trasferiti in ogni mouse in un volume totale di 200 microlitri di PBS. Le cellule qui sono etichettati con il CFSE colorante verde o la tintura CMTMR quasi rosso, anche se altri coloranti Tracker cellulare può essere utilizzato. CFSE e le cellule CMTMR-etichettati possono essere co-trasferite per consentire il monitoraggio di due popolazioni distinte CD4 effettrici.
- Le cellule T effettrici Etichetta con CFSE
- Raccogliere le cellule dai piatti della cultura vigorosamente pipettando le cellule in ciascun pozzetto e trasferimento in un tubo da 50 ml centrifuga sterile con una pipetta. Contare le cellule come al punto 1.1.10, quindi centrifugare e risospendere le cellule a 10 7 cellule / ml in PBS + 5% NCS.
- Diluire 5 mM soluzione madre CFSE 1: 100 inPBS. Aggiungere 110 microlitri soluzione CFSE per ogni 1 ml di cellule mettendo una goccia di soluzione CFSE sul lato del tubo e poi rapidamente dondolo tubo avanti e indietro per mescolare completamente.
- Incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente, quindi spegnere il CFSE aggiungendo 5 ml di siero fetale di vitello (FCS) direttamente al tubo di cellule. Portare al volume di 50 ml con PBS + 5% NCS.
- Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 20 ml di PBS + 5% NCS. Ripetere questa operazione altre due volte per lavare le cellule 3 volte totale. Contare le cellule su un emocitometro, come prima, nel passaggio 1.1.10, e risospendere le cellule in PBS sterile a 2.5 x 10 7 cellule / ml per il trasferimento in topi.
- Le cellule T effettrici Etichetta con CMTMR
- Raccogliere le cellule come sopra al punto 2.1.1, poi contare, centrifugare e risospendere le cellule a 10 7 cellule / ml in RPMI-10.
- Aggiungere 10 mM soluzione stock CMTMR direttamente alle cellule per una concentrazione finale di 10 pM. esimo rapidamente pipettae cellule per mescolare completamente nel CMTMR e impediscono la precipitazione del colorante.
- Incubare 30 min in un bagno d'acqua C 37 °. Lavare le cellule 3x in PBS + 5% NCS come prima, al punto 2.1.3-2.1.4. Contare e risospendere le cellule in PBS sterile a 2.5x10 7 cellule / ml per il trasferimento a topi.
- cellule T effettrici di trasferimento per Naïve 6-8 settimane di età femminile topi BALB / c.
- Tracciare la sospensione cellulare (fase 2.1.4 o 2.2.3) in una siringa, avendo cura di rimuovere tutte le bolle tenendo la siringa side-up, muovendo delicatamente il lato della siringa e spostando il pistone su e giù, se necessario .
- Mettere i topi in una gabbia pulita e il calore dolcemente sotto una lampada di calore fino a quando la vena della coda appare vasodilated. Posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta e pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Iniettare lentamente 200 ml di sospensione cellulare nella vena della coda laterale. Non ci dovrebbe essere nessuna resistenza a iniezione o immissione visibile sotto la pelle.
- Indurre l'infiammazione cutanea immunizzando con adiuvante completo di Freund (CFA)
NOTA: In questo protocollo, l'infiammazione è indotta da iniezione intradermica di CFA emulsionato con l'antigene o affine o non cognate. Altri modelli infiammatori possono essere sostituiti, anche se sarà necessario regolare empiricamente il numero di cellule necessario per il trasferimento e la tempistica di imaging.- Preparare una soluzione 200 micron di OVA peptide in PBS sterile in una provetta. Pipettare un volume equivalente di CFA in cima alla soluzione peptide.
- Emulsionare la soluzione disegnando in un 28 G1 / 2 di insulina siringa e poi precipitare la soluzione nella provetta, quindi ripetendo questa azione di circa 20 volte. Quando è completamente emulsionato, la CFA e soluzione peptide formeranno un impasto denso e opaco.
NOTA: è indispensabile utilizzare una siringa con ago fisso insulina per formare l'emulsione, come l'emulsione verrà perso nel spazio morto in un needl non fissae siringa. - Testare l'emulsione facendo cadere una piccola quantità su acqua posto in una capsula di Petri. L'emulsione deve rimanere intatto e non disperdere in acqua.
- Disegnare l'emulsione in un 300 ml 28 G1 / 2 siringa da insulina e premere bruscamente lo stantuffo per rimuovere grosse bolle d'aria.
- Subito dopo il trasferimento di fluorescente cellule T effettrici, anestetizzare i topi mediante iniezione ip di 2,2,2-tribromoethanol a 240 mg / kg. Valutare l'anestesia da un pizzico punta dolce, la somministrazione di più 2,2,2-tribromoethanol con incrementi di 1 mg, se necessario.
NOTA: altri anestetici approvati può essere sostituito per l'2,2,2-tribromoethanol. - Collocare un ditale sul dito indice sinistro e afferrare attenzione orecchio del mouse tra il pollice sinistro e l'indice con l'orecchio ventrale rivolto verso l'alto. Assicurarsi di non esercitare una pressione eccessiva su un orecchio, che può causare danni meccanici alla pelle.
- Far scorrere l'ago che contiene il CFA emulsion nel derma, lato smusso rivolto verso l'alto, e iniettare lentamente 10 ml di emulsione nell'orecchio. Posizionamento del iniezione deve essere in esterna 1/3 del padiglione auricolare, leggermente fuori centro per consentire l'imaging ottimale.
- Monitorare i topi fino a quando l'anestesia ha portato fuori e topi sono in grado di destra se stessi e sono ambulatoriale. topi Immagine 3 giorni seguenti la vaccinazione, fornendo il tempo per l'infiammazione di sviluppare e le cellule T trasferite al traffico al derma per le orecchie.
NOTA: I topi non possono essere lasciati incustoditi in qualsiasi momento mentre sotto anestesia.
3. Preparazione del mouse for Imaging
- Preparare un catetere
- Rimuovere con attenzione l'ago di metallo da 30 G1 / 2 tubercolinico (TB) ago della siringa con una pinza e pulire la colla in eccesso, utilizzando un ambito dissezione di visualizzare che la colla è completamente rimosso.
- Tagliare la punta di un altro / 2 TB ago della siringa 30 G1, assicurando che l'ago rimanente è ancora patent mediante ispezione visiva. Infilare un pezzo 18 cm di PE-10 tubo medico sull'ago rifilato, e con attenzione inserire l'ago di metallo nudo circa 5 mm nell'altra estremità del tubo, creando un catetere.
- Lavare il catetere compilando un TB siringa da 1 ml con PBS sterile, rimuovendo eventuali bolle d'aria. Posizionare delicatamente il catetere sulla punta della siringa e spingere delicatamente PBS se il catetere per eliminare le bolle nel tubo.
NOTA: quando si spinge il fluido attraverso il catetere, è essenziale per mantenere il catetere sulla siringa per evitare che la pressione del fluido di spingere il catetere fuori della siringa. - Mettere i topi in una gabbia pulita e il calore dolcemente sotto una lampada di calore fino a quando la vena della coda appare vasodilated. Anestetizzare il mouse con una miscela di aria ambiente e isoflurano (5% induzione, 1-2% manutenzione, a 2 L / min di portata), erogata attraverso il gruppo nosecone che sono stati associati al vaporizzatore isoflurano. Assicurarsi che il mouse è anestetizzato with un pizzico punta dolce. Aumentare in misura apprezzabile la portata isoflurano dello 0,1% se si osserva il movimento. Coprire gli occhi con pomata oftalmica per prevenire l'essiccazione e lesioni mentre il mouse è anestetizzato.
NOTA: E 'essenziale che i topi mai essere lasciati incustoditi durante anestetizzato. I topi deve essere frequentemente monitorato per l'anestesia sufficienti per gentile pizzico punta. - Immobilizzare la coda alla base con un paio di pinze, e quindi pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Far scorrere delicatamente il catetere nella vena della coda laterale e controllare la pervietà spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa. Non ci dovrebbe essere alcuna resistenza al movimento e non spumeggiante visibile di PBS sotto la pelle, se è opportunamente collocato. Fissare il catetere alla coda applicando 1-2 gocce di tessuto adesivo cianoacrilato al sito di iniezione e lasciare asciugare, di circa 30 sec.
- Rifilare con cura i capelli dalla parte posteriore e laterale dell'orecchio con un paio di forbici, facendo attenzione a non danneggiare la ska. Tagliare i baffi pure. Usando un tampone di cotone, inumidire la superficie interna dell'orecchio con PBS.
- Ruotare il mouse e orecchio su un 24 x 50 mm copertura in vetro No. 1.5 slittamento. Utilizzando pinze, appiattire delicatamente l'orecchio sul vetrino, spostando il mouse, se necessario per garantire che l'orecchio è a filo con il vetro. Rimuovere l'eccesso di PBS dall'orecchio tamponando delicatamente con un tessuto wipe.
NOTA: Assicurarsi di non premere troppo saldamente sull'orecchio, come la pelle sottile può essere facilmente danneggiato con una pressione eccessiva. - Utilizzando due coppie di pinze curve, afferrare un lungo circa 20 mm pezzo di nastro adesivo in tessuto longitudinalmente negli angoli superiori. Posizionare la parte inferiore del nastro sul vetrino in cima dell'orecchio del mouse e ruotare il nastro sul resto dell'orecchio, spingendo i capelli in eccesso fuori strada con la pinza se necessario apporre l'orecchio alla coprioggetto. Premere delicatamente sul nastro intorno all'orecchio con un batuffolo di cotone asciutto per garantire una perfetta tenuta, facendo attenzione a non premere sul orecchio stesso.
- Fissare la piattaforma di imaging ad un 37 ° C blocco riscaldante con nastro adesivo. Applicare grasso vuoto su entrambi i lati della zona dell'orecchio della piattaforma di imaging. Ruotare il mouse per posizionare il coprioggetto sulla piattaforma di imaging, facendo attenzione ad allineare l'orecchio al centro del feltro.
NOTA: evitare di ottenere grasso per vuoto sul nastro, come questo farà sì che a venire staccato dal vetrino di vetro. - Far scattare il nosecone isoflurano nel supporto sulla piattaforma di imaging, assicurando che la nosecone è sicuro e che copre completamente il naso del mouse. Stendere il grasso per vuoto sotto il vetrino premendo con fermezza ma con cautela il vetrino sulla piattaforma di imaging con un tampone di cotone asciutto e pulito.
- Fissare il vetrino alla piattaforma con due 20 millimetri pezzi di nastro e due pezzi lunghi di nastro avvolto attorno alla porzione superiore della piattaforma. Se le bolle d'aria sono presenti tra l'orecchio e il coprioggetto, possono essere rimossi delicatamente premendo sull'orecchio dal basso with un pezzo di carta piegata.
NOTA: E 'essenziale non usare carta troppo spessa o di premere con forza, in quanto ciò può causare il tessuto scottatura e danni, complicando risultati. - Muovi il mouse per palco microscopio e fissare la piattaforma con il nastro adesivo. Tubo un doppio strato di grasso per vuoto sul vetrino intorno all'orecchio per servire come serbatoio per l'obiettivo immersione in acqua.
- Avvolgere un riscaldamento coperta piena d'acqua in tutto il mouse attraverso la piattaforma di imaging. Riempire il serbatoio con 37 ° C acqua distillata. Assicurarsi che tutto è fissato al palco con nastro adesivo e che la siringa del catetere è facilmente accessibile.
4. In Vivo Time-lapse imaging e per via endovenosa anticorpo Amministrazione
NOTA: Questo protocollo richiede l'uso di un microscopio multifotone dotato di Ti: Sa sistema laser. L'obiettivo utilizzato è una lente di ingrandimento 25x con 1,05 NA, apposto con un oggettoriscaldatore ive impostato a 40 ° C. La temperatura ottimale per questo riscaldatore è stato determinato empiricamente per essere la temperatura appropriata per mantenere il derma per le orecchie a 37 ° C, e può essere necessario un aggiustamento per l'uso in altri sistemi di imaging. Il software di acquisizione utilizzato può variare tra gli strumenti e le modifiche al protocollo può essere fatta funzionare su sistemi in modo diverso configurati. Assicurarsi che le immagini possono essere salvate in un formato che è compatibile con qualsiasi software di analisi desiderato.
- Individuare il derma attraverso gli oculari posizionando l'obiettivo sopra il centro dell'orecchio e abbassando l'obiettivo solo fino a contatto con la superficie dell'acqua nel serbatoio. Uso di una sorgente luminosa esterna, guardare attraverso gli oculari e continuare ad abbassare lentamente all'obiettivo finché la superficie dell'orecchio è a fuoco. Abbassare le tende interne ed esterne in tutto il palco microscopio.
- Determinare le impostazioni microscopio e individuare un'area per l'imaging
- prima Imaging, configurare il laser per l'eccitazione massima e la rilevazione dei fluorofori desiderati regolando la lunghezza d'onda del laser a 900 nm nella finestra MP controller laser, la potenza del laser nella impostazione di acquisizione: la finestra del laser, e le tensioni PMT nella finestra di acquisizione Image Control .
NOTA: Questa procedura utilizza una lunghezza d'onda di eccitazione di 900 nm con filtri per rilevare generazione di seconda armonica (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), e CMTMR (575-630 nm). Altre configurazioni possono essere utilizzati per rilevare differenti fluorofori come desiderato. - Impostare il microscopio per la risoluzione di 512 x 512 pixel, con un tempo di sosta 2 msec / pixel nella impostazione di acquisizione: Windows Dimensione e modalità. Attivare una modalità di imaging dal vivo per permettere la scansione attraverso il tessuto per una superficie di immagine cliccando su "repeat XY". Idealmente, l'area dovrebbe essere relativamente uniforme, senza bolle d'aria, ed evitando aree di follicoli piliferi dense.
NOTA: L'emulsione CFA è autofluorescenti brillantemente nel verde e necanali ar-rosso e deve essere evitato. Un campo ottimale può essere trovato solitamente circa 3 mm dal bordo della emulsione. Circa 10 - 100 cellule possono essere monitorati in una singola immagine. Se troppe cellule sono presenti, software di monitoraggio generalmente incontrano errori nel tentativo di separare le cellule strettamente situati, portando a tracce di cellule accorciato e / o inesatte. - Una volta che un campo di imaging appropriata è stato localizzato, determinare la regione Z che verrà ripreso individuando la cellula "alto" nel derma, l'impostazione della Z-posizione a 0 facendo clic sul pulsante "Set 0", e scorrendo verso il basso nella Z direzione per misurare misura della profondità delle cellule. Una profondità di imaging di 35-75 micron è tipico. Impostare le posizioni di partenza e finale nella sezione Impostazione di acquisizione: la finestra microscopio. Regolare lo strumento tensioni PMT e potenza del laser nella finestra "luminosa Z" per ottimizzare la visualizzazione delle cellule tutta la profondità del campo dell'imaging.
NOTA: Evitare di sollevare la laspotere er superiore ai 25 mW a campione, livelli di potenza più in alto può causare danni dovuti al calore e lesioni sterili al derma. Il livello di potenza massima appropriato per ogni microscopio varierà e dovrà essere misurata. Va notato che aumentando la potenza laser o tensioni PMT con la profondità del tessuto non consente confronto quantitativo di luminosità dell'immagine a diverse profondità di analisi post-acquisizione. - Controllare i pulsanti "Time" "profondità" e sotto il pulsante "Scan" nella finestra di acquisizione del controllo Immagine. Impostare un filtro di Kalman per acquisire l'immagine 3 volte per riga nel Acquisizione di immagini di controllo: finestra Modalità filtro e regolare la profondità Z-fetta nell'acquisizione Image: Finestra microscopio in modo che ci vuole circa 1 minuto per catturare uno stack completo, come notato nella finestra TimeView.
NOTA: L'intervallo tra pile non dovrebbe richiedere più di circa 1 minuto, come intervalli più lunghi impediscono il tracciamento delle cellule in rapida migrazione. A seconda the tipo di cellule essere ripreso, questo intervallo potrebbe essere necessario modificare per consentire il corretto tracciamento delle cellule dal software di analisi. Z-fette dovrebbero essere non più di 5 micron. Generalmente 15-18 Z-fette tra 2-5 micron di spessore sono appropriate per un intervallo di imaging 1 min.
- prima Imaging, configurare il laser per l'eccitazione massima e la rilevazione dei fluorofori desiderati regolando la lunghezza d'onda del laser a 900 nm nella finestra MP controller laser, la potenza del laser nella impostazione di acquisizione: la finestra del laser, e le tensioni PMT nella finestra di acquisizione Image Control .
- Catturare un'immagine time-lapse pre-anticorpo
- Catturare un'immagine time-lapse 5 min della zona per valutare la stabilità del tessuto impostando il numero di ripetizioni di "5" nelle impostazioni di acquisizione: finestra TimeScan e facendo clic sul pulsante "Scan".
NOTA: Tissue "drift" può essere causato non consentendo tempo sufficiente per l'orecchio per raggiungere l'equilibrio termico, scarsa preparazione orecchio, o può essere causa di drift locale in una regione dell'orecchio. Se l'immagine 5 min non è stabile, un'immagine nuova regione nel derma. Se una seconda immagine in una nuova regione rimane instabile, è meglio ripetere accuratamente la preparazione orecchio e l'imaging dal punto 3.6 con un COV frescaerslip. - Se il tessuto è stabile l'immagine 5 min, raccogliere immagini time-lapse di 30-45 minuti impostando il numero di ripetizioni a tra 30 e 45 nella impostazione di acquisizione: finestra TimeScan, il monitoraggio di qualsiasi deriva tessuto minore come l'immagine è raccolto. Salvare il file in un formato che è compatibile con il software di analisi da utilizzare.
NOTA: A questo punto il protocollo, i passi 4.2.2 - 4.3.2 può essere ripetuto per immagini più posizioni nello stesso orecchio. Un singolo mouse non dovrebbero essere tenuti anestetizzato per più di 4 ore, come la morte è più probabile che si verifichi.
- Catturare un'immagine time-lapse 5 min della zona per valutare la stabilità del tessuto impostando il numero di ripetizioni di "5" nelle impostazioni di acquisizione: finestra TimeScan e facendo clic sul pulsante "Scan".
- Iniettare anticorpi bloccanti e acquisire un'immagine post-anticorpo.
- Disegnare la miscela di anticorpi in una siringa da 1 TB ml e rimuovere l'ago, avendo cura di rimuovere tutte le bolle d'aria. Premere il pistone in modo che la soluzione di anticorpi forma una "goccia" alla fine della siringa.
- Sollevare le tende attorno al palco e individuare il catetere. Rimuovere l'originale PBS-contasiringa ining dal catetere. Se non si imposta il catetere verso il basso, fissare con cura la nuova siringa contenente gli anticorpi. Tenere l'estremità del catetere sulla siringa e iniettare lentamente la miscela di anticorpi nel catetere. Assicurarsi che non vi è alcuna resistenza a iniezione.
- Impostare il catetere verso il basso e abbassare le tende che circondano il palco microscopio. Nota momento dell'iniezione e immediatamente iniziare a raccogliere una nuova sequenza di imaging 20-40 min nella stessa posizione utilizzando le stesse impostazioni dello strumento come immagine di pre-anticorpo. Salvare il file in un formato appropriato per il software di analisi da utilizzare.
NOTA: tra le immagini time-lapse, osservare il mouse per l'anestesia e la respirazione sufficiente. Non è raccomandato per l'immagine più di un campo in seguito alla somministrazione di anticorpi, come ci possono essere tassi variabili di spazio dell'anticorpo.
- Iniettare destrano fluorescenza marcata per individuare i vasi sanguigni, valutare la pervietà del catetere, e misurare bpermeabilità nave lood
- Preparare una soluzione / ml 2 mg di destrano fluorescente coniugato (70.000 MW) in 100 microlitri di PBS sterile e disegnare in una siringa, rimuovendo eventuali bolle d'aria.
- Utilizzando la stessa tecnica in fase 4.4.1-4.4.2, posizionare la siringa sul catetere e iniettare la soluzione destrano per via endovenosa.
- Catturare una singola pila a una risoluzione di 1024 x 1024 pixel per cambiare la risoluzione nelle impostazioni di acquisizione: finestra del modo, con le stesse impostazioni PMT e laser come per le immagini time-lapse. Per raccogliere l'immagine, deselezionare il pulsante "Time" sotto il pulsante "Scan", e quindi facendo clic sul pulsante "Scan". L'immagine 3D consentirà alle cellule T di esclusione situate nel sistema vascolare e dimostrare che il catetere era brevetti e inserito correttamente. La diffusione di destrano fluorescente su navi può anche essere utilizzato per valutare la permeabilità vascolare locale.
NOTA: Questo ad alta risoluzione (1024 x 1024) immagine statica viene utilizzata per prfinalità esentazione e può essere inoltre essere utilizzati per l'analisi dell'architettura del tessuto nella stessa area delle immagini time-lapse. In alternativa, un'immagine di 512 x 512 può essere preso, che può essere fusa con i time-lapse immagini utilizzando il software di analisi delle immagini. Tempo lapse imaging dell'amministrazione destrano può desiderare, a seconda delle esigenze di ricerca dei singoli laboratori. In questo caso, l'immagine deve essere impostato come nei passaggi 4.2.3-4.3.2.
- Dopo l'imaging è completato, rimuovere con attenzione il mouse da sotto l'obiettivo e scartare la coperta d'acqua. Rimuovere il vetrino dalla piattaforma di imaging per il taglio del nastro e delicatamente sollevare il bicchiere fino a quando non si stacca. Mentre il mouse è ancora anestetizzato, staccare l'orecchio dal vetrino. Se questo è essere una procedura terminale, eutanasia il topo per dislocazione cervicale. Se il risparmio questo mouse per ripetere l'imaging, è tornare a una gabbia pulita separato da altri topi e osservare fino a quando il mouse può diritto stesso ed èambulatoriale. Una volta recuperato da anestesia, il mouse può essere restituito a una gabbia con altri animali.
- Importare i file di imaging in un programma di analisi di immagine ed eseguire qualche correzione desiderata. Si raccomanda di evitare di miglioramenti non lineari e programmi di riduzione del rumore di levigatura o automatizzati e algoritmi. Tipicamente, le immagini hanno bisogno solo di una correzione del fondo minore, aumentando manualmente il punto nero dell'immagine prima dell'analisi. Analizzare i dati di imaging utilizzando un programma di cellula-automatizzato di monitoraggio con correzione manuale, come in Overstreet, Gaylo et al 30.
NOTA: Ci sono molte suite di analisi delle immagini disponibili, di origine sia proprietarie e open, che possono essere utilizzati per quantificare le dinamiche cellulari dalle immagini multiphoton derivati da questo protocollo. Il metodo per l'analisi delle immagini e dei pacchetti software ottimali da utilizzare dipenderà dalle esigenze di ricerca dei singoli laboratori.
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Representative Results
La possibilità di studiare le risposte immunitarie in loco senza alterare l'ambiente immunitario è essenziale per lo studio delle interazioni in tempo reale delle cellule T effettrici con un tessuto infiammato. Imaging del derma orecchie intatte di questo protocollo, descritto nella Figura 1A e B, permette la visualizzazione di trasferire cellule T effettrici fluorescente nell'interstizio cutanea. Questo permette sia ad alta risoluzione (Figura 1C) e time-lapse (Figura 1D, Film 1) le immagini della dinamica delle cellule T effettrici nel derma infiammato.
Figura 1. ad alta risoluzione e di imaging 4D di cellule T effettrici nell'interstizio cutanea intatta. (A) schema sperimentale. (B) Fotografia di un prepar orecchioEd per l'imaging con il sito dell'emulsione (linea nera tratteggiata) e la zona ottimale per l'imaging (linea rossa) ha indicato. Sporgenza (C) Maximal 3D di una pila alta risoluzione che mostra CFSE marcato Th1 cellule (verde), segnale di seconda armonica da collagene fibrillare (blu) e Texas Red-Destrano etichettato vascolarizzazione (rosso). La freccia bianca indica uno dei diversi follicoli piliferi autofluorescenti. Barre di scala rappresentano 50 micron (D) i percorsi migratori delle cellule Th1 monitorati per 30 minuti nel derma CFA-infiammata. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questo protocollo di imaging richiede l'uso di una piattaforma di imaging specializzato che è stato costruito in casa, nonché un nosecone adattata per la consegna di anestesia inalatoria mentre imaging. La piattaforma di imaging (Figura 2A-B) è costituito of una piastra di base in alluminio con una sezione centrale rialzata. Questa sezione rialzata ha una porzione inserto rivestito con feltro acrilico per fornire supporto per l'orecchio senza comprimere e potenzialmente danneggiare il tessuto sottile. La geometria della nostra configurazione necessaria la costruzione di un nosecone flessibile e regolabile per fornire anestesia inalatoria durante l'imaging. Questo nosecone, costituito da un tubo da microcentrifuga modificato collegata ad una sezione di 50 mm tubo flessibile (Figura 2C), è fissato in posizione con un supporto costituito da tubi microcentrifuga modificati (Figura 2D) e fissata alla piattaforma di imaging mediante velcro . L'uso di velcro permette il riposizionamento del complesso nosecone modo che entrambe le orecchie di un mouse può essere ripreso, e può essere posizionato in modo ottimale per i singoli topi.
Figura 2. Equipment per l'imaging intravitale. piattaforma di imaging su misura costruito in alto (A) e viste laterali (B). Nosecone per l'amministrazione isoflurano (C) e il supporto nosecone (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Cateterizzazione della vena della coda consente l'accesso continuo alla circolazione per amministrare anticorpi e altre piccole molecole che possono diffondere fuori del sistema vascolare, o molecole fluorescenti più grandi, come ad alto peso molecolare destrano per etichettare i vasi sanguigni. Dopo la somministrazione di 100 mg di anti-β 1 e anti-β 3 integrina anticorpi bloccanti attraverso il catetere, arresto celle precedentemente motile nel derma (Film 2). Queste cellule hanno una velocità media diminuito dopo anticorpo amministrazione (Figura 3A), nonché una significativa diminuzione nell'indice meandro, il rapporto tra lo spostamento totale alla lunghezza totale traccia (Figura 3B).
Figura 3. La somministrazione di anti-β 1 e anti-β 3 anticorpi inibisce Th1 cellule migrazione in pelle CFA-infiammata. (A) Velocità media di cellule Th1, prima e dopo la somministrazione di 100 mg anti-β 1 e anti-β 3 integrina anticorpi bloccanti. (B) Indice serpeggiante di cellule Th1 prima e dopo l'anticorpo blocco. Circa 100 cellule cingolati provengono immagini prima e dopo l'anticorpo blocco da un singolo mouse in un esperimento rappresentativo. Statistiche di Mann Whitney.es / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Poiché capelli non viene rimosso dalla superficie del padiglione auricolare, artefatti di imaging dai capelli sono comuni. Autofluorescenza da follicoli piliferi (figura 4a) e shadowing e autofluorescenza da capelli sovrastante (Figura 4B) deve essere evitato, se possibile, in quanto possono oscurare le cellule T e di interferire con il software di analisi delle immagini automatizzata. Allo stesso modo, le bolle d'aria intrappolate tra la superficie orecchio e il vetrino può portare ad artefatti di imaging (Figura 4C). Preparazione adeguata dell'orecchio dovrebbe ridurre al minimo il numero e le dimensioni di ogni residuo di bolle.
Figura 4. Artefatti comuni di autofluorescenza capelli e poveri pre orecchioparazione. follicoli piliferi (A) autofluorescenti. (B) i capelli autofluorescenti e follicoli piliferi (verde) e collagene (bianco) con le ombre capelli sovrastanti, causando linee scure nell'immagine. (C) artefatto da una bolla d'aria, che mostra il bordo dei profughi, autofluorescenti epidermide cheratinizzate (linea tratteggiata). Barre di scala rappresentano 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Inoltre, l'utilizzo di più fonti di calore può portare a problemi con la stabilità del tessuto a causa della dilatazione e contrazione termica. Impostazioni del termostato non corretti, per esempio, possono portare a grandi oscillazioni durante l'imaging che può rendere l'interpretazione dei risultati difficili (Movie 3). È essenziale per determinare le impostazioni ottimali per qualsiasi sistema che fornisce una temperatura costante e massimizza la stabilità. Ultimately, una camera di imaging temperatura controllata è il modo migliore per rimuovere variabilità dalle variazioni di temperatura.
Film 1. cellule Th1 che migrano nel derma CFA infiammati (clic destro per il download). Immagine 30 min time-lapse che mostra cellule Th1 (verde) che migrano nella rete di collagene dermico (seconda generazione armonica, blu).
Movie 2. Th1 cellule arresto su blocco di β 1 e ß 3 integrine (clic destro per il download). Cellule (verdi) sono stati ripresi per 30 minuti prima che il administrazione di anticorpi bloccanti, e poi ripreso per altri 20 minuti nella stessa posizione.
Movie 3. Oscillazioni da una piastra di riscaldamento scarsamente controllata (clic destro per il download). 30 min di immagini time-lapse di Th1 cellule (verde) e generazione di seconda armonica (blu). Dopo questa immagine è stata raccolta, la piastra di riscaldamento utilizzato è stato trovato per avere un termostato guasto, causando oscillazioni della temperatura della piattaforma di imaging e successiva espansione e contrazione termica.
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Discussion
Importanza
Qui vi presentiamo un protocollo completo per la visualizzazione 4D di, antigene-specifica effettrici cellule Th1 trasferiti nel derma per le orecchie del mouse intatti. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto alcune modalità di imaging correnti per diversi motivi. Con l'imaging del derma orecchie ventrali, siamo in grado di rinunciare depilazione che è necessario per i protocolli di imaging che coinvolgono altri siti cutanei. Anche se per la depilazione sono generalmente lievi, che hanno dimostrato di causare disagi alla pelle barriera di 42, un processo che può stimolare una risposta immunitaria 43,44. Evitando anche le procedure chirurgiche invasive per esporre il derma o ipoderma, questo protocollo previene l'infiammazione danni indotti e il rapido reclutamento di neutrofili 37 e altre cellule immunitarie nel derma. L'uso di un catetere venoso in questo sistema per fornire anticorpi bloccanti contro molecole chiave permette reale interrogatori tempo della Dynacomportamento microfono di cellule T CD4. L'uso di questo protocollo di imaging ha rivelato requisiti critici per CD4 T cell motilità interstiziale 30 che non sono stati rilevati in sistemi in vitro 8.
Passaggi critici nella procedura
Un passo essenziale in qualsiasi protocollo di imaging è garantire una preparazione dei tessuti stabile per l'imaging. È importante garantire che vi sia sufficiente PBS tra l'orecchio e il coprioggetto che non vi siano bolle d'aria e l'orecchio è in contatto con il vetro, ma non così tanto da provocare il nastro diventi de-aderito dal vetro. Allo stesso modo, evitando il contatto tra il nastro di protezione del coprioggetto alla piattaforma e qualsiasi grasso per vuoto impedirà il nastro allentamento nel tempo. La temperatura deve essere mantenuta costante per evitare oscillazioni e deriva dalla contrazione termica o dilatazioni dei materiali piattaforma.
Limitazioni e modifiche
45. Tuttavia, la popolazione residente immunitaria dell'orecchio è distinta dalla pelle sul fianco o zampa 46, e l'orecchio del mouse ha proprietà vascolari distinte rispetto ad altri siti 47. Così, per alcune applicazioni, il confronto dei dati di imaging orecchio ad altri siti della pelle può essere difficile.
Questo protocollo richiede anche la migrazione effettiva delle cellule T effettrici trasferiti fuori dal flusso sanguigno e nel derma. Ciò limita la possibilità di utilizzare cellule che hanno difetti di homing o stravaso quanto non saranno in grado di entrare nello spazio interstiziale. Lo stravasopuò essere bypassato iniettando cellule direttamente nel derma orecchie 37,48, anche se ciò causare danni meccanici e la consegna di cellule in questo modo non può riassumere la localizzazione o comportamento delle cellule che subiscono in stravaso vivo.
E 'anche importante considerare l'utilizzo di topi riceventi non pigmentate per esperimenti di imaging, come la / c ceppo BALB usato qui o topi Albino C57BL / 6- Tyr c-2J. La melanina in topi pigmentati, oltre ad essere altamente autofluorescenti, riscalda sotto anche relativamente eccitazione a bassa potenza da un laser multifotonica 37. Ciò può causare danni termici alla pelle e la conseguente infiammazione 36 o fluorescente screziature 31, complicando risultati. Ciò può limitare fluorofori che possono essere utilizzati in un esperimento di imaging multi-parametro. Tuttavia, alcune molecole fluorescenti molto luminose o altamente espresse possono essere efficacemente eccitati alla potenza del laser bassa, tuttograzie per la visualizzazione efficace nei topi pigmentati.
Le future applicazioni
Poiché questa è una procedura non invasiva, potrebbe essere facilmente adattato per studi longitudinali su topi con immagini sequenziale per periodi di tempo prolungati. Mentre l'etichettatura fluorescente, come descritto qui sarebbe svanire per periodi di tempo maggiori di 3-4 giorni, l'uso di cellule endogeno fluorescenti o cellule reporter fluorescente elimina questo problema. Infatti, abbiamo utilizzato in precedenza questo protocollo per monitorare in effettori antigene-specifiche vivo- generati recanti citochine giornalisti, tra cui il giornalista IFNγ Yeti 30,49 e IL-4 giornalista 4get 50. Abbiamo inoltre visualizzato cellule CD4 endogene in CD4-Cre EYFP ROSA26-stop-floxed topi reporter fluorescente 30. Poiché le proprietà fluorescenti di EYFP e altre proteine fluorescenti differiscono da coloranti chimici quali CFSE, possono essere necessarie modifiche ai parametri di imagingper la visualizzazione efficiente. Le modifiche come l'aumento del tempo di sosta pixel può migliorare segnale fluorescente di alcuni fluorofori fioche, e diminuendo la lunghezza di immagini lasso di tempo può ridurre qualsiasi photobleaching che possono essere osservati. A 900 nm di eccitazione, non abbiamo precedentemente osservato significativo photobleaching di CFSE, CMTMR, o EYFP su intervalli di imaging brevi.
Sebbene questa procedura si concentra sulla misurazione dinamica di CD4 effector motilità cellulare T, essa non è limitata a questa applicazione. Il lavoro è attualmente in corso per misurare le interazioni dinamiche delle cellule T effettrici con cellule presentanti l'antigene attraverso l'uso di topi reporter fluorescenti e iniezione di anticorpi coniugati fluorescenza nel derma per marcare le cellule o strutture assorbente per l'imaging 51,52. Inoltre, mentre questo protocollo illustrato l'utilizzo del catetere per fornire anticorpi bloccanti mentre l'imaging, altri composti, tra cui le piccole molecole inibitrici, puòsomministrare. In definitiva, questo protocollo fornisce una piattaforma flessibile per misurare dinamiche immunitarie nel tempo, in vivo, in modo non invasivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano l'Università di Rochester struttura Multiphoton Microscopio Nucleo per un aiuto con immagini dal vivo. Supportato da NIH AI072690 e AI02851 a DJF; AI114036 di AG e AI089079 di MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
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