Summary
Механизмы, которые регулируют интерстициальный моторику CD4 эффекторных Т-клеток на участках воспаления относительно неизвестны. Мы представляем неинвазивный подход к визуализации и манипулирования в пробирке -primed CD4 Т - клеток в воспаленных дермы уха, что позволяет для исследования динамического поведения этих клеток на месте.
Abstract
Способность лимфоцитов CD4 выполнять эффекторные функции зависит от быстрой и эффективной миграции этих клеток в воспаленных периферических тканях через пока еще не определен механизм. Применение многофотонной микроскопии для изучения иммунной системы дает инструмент для измерения динамики иммунных реакций в пределах здоровых тканей. Здесь мы приводим протокол для неинвазивной прижизненной многофотонном визуализации лимфоцитов CD4 в воспаленных дермы мыши уха. Использование платформы пользовательских изображений и венозный катетер позволяет для визуализации динамики CD4-Т-клеток в кожном интерстициальную ткань, с возможностью опрашивать эти клетки в режиме реального времени с помощью добавления блокирующих антител к ключевым молекулярных компонентов, участвующих в моторики. Эта система обеспечивает преимущества по сравнению с обеих моделей в пробирке и хирургическим путем инвазивных процедур визуализации. Понимание путей, используемых CD4 Т-клеток для моторики могут в конечном счете обеспечить понимание в BasiС функцией CD4-Т-клеток, а также патогенез обоих аутоиммунных заболеваний и патологии от хронических инфекций.
Protocol
Все процедуры, связанные с мышами были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Университета Рочестера путем, и осуществляется в строгом соответствии с Законом об охране животных и политики службы общественного здравоохранения на гуманное лечение и использования лабораторных животных, находящихся в ведении Национальных институтов здравоохранения, Управление лабораторией защиты животных.
1. Получение эффекторных Т-клеток CD4
Примечание: BALB / с TCR-трансгенных мышей DO11.10, которые специфически распознают пептид из куриного яйца овальбумином (pOVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Другие ТКС-трансгенные системы могут быть замещены, используя соответствующий родственный пептид вместо pOVA, где это указано.
- Очищают наивных CD4 Т-клеток
- Эвтаназии 6-8 недельных самок DO11.10 BALB / с мышь, подвергнув до 2 л / мин СО 2 , пока мышь не проявляет никаких признаков движения или дыхания в течение 1 мин с последующим смещением шейных позвонков, или в соответствии спринципы местного институционального уходу и использованию животных комитета. Спрей мышь с 70% раствором этанола и сделать приблизительно 7 см надрез в коже от подбородка мыши на 2/3 пути вниз живота. Сделать 2-3 надрезы см кожи от конца разреза в брюшной полости в направлении задних ног. Будьте осторожны, чтобы не врезаться в брюшину.
- Аккуратно отделить кожу от брюшины, осторожно потянув с щипцами. Паховых лимфатических узлов располагаются на коже вблизи стыка задних ног с телом. Удалить путем захвата и потянув с щипцами и место в 8 мл HBSS, дополненной 2% сыворотки новорожденного теленка (NCS).
- Урожай подмышечные и плечевая лимфатических узлов от мыши путем захвата и осторожно потянув с щипцами. Место в HBSS + 2% NCS с паховых лимфатических узлов.
- Урожай глубокие и поверхностные шейные лимфатические узлы, расположенные в области шеи мыши с щипцами и место в HBSS + 2% NCS с ВЗее лимфатические узлы.
- Аккуратно разрезать на брюшине, следя за тем, чтобы не порезать в кишечник. Захватите слепой кишки и толстой кишки с щипцами и подвергать брыжеечные лимфатические узлы, которые расположены только вдоль толстой кишки. Осторожно удалите брыжеечные лимфатические узлы с пинцетом и поместить с другими лимфатическими узлами.
- Найдите селезенку в брюшной полости и осторожно удалите ее, держа пинцетом и отрезания соединительной ткани прочь с парой хирургических ножниц. Поместите селезенку с лимфатическими узлами.
- Подготовка суспензии отдельных клеток путем выливания + 2% NCS HBSS, содержащих селезенку и лимфатические узлы в металлический сетчатый фильтр, помещенной в чашку для культивирования в 60 х 15 мм. Аккуратно разотрите селезенки и лимфатических узлов через металлический сетчатый фильтр с поршнем из 10 мл шприца в HBSS + 2% NCS.
- С помощью пипетки переместите суспензии клеток в чистую 50 мл центрифужную пробирку. Ополосните металлический сетчатый фильтр и культуры блюдо с дополнительными 10 мл HBSS + 2% NCS, Uпеть пипетку, и поместите это решение в том же 50 мл центрифуге трубки в качестве клеточной суспензии.
- Спин клетки при 600 мкг в течение 5 мин для осаждения клеток и ресуспендируют в 10 мл HBSS + 2% NCS осторожно пипеткой. Если не указано иное, все центрифугирование следует проводить при 600 х г в течение 5 мин.
- Развести 10 мкл клеточной суспензии в 90 мкл 0,1% трипанового синего в PBS для разведения 1:10. Поместите 10 мкл клеток в трипановым синим на гемоцитометра пипеткой раствора в паз на краю гемоцитометра. Количество белых кровяных клеток в центральной сетке гемоцитометра, игнорируя эритроцитами, которые появляются, как немного меньше, круглые, красные-цветный клетки и голубые мертвые / умирающие клетки. Умножив число подсчитанных клеток на 10 4, на коэффициент разбавления (10), а по объему клеток (10 мл) , чтобы определить общее количество клеток , собранных в центрифужную пробирку на 50 мл.
- Для обогащения для CD4 Т-клеток, ЦентрифугаКлетки для осаждения, и клетки вновь суспендируют при 2x10 7 клеток / мл в растворе , содержащем приблизительно 1 мкг / мл анти-CD8 (клон 3,155), 1 мкг / мл анти-МНС класса II (клон M5 / 114), и 1 мкг / мл анти-CD24 (клон J11d) антитела в HBSS + 2% NCS, осторожно пипеткой.
Примечание: Антитела, используемые на этой стадии, являются производными в доме из гибридомных клеточных линий и концентрации округлены. Концентрация и объем этих антител идеально подходит для комплемента лизис определяли эмпирически и будет варьироваться между лабораториями. В качестве альтернативы, некоторые коммерчески доступные наборы доступны для очистки нативных CD4 Т-клеток, и может быть заменен на комплемента лизис и процесса очистки CD62L +, представленной здесь. При использовании другого метода для очистки наивных CD4 Т-клетки, этот протокол может быть продолжено с шага 1.2. - Инкубируют на льду в течение 30 мин. В конце этой инкубации, быстро оттаивают подопытным кроликом комплемента путем размещения в 37 & deg; С воды бATH в течение приблизительно 2 мин. Добавьте 100 мкл комплемента на каждый 1 мл клеток в растворе антител с помощью пипетки комплемент непосредственно в клеточную суспензию. Инкубируйте клетки в водяной бане С 37 ° С в течение 30 мин.
- Добавить HBSS + 2% NCS довести клетки до общего объема 20 мл в центрифужную пробирку. Слой в 8 мл RT плотности центрифугирование сред (плотность 1,086 г / мл) под клетками. Сразу центрифугировать клетки при 1400 х г при комнатной температуре в течение 15 мин с центрифугой тормоза выкл.
- Собирают клетки на границе раздела с использованием серологических пипеток и переноса клеток в новую 50 мл центрифужную пробирку. Вымойте клеток путем доведения объема в центрифужной пробирке до 50 мл HBSS + 2% NCS и центрифугирование.
- Ресуспендируют клеток в буфере для MACS (PBS с добавлением 2% NCS и 2 мМ ЭДТА), осторожно пипеткой и подсчитывать, как ранее, на этапе 1.1.10.
- Для обогащения для наивных CD4 - Т - клеток, клетки вновь суспендируют при 2x10 7 клеток / мл в растворе2,5 мкг / мл биотин-конъюгированными анти-CD62L антитела в буфере для MACS, на основании количества подсчитывались на шаге 1.1.16. Инкубировать в течение 30 мин на льду.
- Промывают клетки добавлением 10 мл MACS буфера, затем центрифугируют клетки. Ресуспендируют клеток в 10 7 клеток / 100 мкл в буфере для MACS и добавьте стрептавидином гранулами , конъюгированными магнитной сепарации при разведении 1:10 непосредственно к клеткам. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
- Промывают клетки , как и прежде, на этапе 1.1.17, и клетки вновь суспендируют в 2х10 8 клеток / мл в буфере для MACS, в минимальном объеме 500 мкл.
- Поместите магнитную разделительную колонну в держателе магнита и промывки колонки, позволяя 3 мл MACS буфера потока через. Применение клеток на колонку с пипеткой.
- Промыть колонку для удаления клеток не связаны магнитной колонки с помощью пипетки 3 мл буфера MACS на колонку и позволяя буфер MACS течь через, и повторите 3 раза. Откажитесь от потока через дробь.
- убре столбец из магнитного стенда и удерживать более новую 50 мл центрифужную пробирку. Внесите 5 мл буфера MACS на колонку и использовать поршень, заключенный с колонкой, чтобы подтолкнуть MACS буфер через колонку, чтобы освободить столбцов связаны клетки и собирать поток через который содержит обогащенные наивных CD4-Т-клеток.
- Центрифуга клетки и ресуспендируют в 10 мл среды RPMI с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (среда RPMI-10). Граф клеток, как и раньше, на этапе 1.1.10.
- Регулировка конечной концентрации наивных CD4 - Т - клеток к 6x10 5 / мл в среде RPMI-10.
- Очищают Т-клеток обедненного селезеночной БТРы
- Эвтаназии 6-8 недельных самок дикого типа BALB / C мыши, как на этапе 1.1.1.
- Спрей мышь с 70% -ным раствором этанола, и обнажения селезенки, сделав приблизительно 3 см надрез на левой стороне abdome мышинойп. Разрежьте перитонеальный слой и удалить селезенку, осторожно схватив его с пинцетом и резки его подальше от основной соединительной ткани с хирургическими ножницами.
- Поместите селезенку в 8 мл HBSS + 2% NCS.
- Подготовка суспензии отдельных клеток путем затирания селезенку, мыть, и считать клетки, как и раньше, на этапах 1.1.7-1.1.10
- Истощают Т - клетки, крутя клетки при 600 мкг в течение 5 мин для осаждения, и клетки вновь суспендируют в 2x10 7 в растворе приблизительно на 1 мкг / мл анти-Thy1.2 антителом (клон J1J), осторожно пипеткой. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 мин.
Примечание: Это антитело было получено в доме из линии гибридомных клеток, а concentraton аппроксимирована. Концентрация и объем этого антитела идеально подходит для дополнения лизиса определяли эмпирически и будет варьироваться между лабораториями. Другие способы очистки АРС из спленоцитов может быть заменен, если желательно. Наивные Т-клетки и БТРы должны быть подготовлены в культеЮр с шага 1.3. - Добавить Guinea Pig комплемент, инкубировать, и отделить клетки от плотности центрифугирование медиа градиентом, как и раньше, на этапах 1.1.13-1.1.14.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл среды RPMI-10 и облучать БТРов путем размещения клеток в 50 мл центрифужные пробирки в гамма-излучателем в течение промежутка времени, который подвергнет клетки до 25 Гр излучения. Это время будет меняться в зависимости от облучателя и нужно будет рассчитываться каждый раз, когда облучают клетки.
- Подсчитайте клетки на гемоцитометре , как и прежде, на этапе 1.1.10, и корректировать клетки APC до конечной концентрации 2.4x10 6 клеток / мл в среде RPMI-10.
- Стимулируют клетки и дифференцировать лимфоциты CD4 к фенотипу Th1 в 5-дневной культуре.
Примечание: Хотя мы приводим здесь протокол для подготовки и визуализации эффекторы Th1, сгенерированные из наивных CD4 Т-клеток, этот протокол может быть скорректирована, чтобы дифференцировать наивные клетки к другой фенотип или тO использовать другие типы клеток, такие как CD8-Т-клеток. Условия для карбонизации и дифференциации должны быть определены эмпирически.- В каждую лунку блюдо культуры 24-луночного, объединить 500 мкл наивных CD4 Т - клеток и 500 мкл облученных БТРах в каждую лунку, в общей сложности 3x10 5 Т - клеток и 1.2x10 6 БТР на лунку.
- Готовят раствор в RPMI-10, содержащего 2 мкМ родственный OVA пептид, 20 Ед / мл рекомбинантного IL-2, 80 мкг / мл анти-IL-4 (клон 11B11) и 40 нг / мл рекомбинантного IL-12 и фильтр с использованием 0,2 мкм шприц-фильтр. Добавить 1 мл этого раствора в каждую лунку клеток, при общем объеме 2 мл в каждую лунку.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе C 37 ° при 5% CO 2 в течение 3 дней.
- На 3-й день, разделить культуры, осторожно пипеткой для ресуспендирования клеток и перемещение по 1 мл из каждой лунки в новую культуру хорошо. Доведите каждую лунку до конечного объема 2 мл добавлением 1 мл / лунку среды RPMI-10 + 20 Ед / мл рекомбинантного ИЛ-2. </ Li>
- Возврат пластин в инкубаторе и позволяют клеткам не расширяться до 5-й день.
2. Передача клеток и индукции воспаления
Примечание: Для получения оптимального количества клеток для получения изображения, 5х10 6 флуоресцентно меченных Th1 - клетки должны быть переданы каждой мыши в общем объеме 200 мкл PBS. Клетки здесь помечены CFSE зеленым красителем или CMTMR почти красный краситель, хотя возможны и другие ячейки трекерные красители могут быть использованы. CFSE и CMTMR-меченые клетки могут быть совместно переданы для обеспечения отслеживания двух популяций различны эффекторных CD4.
- Этикетка эффекторные Т-клетки с CFSE
- Сбора клеток из культуральных чашек путем энергичного пипетирования клеток в каждую лунку и переноса в стерильную пробирку 50 мл центрифужные с пипеткой. Граф клеток , как на стадии 1.1.10, а затем центрифуге и клетки вновь суспендируют в 10 7 клеток / мл в PBS + 5% NCS.
- Развести 5 мМ раствор запас CFSE 1: 100 вPBS. Добавьте 110 мкл раствора CFSE на каждый 1 мл клеток путем размещения капли раствора CFSE на стороне трубки, а затем быстро качалки трубу назад и вперед, чтобы тщательно перемешать.
- Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем тушат CFSE путем добавления 5 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) непосредственно к трубке клеток. Довести объем до 50 мл PBS + 5% NCS.
- Центрифуга клетки и ресуспендируют осадок в 20 мл PBS + 5% NCS. Повторите эту процедуру еще два раза, чтобы промыть клетки 3 раза всего. Подсчитайте клетки на гемоцитометре, как и прежде, на этапе 1.1.10, и клетки вновь суспендируют в стерильной PBS при 2,5 х 10 7 клеток / мл для передачи на мышах.
- Этикетка эффекторные Т-клетки с CMTMR
- Сбора клеток как выше на шаге 2.1.1, а затем подсчитывать, центрифугу и клетки вновь суспендируют в 10 7 клеток / мл в среде RPMI-10.
- Добавляют 10 мМ CMTMR маточного раствора непосредственно к клеткам для конечной концентрации 10 мкМ. Быстро пипетки-йе клетки, чтобы тщательно перемешать в CMTMR и предотвратить осаждение красителя.
- Выдержите 30 минут в C водяной бане при 37 °. Вымойте клетки 3 раза в PBS + 5% NCS, как и раньше, на этапе 2.1.3-2.1.4. Граф и клетки вновь суспендируют в стерильном PBS при 2.5x10 7 клеток / мл для передачи на мышах.
- Передача эффекторные Т-клетки к наивным 6-8 недельных самок мышей BALB / с.
- Нарисуйте клеточной суспензии (этап 2.1.4 или 2.2.3) в шприц, следя за тем, чтобы удалить все пузырьки, держа шприц иглы стороной вверх, аккуратно стряхивая сторону шприца и перемещения поршня вверх и вниз, при необходимости ,
- Поместите мышей в чистую клетку и тепло мягко под нагревательной лампой, пока хвостовую вену не появится vasodilated. Поместите мышь в удерживающей устройство и протирать хвост с тампоном, смоченным спиртом. Медленно вводят 200 мкл суспензии клеток в боковую хвостовую вену. Там не должно быть никакого сопротивления инъекции или видимого барботирования под кожей.
- Индуцируют воспаление кожи иммунизацией с полным адъювантом Фрейнда (CFA)
Примечание: В этом протоколе, воспаление вызывается подкожной инъекцией CFA эмульгировали либо родственным или не родственным антигеном. Другие воспалительные модели могут быть замещены, хотя количество клеток, необходимых для передачи и сроков обработки изображений должны быть скорректированы эмпирически.- Готовят 200 мкМ раствора пептида OVA в стерильной PBS в микроцентрифужных трубки. Пипеткой эквивалентный объем CFA в верхней части раствора пептида.
- Эмульсию решение, нарисовав его в 28 G1 / 2 инсулина шприц, а затем погружая раствор обратно в микроцентрифужных трубки, затем повторить это действие примерно в 20 раз. Когда полностью эмульгируют, КФА и пептидный раствор образует густую и непрозрачную смесь.
Примечание: необходимо использовать шприц с фиксированной иглой инсулина для образования эмульсии, а эмульсия будет потеряна в мертвом пространстве в нефиксированной needlе шприц. - Испытание эмульсии путем сбрасывания небольшое количество на воде, помещенной в чашку Петри. Эмульсия должна оставаться неповрежденными и не рассеиваться в воду.
- Нарисуйте эмульсию в 300 мкл 28 G1 / 2 инсулина шприц и нажмите вниз резко на поршень, чтобы удалить большие воздушные пузыри.
- Сразу после передачи флуоресцентно меченого эффекторные Т - клетки, обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции 2,2,2-tribromoethanol при 240 мг / кг. Оценка анестезии нежным схождения крайнем случае, введение более 2,2,2-tribromoethanol с шагом 1 мг в случае необходимости.
Примечание: другие одобренные анестетики могут быть заменены на 2,2,2-tribromoethanol. - Поместите наперсток на указательном пальце левой руки и осторожно схватить ухо мыши между левым большим и указательным пальцами с брюшным уха лицевой стороной вверх. Убедитесь в том, чтобы не оказывать чрезмерное давление на ухо, что может привести к механическому повреждению кожи.
- Вставьте иглу, содержащую CFA еmulsion в дерму, скос стороной вверх, и медленно вводят 10 мкл эмульсии в ухо. Размещение инъекции должно быть во внешней 1/3 ушной раковины, слегка смещена от центра, чтобы обеспечить оптимальную визуализации.
- Монитор мышей до анестезии стерлась и мышей способны наделить себя правами и амбулаторное. Мыши Image 3 дня после иммунизации, обеспечивая время воспаления развиваться и перенесенные Т-клетки для движения в дерму уха.
Примечание: Мыши не могут быть оставлены без присмотра в любое время, находясь под наркозом.
3. Подготовка мыши для работы с изображениями
- Подготовьте катетер
- Осторожно снимите металлическую иглу из 30 G1 / 2 туберкулин (TB) иглой шприца с плоскогубцами и счистить любой лишний клей, используя рассекает область, чтобы визуализировать, что клей полностью удаляется.
- Отрежьте наконечник прочь еще 30 G1 / 2 ТБ иглы шприца, гарантируя, что остальные иглы еще рatent путем визуального осмотра. Скольжение 18 см кусок ПЭ-10 медицинских трубок на подстриженной иглу, и осторожно поместите оголенный металлическую иглу примерно на 5 мм в другой конец трубки, создавая катетер.
- Промойте катетер путем заполнения ТБ шприц 1 мл стерильной PBS, удаляя пузырьки воздуха. Аккуратно катетер на кончик шприца и толкать PBS осторожно, хотя катетер, чтобы удалить пузырьки в трубке.
Примечание: при толкании жидкости через катетер, необходимо держать катетер на шприц, чтобы предотвратить давление жидкости от толкая катетера от шприца. - Поместите мышей в чистую клетку и тепло мягко под нагревательной лампой, пока хвостовую вену не появится vasodilated. Обезболить мышь со смесью воздуха в помещении и изофлуран (5% индукции, 1-2% технического обслуживания, при 2 л / мин скорость потока), доставленный через устройство головная часть, которая присоединена к изофлурановым испарителем. Убедитесь в том, что мышь находится под наркозом Wiй нежный носок щепотку. Поэтапно увеличить скорость потока изофлуран на 0,1%, если наблюдается движение. Закройте глаза с глазной мази для предотвращения высыхания и травмы, а мышь находится под наркозом.
Примечание: Очень важно, что мыши никогда не оставлять без присмотра во время наркозом. Мыши должны часто контролироваться на предмет достаточной анестезии при осторожном пальца щепоткой. - Зафиксировать хвост у основания с парой щипцов, а затем протрите хвост с тампоном, смоченным спиртом. Осторожно вставьте катетер в боковой хвостовой вены и проверьте проходимость, осторожно нажимая на поршень шприца. Там не должно быть никакого сопротивления движению и без видимого барботирования PBS под кожу, если он соответствующим образом размещен. Зафиксируйте катетер к хвосту, применяя 1-2 капли клея цианакриловый ткани на месте инъекции и дать высохнуть, приблизительно 30 сек.
- Аккуратно обрежьте волосы со спины и по бокам уха с ножницами, стараясь не повредить ккв. Обрезка усов, а также. Используя ватный тампон, смочить внутреннюю поверхность уха с PBS.
- Поверните мышь и ухо на разделительные No. 1,5 стеклянной крышкой 24 х 50 мм. Использование щипцов, осторожно придавить ухо на покровного стекла, перемещая мышь, если это необходимо, чтобы гарантировать, что ухо находится на одном уровне со стеклом. Удалите излишки PBS из уха с помощью промокательной аккуратно салфеткой протирать.
Примечание: Убедитесь, что не нажимать слишком твердо на ухо, как тонкая кожа может быть легко повреждены при чрезмерном давлении. - С помощью двух пар изогнутых щипцов, возьмитесь приблизительно длиной 20 мм кусок ткани ленты в продольном направлении в верхних углах. Поместите нижнюю часть ленты на покровное в верхней части уха мыши и рулон ленты по остальной части уха, толкая избыток волос из пути с помощью пинцета, если это необходимо, чтобы прикрепить ухо к покровным. Аккуратно нажмите на ленту вокруг уха с сухим ватным тампоном, чтобы обеспечить герметичное уплотнение, следя за тем, чтобы не давить на самого уха.
- Прикрепите платформу обработки изображений на C нагревательный блок 37 ° с клейкой лентой. Нанесите вакуумной смазки по обе стороны от области уха платформы визуализации. Поверните мышь, чтобы поместить покровное на платформу визуализации, следя за тем, чтобы выровнять ухо в центре войлока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания вакуумной смазки на ленте, так как это приведет к его прийти отсоединяется от скольжения стеклянной крышкой. - Привязка изофлуран головная часть в держатель на платформе визуализации, гарантируя, что головная часть является безопасным и полностью покрывает нос мыши. Распространение вакуумной смазки под покровное, крепко, но осторожно нажав покровное на платформу визуализации с чистой, сухим ватным тампоном.
- Affix покровное на платформу с двумя 20 мм кусков ленты и два более длинных кусков ленты, обернутых вокруг верхней части платформы. Если пузырьки воздуха присутствуют между ухом и покровное, они могут быть аккуратно удалены, нажав на ухе снизу Wiй кусок сложенной бумаги.
Примечание: Очень важно не использовать бумагу, которая является слишком толстым или нажимать твердо, так как это может привести к ткани побледнение и повреждения, затрудняющие результаты. - Наведите указатель мыши на столик микроскопа и закрепить платформу с помощью клейкой ленты. Труба двойной слой вакуумной смазки на покровное вокруг уха, чтобы служить в качестве резервуара для цели погружения в воду.
- Оберните заполненный водой нагрева одеяло вокруг мыши с помощью платформы визуализации. Заполните резервуар с температурой 37 ° С дистиллированной воды. Убедитесь, что все, что крепится к стадии с помощью клейкой ленты, и что шприц из катетера легко доступен.
4. В Vivo Время покадровой обработки изображений и управления внутривенных антител
Примечание: Этот протокол требует использования многофотонного микроскопа, снабженного Ti: Sa лазерной системы. Целью используется является увеличение 25x объектив 1,05 NA, проставленный с объектомАйв нагреватель установлен на 40 ° C. Оптимальная температура для этого нагревателя была определена опытным путем, чтобы быть соответствующая температура для поддержания дермы уха при 37 ° C, и, возможно, должны быть приспособлены для использования в других системах обработки изображений. Программное обеспечение сбора используются может варьироваться между инструментами и изменениями к протоколу, возможно, придется заставить работать по-разному настроенных систем. Убедитесь в том, что изображения могут быть сохранены в формате, который совместим с любым желаемым программным обеспечением для анализа.
- Найдите дерму через окуляры, позиционируя цель по центру уха и не понижая цели только до контакта с поверхностью воды в резервуаре. Использование внешнего источника света, смотрите через окуляры и продолжают медленно опустить цель, пока поверхность уха не входит в фокус. Понизить внутренний и внешний занавески вокруг предметный столик микроскопа.
- Определение параметров микроскопа и найти область для работы с изображениями
- Перед Imaginг, настроить лазер для максимального возбуждения и обнаружения желаемых флуорофоров путем регулировки длины волны лазерного излучения до 900 нм в окне MP Laser Controller, мощности лазера в Настройка приобретения: окна лазера и напряжения ФЭУ в Image окне управления Приобретение ,
Примечание: Эта процедура использует длину волны возбуждения 900 нм с фильтрами для обнаружения генерации второй гармоники (420-460 нм), CFSE (495-540 нм) и CMTMR (575-630 нм). Другие конфигурации могут быть использованы для обнаружения различных флуорофоров, как хотелось бы. - Установите микроскоп 512 х 512 пикселей, с 2 мкс / пиксель время выдержки в Настройка Acquisition: размер и режим окна. Активировать режим живого изображения, чтобы обеспечить сканирование с помощью ткани для области к изображению, нажав кнопку "XY повторить". В идеале, площадь должна быть относительно однородной, без пузырьков воздуха, и избегая участков плотных волосяные фолликулы.
Примечание: Эмульсия CFA ярко autofluorescent в зеленый и пеар-красный каналы и их следует избегать. Оптимальное поле обычно можно найти примерно на 3 мм от края эмульсии. Примерно 10 - 100 клеток могут быть отслежены в одном изображении. Если слишком много клеток присутствуют, отслеживания программного обеспечения, как правило, сталкивается с ошибками при попытке отделить близко расположенных клеток, что приводит к сокращению срока и / или неточных клеточных треков. - После того, как соответствующее поле изображения было расположено, определить область Z, которая будет изображенную путем размещения ячейки "высокий" в дерме, установив Z-позицию 0, нажав на кнопку "Set 0", и прокрутка вниз в Z направление, чтобы измерить степень глубины клеток. Глубина визуализации 35-75 мкм является типичным. Установить начальная и конечная позиции в Настройка Acquisition: окна микроскопа. Установка прибора PMT напряжения и мощности лазерного излучения в окне "ярко-Z", чтобы оптимизировать визуализацию клеток по всей глубине поля изображения.
Примечание: Избегайте повышения LASэр мощность свыше 25 мВт на образце, так как высокие уровни мощности может привести к повреждению тепла и стерильный травмы дермы. Соответствующий максимальный уровень мощности для каждого микроскопа будет изменяться и должны быть измерены. Следует отметить, что увеличение мощности лазера или PMT напряжения с глубиной ткани не позволяет количественное сравнение яркости изображения на разных глубинах в анализе после приобретения. - Проверьте "глубины" и кнопки "Время" под кнопкой "Scan" в окне Image Control Acquisition. Установить фильтр Калмана для сканирования изображения 3 раза в линию в Image Acquisition Control: окно режима фильтра и отрегулировать глубину Z-среза в приобретении Image: окно микроскопа так, что она занимает около 1 мин, чтобы захватить полный стек, как было отмечено в окне TimeView.
Примечание: Интервал между штабелями не должно занять больше времени, чем примерно 1 мин, а более длительные интервалы предотвратить отслеживание быстро мигрирующих клеток. В зависимости от гое тип клеток изображаемого, этот интервал может потребоваться скорректировать для обеспечения надлежащего отслеживания клеток с помощью программного обеспечения для анализа. Z-образные срезы должны быть не более 5 мкм. Как правило, 15-18 Z-срезы между 2-5 мкм являются подходящими для интервала формирования изображения в 1 мин.
- Перед Imaginг, настроить лазер для максимального возбуждения и обнаружения желаемых флуорофоров путем регулировки длины волны лазерного излучения до 900 нм в окне MP Laser Controller, мощности лазера в Настройка приобретения: окна лазера и напряжения ФЭУ в Image окне управления Приобретение ,
- Захват предварительно антител покадровой изображение
- Захват 5 мин покадровой изображение области, чтобы оценить устойчивость ткани, установив количество повторений до "5" в Настройка Acquisition: TimeScan окно и нажав на кнопку "Сканировать".
Примечание: Ткань "дрейф" может быть вызвано не давая достаточно времени для уха для достижения теплового равновесия, плохая подготовка уха, или может быть из-за локального дрейфа в одной области уха. Если 5 мин изображение не является стабильным, изображение новый регион в дерме. Если второе изображение в новом регионе остается нестабильной, то лучше всего тщательно повторить подготовку уха и обработки изображений со стадии 3.6 с новым соуerslip. - Если ткань устойчива в 5 мин изображения, собирают 30-45 мин замедленную изображения путем установки количества повторов в диапазоне от 30 до 45 в Настройка Acquisition: TimeScan окно, мониторинг для любого незначительного дрейфа ткани, как изображение собраны. Сохранить файл в формате, который совместим с программным обеспечением для анализа, который будет использоваться.
Примечание: На данный момент в протоколе, шаги 4.2.2 - 4.3.2 можно повторить для получения изображений нескольких местах в одном ухе. Одна мышь не следует держать под наркозом в течение более 4 часов, а смерть более вероятно, произойдет.
- Захват 5 мин покадровой изображение области, чтобы оценить устойчивость ткани, установив количество повторений до "5" в Настройка Acquisition: TimeScan окно и нажав на кнопку "Сканировать".
- Вводят блокирующих антител и захватить пост-антитела изображение.
- Нарисуйте смесь антител в шприц 1 мл ТБ и удалить иглу, убедившись в том, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Нажмите на поршень так, чтобы раствор антитела образует «капельку» на конце шприца.
- Поднимите занавески вокруг сцены и найдите катетер. Удалить оригинальный PBS-Contàоцен- ками шприц из катетера. Без установки катетера вниз, осторожно прикрепить новый шприц, содержащий антитела. Удерживая конец катетера на шприц и медленно вводят смесь антител в катетер. Убедитесь, что не существует никакого сопротивления инъекции.
- Установите катетер вниз и опустить шторы, окружающие столик микроскопа. Обратите внимание на время инъекции и немедленно начать собирать новую последовательность изображений 20-40 мин в том же месте, используя те же настройки прибора в качестве заранее антитела изображения. Сохраните файл в соответствующем формате для анализа программного обеспечения для использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Между покадровой изображений, наблюдать мышь для достаточной анестезии и дыхания. Не рекомендуется к изображению более одного поля после введения антител, так как там может быть переменной скорости клиренса антитела.
- Вводят флуоресцентно-меченого декстрана, чтобы найти кровеносных сосудов, оценки катетера, и измерить бпроницаемость LOOD сосуда
- Приготовить 2 мг / мл раствора флуоресцентно-конъюгированные декстрана (70000 МВт) в 100 мкл стерильной PBS и рисовать в шприц, удаляя пузырьки воздуха.
- Используя ту же технику, что и в шаге 4.4.1-4.4.2, поместите шприц на катетер и вводят декстрана раствор внутривенно.
- Захват один стек на 1024 х 1024 пикселей при изменении разрешения экрана в Настройка Acquisition: окна режима, с теми же PMT и лазерных установок, как для покадровой изображений. Для того, чтобы собрать изображение, снимите кнопку "Время" под кнопкой "Scan", а затем нажмите на кнопку "Сканировать". Это 3D изображение позволит исключающих Т-клеток, расположенных в сосудистой системе и показать, что катетер был патент и правильно установлена. Диффузия флуоресцентного декстрана из сосудов могут быть также использованы для оценки локальной проницаемости сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это с высоким разрешением (1024 x 1024) статическое изображение используется для прЦели esentation и могут быть дополнительно использованы для анализа архитектуры ткани в той же области, что и покадровой изображений. В качестве альтернативы, 512 х 512 изображения могут быть сделаны, которые могут быть объединены с покадровой изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Временной интервал формирования изображения администрации декстран также может быть желательным, в зависимости от исследовательских потребностей отдельных лабораторий. В этом случае изображение должно быть установлен как на этапах 4.2.3-4.3.2.
- После того, как изображения завершена, осторожно удалите мышь из-под цели и разворачивать воды одеяло. Снимите покровное с платформы визуализации путем разрезания ленты и аккуратно поднимая стакан, пока она не отрывается. В то время как мыши все еще под наркозом, отсоединить ухо от покровного. Если это должно быть терминалом процедура, эвтаназии мышь шейки дислокации. Если вы сохраните эту мышь для повторной визуализации, вернуть его в чистую клетку отдельно от других мышей и наблюдать, пока мышь не может само право иамбулаторное. После восстановления от анестезии, мышь может быть возвращен в клетку с другими животными.
- Импорт файлов изображений в программу анализа изображений и выполнить любые необходимые корректировки. Избежание нелинейных усовершенствований и автоматизированных программ и алгоритмов сокращения сглаживающих или шума рекомендуется. Как правило, изображения должны лишь незначительную коррекцию фона, вручную увеличивая черную точку изображения перед анализом. Анализ данных изображений с помощью автоматизированной программы клеточной отслеживания с ручной коррекции, так как в Overstreet, Gaylo и др 30.
Примечание: Есть много сьютов анализа изображений, доступных, как собственных, так и с открытым исходным кодом, которые могут быть использованы для количественной оценки динамики клеток из многофо- изображений, полученных из этого протокола. Точный метод анализа изображений и оптимальные программные пакеты, которые будут использоваться, будет зависеть от исследовательских потребностей отдельных лабораторий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность исследовать иммунные реакции на месте без изменения иммунной среды имеет важное значение при изучении в режиме реального времени взаимодействия эффекторных Т - клеток с воспаленной ткани. Визуализация неповрежденных дермы уха этим протоколом, изложенным на рисунке 1А и В, позволяет для визуализации переданных флуоресцентно меченных эффекторных Т - клеток в кожном интерстиции. Это позволяет одновременно с высокой разрешающей способностью (рис 1C) и временной промежуток (рис 1D, Movie 1) изображения динамики эффекторных Т - клеток в воспаленных дермы.
Рисунок 1. Высокое разрешение и 4D изображений эффекторных Т - клеток в неповрежденном кожном интерстиции. (A) Экспериментальный план. (B) Фотография уха ДГОе изд для получения изображений с сайта эмульсии (черная пунктирная линия) и оптимальной площади для работы с изображениями (красная линия) указывается. (C) Максимальная 3D проекция стека с высокой разрешающей способностью, показывая CFSE-меченого Th1 клетки (зеленый), второй гармоники сигнала от фибриллярного коллагена (синий) и Texas Red-декстрана помечены сосудистую (красный). Белая стрелка указывает на одну из нескольких autofluorescent волосяных фолликулов. Масштабные столбики представляют 50 мкм (D) Миграционные пути Th1 клеток , отслеживаемых в течение 30 мин в CFA-воспаленные дермы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Этот протокол визуализации требует использования специализированной платформы визуализации, которая была построена в доме, а также адаптированный для головная часть доставки вдыхаемого анестезии в то время визуализации. Платформа визуализации (Рисунок 2А-В) состоит OF алюминиевой пластиной с приподнятой центральной секцией. Это подняло секция имеет врезке часть выстлана акрила чувствовал оказывать поддержку уха без сжатия и потенциально повредить тонкую ткань. Геометрия нашей установки потребовало строительства гибкой и регулируемой головная часть для доставки ингаляционных анестезии во время съемки. Эта головная часть, состоящую из модифицированного микроцентрифужных трубки , соединенного с секцией 50 мм гибкой трубки (фиг.2С), закреплен на месте с держателем , состоящей из модифицированных микропробирок (рис 2D) и прикреплена к платформе с изображениями через Липучка , Использование крючков и петель застежки позволяет репозиции сборки головная часть так, что либо уха мыши могут быть отображены, и может быть оптимально сориентирован для отдельных мышей.
Рисунок 2. обордля прижизненной мат ветствующую защитную эк изображений. Построен по индивидуальному заказу платформа формирования изображения в верхней части (A) и сбоку (B). Головная часть для введения изофлурановым (C) и держатель (головная часть D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Катетеризация хвостовой вены позволяет для непрерывного доступа к циркуляции для введения антител и других малых молекул, которые могут диффундировать из сосудистой сети, или более крупные флуоресцентные молекулы, такие как высокомолекулярного декстрана молекулярной маркировать кровеносные сосуды. После введения 100 мкг анти-бета 1 и анти-бета 3 - интегрин блокирующих антител через катетер, ранее подвижных клеток арест в дерме (фильм 2). Эти клетки имеют сниженную среднюю скорость после антитела администрирование (фиг.3А), а также значительное снижение индекса меандра, отношение полного перемещения к общей длине трека (рис 3B).
Рисунок 3. Введение анти-бета 1 и анти-бета 3 антитела ингибирует Th1 клетки миграцию в CFA-воспаленную кожу. (А) Средняя скорость Th1 - клеток до и после введения 100 мкг анти-бета 1 и анти-бета 3 - интегрина блокирующие антитела. (B) индекс Меандеринг клеток Th1 до и после блокады антител. Приблизительно 100 отслеживаемые клетки от изображения до и после блокады антитела из одной мыши в одном типичном эксперименте. Статистика по Манна-Уитни.эс / ftp_upload / 53585 / 53585fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Поскольку волосы не удаляются с поверхности ушной раковины, артефакты обработки изображений с волос являются общими. Автофлюоресценции из волосяных фолликулов (рис 4а) и затенения и автофлюоресценции от вышележащих волос (рис 4В) следует избегать , где это возможно , поскольку они могут скрывать Т - клетки и мешают автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений. Аналогичным образом , пузырьки воздуха в ловушке между поверхностью уха и покровное может привести к появлению артефактов визуализации (рис 4в). Правильная подготовка уха должна минимизировать количество и размер оставшихся пузырьков.
Рисунок 4. Общие артефакты из автофлюоресценции волос и плохой ушей передторных. волосяные фолликулы (А) Autofluorescent. (B) Autofluorescent волос и волосяные фолликулы (зеленый) и коллаген (белый) с вышележащих тени волос, вызывая темных линий в изображении. (C) Артефакт из воздушного пузыря, показывая край перемещенного, autofluorescent ороговевшего эпидермиса (пунктирная линия). Масштабные столбики представляют 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Кроме того, использование нескольких источников тепла может привести к проблемам со стабильностью ткани за счет термического расширения и сжатия. Неправильная настройка термостата, например, может привести к большим колебаниям во время съемки , что может сделать интерпретацию результатов сложных (Movie 3). Крайне важно, чтобы определить оптимальные настройки для любой системы, которая обеспечивает постоянную температуру и добиться максимальной стабильности. UltimatEly, контролируемой температурой камеры формирования изображения является лучшим способом для удаления изменчивости от изменений температуры.
Фильм 1. Th1 клетки , мигрирующие в CFA-воспаленные дермы (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). 30 мин покадровой изображение , показывающее клетки Th1 (зеленый) , мигрирующие в сети кожная коллагена (второй гармоники, синий).
Фильм 2. Th1 клетки сердца при блокаде & beta 1 и & beta ; 3 интегринов (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). Клетки (зеленые) были обследованы в течение 30 мин до administРацион блокирующих антител, а затем в течение еще отображены 20 мин в том же самом месте.
Фильм 3. Колебания с плохо контролируемой нагревательной плиты (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). 30 мин замедленную изображение Th1 клеток (зеленый) и генерации второй гармоники (синий). После того, как это изображение было собрано, было установлено, что нагревательный элемент используется, чтобы иметь неисправный термостат, вызывая колебания в температуре платформы визуализации и последующего термического расширения и сжатия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значение
Здесь мы представляем полный протокол для визуализации 4D, передаваемых антиген-специфических эффекторных Th1 клеток в неповрежденных дермы мыши уха. Этот метод обеспечивает преимущества по сравнению с некоторыми текущими методов визуализации по нескольким причинам. При получении изображений вентральной дермы уха, мы можем отказаться от удаления волос, которые необходимы для протоколов обработки изображений с участием других участков кожи. Хотя депиляторы , как правило , мягкие, они показали , чтобы вызвать разрушение барьера кожи 42, процесс , который может стимулировать иммунный ответ 43,44. Путем также избежать инвазивных хирургических процедур , чтобы обнажить дермы или гиподермы, этот протокол предотвращает повреждение индуцированное воспаление и быстрое рекрутингом нейтрофилов 37 и других иммунных клеток в дерме. Использование венозного катетера в этой системе, чтобы поставить блокирующих антител против ключевых молекул позволяет в режиме реального времени допроса DYNAмикрофонный поведение CD4 Т-клеток. Использование этого протокола визуализации показала наличие критических требований к CD4 Т - клеток интерстициальной моторики 30 , которые не были обнаружены в пробирке в системах 8.
Критические шаги в процедуре
Существенным шагом в любом протоколе визуализации является обеспечение стабильной подготовки ткани для работы с изображениями. Важно, чтобы убедиться, что имеется достаточно PBS, между ухом и покровное, что нет пузырьков воздуха и ухо находится в контакте со стеклом, но не настолько, чтобы вызвать ленту, чтобы стать де-придерживалась из стекла. Аналогичным образом, избегая контакта между лентой, держащей покровное к платформе и любой вакуумной смазки предотвратит ленту от откручивания с течением времени. Температура также должна оставаться постоянной, чтобы избежать колебаний и дрейфа от теплового сжатия или расширения платформы материалов.
Ограничения и Модификации
45. Тем не менее, иммунная население житель уха отличается от кожи на фланге или подушечку 46, и ухо мыши имеет различные свойства сосудов по сравнению с другими участками 47. Таким образом, для некоторых приложений, сопоставление данных изображений уха на другие участки кожи может быть затруднено.
Этот протокол также требует эффективного переноса передаваемых Т эффекторных клеток из крови и в дерму. Это ограничивает возможность использования клеток, которые имеют дефекты в самонаведения или экстравазации, поскольку они не смогут войти в пустотах пространство. кровоизлияниеможет быть обойдена путем инъекции клеток непосредственно в ухо дермы 37,48, хотя это вызовет некоторые механические повреждения и доставки клеток , таким образом , не может резюмировать локализацию или поведение клеток , которые претерпевают в естественных условиях транссудации.
Важно также рассмотреть вопрос об использовании непигментированная мышей - реципиентов для экспериментов с изображениями, таких как / с штамма BALB используемого здесь или мышей альбиноса C57BL / 6- Тир C-2J. Меланина в пигментных мышей, в дополнение к высокой степени autofluorescent, нагревается при даже относительно малой мощности возбуждения от многофотонном лазера 37. Это может вызвать термическое повреждение кожи и последующее воспаление 36 или люминесцентной зернистость 31, усложняя результаты. Это может ограничить флуорофоры, которые могут быть использованы в эксперименте изображений многопараметрической. Тем не менее, некоторые очень яркие или сильно выраженные флуоресцентные молекулы могут быть эффективно возбуждаются при низкой мощности лазера, всеблагодаря эффективной визуализации в пигментированных мышей.
Будущие приложения
Поскольку это неинвазивная процедура, она может быть легко адаптирована для продольных исследований на мышах с последовательной визуализации в течение длительных периодов времени. В то время как флуоресцентной маркировки, как описано здесь, будет исчезать с течением периодов времени больше, чем 3-4 дня, использование эндогенно флуоресцирующих клеток или флуоресцентных репортерных клеток устраняет эту проблему. Действительно, ранее мы использовали этот протокол для отслеживания в vivo- сгенерированные антиген-специфические эффекторы , несущие цитокин репортеров, в том числе репортер IFN & gamma Yeti 30,49 и IL-4 репортер 4get 50. Мы дополнительно визуализированы эндогенного CD4 клеток в CD4-Cre ROSA26-стоп-floxed EYFP мышей флуоресцентный репортер 30. Поскольку флуоресцентные свойства EYFP и других флуоресцентных белков отличаются от химических красителей, таких как CFSE, модификации параметров изображения может потребоватьсядля эффективной визуализации. Такие изменения, как увеличение времени задержки пикселя может повысить флуоресцентного сигнала некоторых тусклых флуорофоров, и уменьшение длины Цайтраферы изображений может смягчить любые фотообесцвечивание, которые могут быть соблюдены. При возбуждении 900 нм, мы ранее не наблюдали значительного фотообесцвечивания CFSE, CMTMR или EYFP через короткие промежутки времени визуализации.
Хотя эта процедура фокусируется на измерении динамики CD4 эффекторных Т-клеток моторики, он не ограничивается этим приложением. Работа продолжается в настоящее время для измерения динамических взаимодействий эффекторных Т - клеток с антигенпредставляющими клетками за счет использования флуоресцентных мышей репортер и инъекции флуоресцентно конъюгированных антител в дерму , чтобы маркировать клетки или структуры ткани кожи до формирующим изображение 51,52. Кроме того, в то время как этот протокол демонстрирует использование катетера для доставки блокирующих антител в то время как изображения, другие соединения, включая низкомолекулярные ингибиторы, можетвводить. В конечном счете, этот протокол обеспечивает гибкую платформу для измерения иммунной динамики с течением времени, в естественных условиях, в неинвазивным способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Рочестерского университета Многофотонная Микроскоп Основной объект за помощью живого изображения. При поддержке NIH AI072690 и AI02851 к DJF; AI114036 к AG и AI089079 к ГГО.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
