Summary
Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.
Introduction
Mayoz gametlerin (oosit ve sperm) oluşur ve mayoz-I ve mayoz-II, sırasıyla 1 sırasında homolog kromozom ve kardeş kromatidler ayırmak için DNA sentezini müdahale olmadan iki ardışık bölümler içeren benzersiz bir bölünme sürecidir. Oositlerde öz değişmesine ait bölünme sırasında kromozomların dağılması hatalar fertilizasyon esnasında embriyo tarafından devralınır anoploidi, neden olabilir. Özellikle, gelişmekte olan embriyolarda anöploidi sıklığı anne yaşı ilerledikçe artar ve kadınlarda 1,2 gebelik kaybı yanı sıra konjenital doğum kusurları önemli bir nedenidir, bu nedenle, mayoz bölünme sırasında anöploidinin moleküler temelini anlamak için önemli bir ihtiyacı vurgulayan .
Hücre bölünmesi sırasında, kromozom ayrımı ters göbeğine doğru eki için mikrotübül mili aparatı ve istikrarlı kromozom-mikrotübül etkileşimlerin kurulması montajı ile ilgili hayati bağlıdırkutuplar. Önemli olarak, memeli oositlerinde öz değişmesine ait iğ formasyonu somatik hücrelerde mitoz farklıdır ve benzersiz mikrotübül organize merkezleri sentriyoller 3,4 eksikliği (MTOCs) tarafından düzenlenir. Mikrotübül çekirdeklenme ve organizasyon için gerekli esansiyel proteinler mikrotübül düzeneğini katalize γ-tubulin dahil oosit MTOCs, lokalize. Buna ek olarak, MTOCs 5 de bağlanan bir esas iskele proteini olarak işlev görür ve ankraj γ-tubulin gibi diğer faktörler pericentrin. Özellikle, çalışmalarımız önemli MTOC ilişkili proteinlerin tükenmesi mayoz iğ organizasyon bozar ve tam mili montaj kontrol noktasında (SAC) 6,7 tarafından çözüldü olmayan oosit kromozom ayrımı hataları neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, mayoz tutuklanmasını tetiklemez iğ istikrar kusurları, anöploidi katkıda önemli bir risk oluşturmaktadır. Mili montaj ve organizasyon, oosit MTOC prot önemli rolleri rağmenein kompozisyon ve fonksiyon pek iyi anlaşılamamıştır.
Hücreler kısa mayoz 8,9 yeniden başlaması öncesinde transkripsiyonel sakin olmak gibi memeli oositlerinde belirli hedef proteinlerin fonksiyonlarını test zordur. Bu nedenle, ön-ovulatuar oosit mayoz devam etmek için anne mRNA mağazaları güveniyor ve mayoz bölünme yanı sıra gübreleme 10,11 sonra ilk bölünme bölünmeleri destekler. Memeli oositlerinde mRNA transkriptlerinin RNA interferans (RNAi) aracılı degradasyon etkinliği iyi bilinmektedir ve mayoz olgunlaşma sırasında çeviri için işe anne RNA'lar siRNA 12-14 hedefleme için özellikle uygundurlar. Bu nedenle, oosit içine kısa müdahale RNA'lar mikroenjeksiyon (siRNA) fonksiyonel test için hedef mRNA'ları tüketmek için değerli bir yaklaşım sağlar.
Burada, fare oositleri ve spesifik Transcri siRNA aracılı tükenmesi izolasyonu için yöntemleri tarif ederPTS pericentrin temel bir MTOC ilişkili proteinin fonksiyonunu test etmek. Buna ek olarak, oositlerde öz değişmesine ait iğ formasyonunun değerlendirmek için immünofloresan analiz koşulları açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlıklar
- Taze oosit kültür, satın alma ya da için minimum temel ortam (MEM) hazırlanması ve Tablo 1 'de tarif edilen 3 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) ile tamamlar. (Sıfıra dara), bir yükleme dengesine bir polistiren şişe yerleştirin. Amacıyla, BSA hariç tüm reaktif maddelerin ilave edin ve 250 g'lık bir toplam ağırlık ile MQ su ile son hacim getir. Ardından, BSA eklemek çözülür ve filtre sterilize izin verir.
Not: Açıklanan MEM ortamı,% 5 CO2,% 5 O2 ve% 90 N2 medikal gaz karışımı ile dengeye ve hücre inkübasyon gerektirmektedir. Bununla birlikte, diğer bir araç (örneğin, CZB) atmosferik şartlar altında% 5 CO2 hücre inkübasyon için izin veren kullanılabilir. - Oosit mikroenjeksiyon için, satın almak ya da M2 orta hazırlayın.
- P hazırlayın5 IU / 100 ul bir konsantrasyona kadar regnant kısrak serum gonadotropini (PMSG).
- Satınalma ve 1 mcM bir çalışma konsantrasyonu siRNA stoklarını sulandırmak.
2. Fare Oosit Toplama
- 1. GÜN: over folikül gelişimini teşvik ve ön ovulatuar folikül sayısını artırmak, periton oosit toplama 48 saat önce dişi farelere PMSG 5 IU yönetmek için.
- GÜN 3: Yumurta toplama ve kültür için 1 mcg / ml milrinon ile desteklenmiş MEM / BSA 3 ml 35 mm kültür kaplarına kurdu. Bu fosfodiesteraz inhibitörü olarak oosit tutar profaz-ı tutuklamak ve germinal vezikül dökümü (GVBD) engeller. En az 15 dakika boyunca tıbbi gaz karışımı içinde kültür kaplarına dengelenmesi.
Not: Milrinon desteklenmiş ortam oosit toplama ve oosit mikro enjeksiyon ve 24 saatlik kültür tutma sonrası dönem boyunca siRNA gereklidir. - 15 uygulamaları kurulan laboratuvar ile dişi farelerin yumurtalıkları almak ve önceden ısıtılmış olan yeni bir kültür çanak transfer ve MEM / BSA / milrinon dengelenmiş.
- Oosit toplanması için bir stereomikroskopta aşamasında kültür çanak yerleştirin. Yayın cumulus-oosit kompleksleri (COC) 'ın elle 27 G iğne ile antral folikülleri delinmesiyle. 1 ml şırınga bağlı 27 G iğne ile, kültür çanak tabanına bir yumurtalık saptamak ve tüm büyük folikül delinme için ikinci bir iğne kullanımı. Her yumurtalığın için tekrarlayın.
- Kompakt kümülüs hücrelerinin 2 veya daha fazla kat çevrili tüm oosit toplamak, standart ağız pipet prosedürleri veya oosit aspirasyonu diğer araçları kullanma. Yeni bir çanak COC en aktarın ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Dikkatle 750 ul'lik bir aspirasyon hacmi ayarlanmış bir 1 ml'lik pipet ile tekrar yumuşak pipetleme çevreleyen kümülüs hücreleri çıkarmak. Pipet adım yaklaşık 12 kez tekrarlayınve oositler 5 dakika süre kurtarmak için izin verir. Tamamını veya kümülüs hücrelerinin çoğu ortadan kadar bu şekilde devam edin. Başka bir kültür tabağına soyulmuş oositler aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de dengelenmeye bırakın.
- Hesaba ilgili hedef karşı spesifik siRNA'lar (i), mikroenjeksiyon, spesifik olmayan (kontrol) siRNA'lar, (ii) mikroenjeksiyon, ve (iii) olmayan bir enjekte edilmiş kontrol grubu üç deneysel gruba soyulmuş oositler tahsis için kullanılacak Kültür koşulları.
3. Oosit Mikroenjeksiyon
- Oosit Mikroenjeksiyon için milrinon (1 ug / ml) ile takviye edilmiş 3 mi M2 medya ile kültür kaplarına ayarlayın. Yıkama ve enjekte edilen oositlerin daha sonra kültür için MEM / BSA / milrinon ihtiva eden kültür kaplarına hazırlayın.
Not: M2 ortamı HEPES tamponu içerir ve atmosferik koşullar altında, 15 dakika boyunca 37 ° C'de ön ısıtmaya gerektirir. MEM tarif tıbbi gaz kullanılarak ön ısınma ve dengeleme gerektirirYukarıda d. - Mikroenjeksiyon sistemi hazırlayın. 1 mcM belirli siRNA çözeltisi 5 ul enjeksiyon iğnesi yükleyin. Mikroenjeksiyon sistemi mikromanipülatörler tutma pipet ve enjeksiyon iğnesi Güvenli ve kalibre hacmi ve basınç Enjeksiyon Ünitesi kurmak.
- 3 cm kültür çanak kapağın iç tarafında M2 medya 200 ul mikro damla yerleştirin ve kurmak ve mikroenjeksiyon sistemi uyumu için bir oosit ekleyin.
- Bir kılavuz olarak oosit kullanarak, holding ve enjeksiyon iğneleri konumlarını ayarlayın. Nazikçe oosit güvenliğini sağlamak ve hücrenin en geniş çaplı enjeksiyon iğnesi konumunu ayarlamak için tutma pipet negatif basınç uygulayın. Her yerde oosit sitoplazmaya siRNA çözeltisi yaklaşık 10 ul mikroenjeksiyon izin ayarları yapın.
Şekil 1. Oosit mikroenjeksiyon kurdu. ( - Stereomikroskopta sahneye kapağı dönün ve taze M2 medya 200 ul mikro damla ekleyin. Ağız pipetle veya alternatif yöntemlerle mikro damlasına kadar oosit bir grup (~ 10) ekleyin, daha sonra mikroenjeksiyon aşamasına mikro damla ile kapağı dönün.
- Bireysel oosit Microinject geçin. Yavaş yavaş sitoplazmaya enjeksiyon iğne ucu yerleştirin tutan pipet ile tek oosit Güvenli ve siRNA çözümünün enjeksiyon hacmi sınırdışı. Dikkatle iğne ve mo gerimikro-damla altındaki bir pozisyonda enjekte oosit ziyaretinde. Mikro-damla üstünde bir konuma başarısız enjekte oosit taşıyın.
- Her oosit ile mikroenjeksiyon işlemi tekrarlayın. Her seferinde uygun oosit canlılığı, oosit Microinject az sayıda korumak için. Bu süreç mikro damla sıcaklık ve pH değişiklikleri önlemek için birkaç dakikadan fazla sürmüyor emin olun.
- Aspire başarıyla oosit enjekte veya dikkatlice stereomicroscope enjekte oosit mikro damla ile kapağı hareket ettirin. Yıkama ve 37 ° C'de dengelenmeye / BSA / milrinon orta MEM, ağız pipetleme ve alternatif metodlar ile enjekte uygulanabilir oosit aktarın.
- Oosit başka bir grup kullanarak, kontrol grubu için non-spesifik siRNA'lar yüklü yeni bir enjeksiyon iğnesi ile mikroenjeksiyon işlemi tekrarlayın. Ayrı bir kültür çanak MEM / BSA / milrinon ve transfer oosit yıkayın.
- Kültür tüm gruplarınTıbbi bir gaz atmosferi altında, 37 ° C'de MEM / BSA / milrinon 24 saat oocytes.
Not: 'milrinon blok' kültür dönemi verimli hedef mRNA / protein tükenmesi için gereklidir.
Mayotik Matürasyon 4. Oosit Kültürü
- GÜN 4: oosit oluşturduğu her bir deney grubu için 3 ml MEM / BSA ile kurulumu 4 kültür kaplarına (35 mm). Oosit olgunlaşması için kullanımı,% 10 (yüksek kalitede) cenin sığır serumu (FBS) ile birlikte grup başına bir ortam çanak Supplement. Tüm kültür tabakları tıbbi gaz karışımı ile 37 ° C 'de dengelenmeye bırakın.
- Sırayla, 'milrinon bloğu' dan oosit serbest MEM / BSA içeren yemekler oosit üç defa yıkamak ve daha sonra% 10 FBS ile ortamı içeren olgunlaşma çanak oosit aktarmak için. Kültür, 37 ° C'de 17 saat boyunca tüm oosit gruplan, yeniden başlamasını ve mayoz ilerlemesini sağlarlar.
- 5. GÜN: oosit çapraz ba¤ hazırlanın çözümlertion, aşağıdakileri içeren: (i) PEM tampon maddesi içinde% 4 paraformaldehid (PFA) (100 mM PIPES [pH 6.9], 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA)% 0.5 Triton-X 100, ve (ii) PBS 5 ile takviye edilmiş olan yıkama ve oosit engellemek için kullanılacak% FBS.
Not: Bu çözümler öncesinde oosit tespitin 37 ° C-ısınma ön gerektirir. - (17 saat kültürden sonra) oositi tespit için, hızlı bir şekilde 750 ul ihtiva eden ağız pipetleme ya da (4-iyi bir çanak) bireysel çukurlar halinde alternatif yöntemler ile oosit oluşturduğu her bir deney grubu transferi% 4 PFA çözüm, önceden ısıtılmış ve 37 ° C'de inkübe 1 saat ° C. Daha sonra,% 5 FBS içeren önceden ısıtılmış PBS 750 ul, 3 kez (her biri 15 dakika) oositler, her grup yıkayın.
- 4 ° C'de 200 ul PBS /% 5 FBS O / N Blok oositler bağlama spesifik antikor en aza indirir.
5. İmmünofloresan Analizi
- GÜN 6:
Not: Bağışıklık boyaması bir çok-çukurlu plaka ve solüsyonu ° yapılırytes seri ilgili antikor ve yıkama çözümleri içeren sıralı yuvalara aktarılmıştır. Ya 48 ya da 96 oyuklu plakalar kullanılabilir sadece iyi boyutuna göre çözelti hacmini ayarlar. 96 oyuklu plakalar, oyuk başına 200 için ul kullanın. - 3 yıkanmaktadır - İkincil antikor çözeltisi - 3 yıkanmaktadır primer antikor çözeltisi: Oositler aşağıdaki sırayla farklı çözümler aktarılır. Plaka folyo ile kaplı olabilir ışık maruz kalma sınırı.
Taze PBS /% 5 FBS hazırlayın ve antikor çözeltiler elde etmek için, bu çözelti (örneğin, tavşan anti-pericentrin (1/1000), fare anti-tubulin (1/1000)). - Primer antikor solüsyonu (daha az hacim arzu edildiği takdirde veya 100 ul) 200 ul ihtiva eden tek tek oyuklara her bir deney grubu sabit oosit aktarın ve de parafilm ile kaplayın. Uygun antikor özel koşullara göre inkübe (örneğin 1 saat veya 4 ° CO / N 37 ° C).
Not: Primer antikor dilution yanı sıra, özel bir inkübasyon süresi ve sıcaklık, kullanılan farklı antikorlar için uygun koşulları belirlemek için test gerektirir. - Primer antikor ile inkübe edildikten sonra, PBS /% 5 FBS (10-15 dk) oosit üç kez yıkayın.
- Floresan-konjuge sekonder antikor ihtiva eden çözelti içine oosit aktarın (örneğin, farklı dalga boylarında florokromlar ile konjuge edilmiş anti-tavşan ve anti-fare antikorlarının 1/1000 seyrelti). 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin.
- (- 15 dakika her biri 10) PBS /% 5 FBS oosit üç kez yıkayın.
- Son yıkama adımından sonra, temiz bir cam slayt üzerine oosit transferi ve hafifçe herhangi bir fazla yıkama solüsyonu aspire. Bu cam yüzey üzerinde oosit hareketsiz olacaktır. Medya (DAPI içeren) Montaj 8 ul ekleyin ve dikkatli bir 22 mm x 22 mm kapak kayma montaj ortamı kaplaması. Oosit, hava kabarcığı ve / veya zarar vermemek için yavaş yavaş lamel indirin.
Not: Alternatif olarak, konfokal mikroskopi analizi için oositin 3 boyutlu özelliklerini korumak önceki slaytta montajı için kapak kayma köşelerine 100 mikron cam boncuklar (vazelin ile karışık) küçük hacim eklemek için. - 4 ° C'de saklayın saydam ya öz değişmesine ait ilerlemesi değerlendirilmesi olarak kullanılan sekonder antikor eşleştirmek için gerekli olan filtreler ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu kullanılarak ifade seviyeleri ve subsellüler protein lokalizasyonu analizine devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SiRNA'lar Mikroenjeksiyon in vitro farklı hedef faktörlerinin etkin ve yüksek düzeyde spesifik fonksiyonel test sağlar oositlerde mRNA bozulması ve daha sonra da protein tükenmesi için etkili bir yaklaşım sağlar. Daha sonra, belirli bir fenotip immünofloresan analizi için kullanılan olarak siRNA enjekte edilmiş oositlerde protein tükenmesi doğrulamak için. Mevcut örnekte, anti-tubulin ve anti-pericentrin antikorları ile birlikte DAPI ile ayrı oosit floresan etiketleme etkin: olarak pericentrin tükenmesi (i) onay (ii) kontrol hem de kromatin ve mayoz milli olarak kapsamlı bir değerlendirme ve Pcnt - tüketilmiş oosit.
Non-spesifik kontrol veya Pcnt siRNA'lar ile microinjected oositlerin Temsilcisi immünofloresan görüntüleri. Şekil 2'de 7 gösterilmektedir 17 saat kültürü takiben, çoğu kontrol oosit metafaz-II Geyiği ulaştıe ve iğ direkleri (Şekil 2A) hizalı kromozomlar ve parlak pericentrin etiketleme ile mayoz iğ organize içerir. Özellikle, pericentrin bu hücrelerde demonte etkin protein teyit Pcnt siRNA ile enjekte edilmiş oositlerde tespit edilmemiştir. Ayrıca, Pcnt tükenmiş oosit çoğunluğu metafaz-ı aşamada kaldı ve yanlış hizalanmış kromozomlar (Şekil 2B) ile dağınık mili yapıları sergilerler. Metafaz-II ilerledi birkaç Pcnt tükenmiş oosit da kesintiye iğ (Şekil 2C) sergiledi.
Şekil 2. fare oosit mayoz mil örgütün İmmünofloresan analizi ya (A) enjekte oosit Temsilcisi görüntüleri (B, C), belirli Pcnt ile non-spesifik siRNA'lar veya kontrol edebilirsiniz. -siRNA'lar. Oositler çift etiketli bir araya mikrotübül saptanması (yeşil) için bir anti-asetillenmiş α-tubulin antikoru ile anti-pericentrin (kırmızı) ile idi. DNA DAPI ile etiketlendi ve mavi gösterilir. Içerlek mili kutup alanının 2X büyütme gösterir. Oklar hizadan kromozomlarını ifade etmektedir. * Mil kutup. Pb: Birinci polar body. 10 mikron Ölçek çubuğu. Bu rakam Ma ve Viveiros, 2014 7 den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tüm reaktifler MEM. Listesinin hazırlanması ve MEM 250 ml hazırlamak için gerekli belirli miktarlarda Tablo 1. Reçete. Ortam 7 günlük bir süre için 4 ° C de 0.45 mikron selüloz asetat (CA) membran filtre ünitesi kullanılarak steril ve depolanan bir filtredir.
| Kimyevi | Amount |
| Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (10x) | 25 mi |
| Sodyum bikarbonat | 0,550 g |
| Piruvik asit | 0.0063 g |
| Penisilin G | 0.0188 g |
| Streptomisin Sülfat | 0.0125 g |
| L-Glutamin | 0,073 g |
| EDTA disodyum tuzu dehidratı | 0.1 mg |
| Esansiyel Amino Asitler (50x) | 5,0 mi |
| MEM Vitamin Karışım (100x) | 2,5 mi |
| Fenol kırmızı çözelti | 0,2 mi |
| Sığır Serum Albumin (BSA) | 0,75 g |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Örneğin elektroporasyon transfeksiyon ve somatik hücreler, ekzojen nükleik asit aktarımı için çok sayıda yöntem vardır birlikte, mikro-enjeksiyon, transkripsiyonel olarak hareketsiz bir fare oositlerine RNA moleküllerinin verilmesi için uygun bir yöntemdir. Mevcut protokol farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel test sağlayan spesifik mRNA in vitro tükenmesi için etkili bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşım, verimli transkript tükenmesi ile sonuçlanır ve son derece uyarlanabilir. SiRNA'lar özellikle Pcnt transkript hedef için kullanılabilir olmasına rağmen, benzer koşulların hemen her genin hedeflenmesi için kullanılabilecektir.
Yumurta toplama, kültür ve manipülasyon dahil olmak üzere bu protokolün çeşitli yönleri, oosit kalitesini korumak ve teknik eserler önlemek için pratik ve deneyim gerektirir. Kültür ortamının pH ve / veya sıcaklık dalgalanmalar çalışma e kaçınılmalıdırxpediently ve dikkatli. Oosit küçük gruplar Mikroenjeksiyon ve zararlı sıcaklık değişimleri sınırlayacaktır mikroenjeksiyon sisteminde ısıtılmış bir aşamada bulunması. Önceden valide siRNA'lar kullanılması tavsiye edilir ve verimli hedef protein tükenmesi immünfloresans veya Western blot tarafından onaylanması gerekiyor. Bazı adımlar farklı ilgi genleri hedef değişiklik gerektirecektir. Örneğin, önerilen 24 saat milrinon-desteklenen ortamda çeşitli siRNA'lar için geçerlidir 'dönemi tutun'. Ancak, bu süre özellikle uzun yarılanma ömrü olan yüksek miktardaki mRNA ve / veya hedef proteinler için ayarlamalar gerekebilir, ya da daha az bol hedefler için kısaltılmış olabilir. Ancak, bu oosit kalitesi ve mayoz potansiyeli en iyi 24 saat ya da daha az tutun dönemleri kullanılarak korunur dikkate almak önemlidir. Oosit işleme ile Dikkat ayrıca fiksasyon ve immünfloresan analizi sırasında ihtiyaç vardır. 37 ° C 'de Oosit sabitleme mikrotübül depolymer sınırlarDaha düşük sıcaklıklarda meydana gelir, ve daha iyi leştirilmesi, öz değişmesine ait mili yapısını korur. Bununla birlikte, bu koşullar, konu olan hedef proteine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Buna ek olarak, immünofloresans için en uygun koşullar (örneğin, antikor konsantrasyonları yanı sıra inkübasyon süresi ve sıcaklık) zamanda tüm antikorlar için kurulan ve siRNA mikroenjeksiyon yürütülmesi titizlikle önce test edilmesi gerekir.
Oosit canlılığı yalnızca kültürde sınırlı bir süre için sürdürülebilir olarak bu teknik etkin mayoz bölünme geçmesi oosit kalitesi ve yeterliliği korur makul bir süre içinde son derece bol protein tüketmek olmayabilir. Hypomorph fenotipleri, hedef transkript kısmen demonte gözlenebilir. Bununla birlikte, özel morpholinos birlikte-enjeksiyon çeviri ek inhibisyonu için bir paralel bir strateji olarak kullanılabilecektir. Bazı sınırlamalar potansiyel aşağı analy olarak da mevcutturmicroinjected oosit ile mümkün olan sis. Örneğin, gerekli kullanım ve genişletilmiş kültür başarılı in vitro fertilizasyon (IVF) tabi ve pre-implantasyon embriyo gelişimi üzerindeki fonksiyonel etkileri çalışmayı engelleyecek oosit kapasitesini sınırlayabilir. Ayrıca, büyük çaplı örneğin immüno-lekeleme ya da biyokimyasal tahlilleri gibi bazı alt uygulamalar için gerekli olan bu yaklaşım ile elde etmek zordur.
Bazı kısıtlamalara rağmen, bu yaklaşım oositlerdeki farklı faktörlerin fonksiyonel test sağlar ve farklı araştırma grupları tarafından başarıyla kullanılmaktadır belirli mRNA'ların in vitro tükenmesi etkili teşvik etmektedir. Oosit kaybı fonksiyon-analiz genellikle (şartlı) nakavt veya transgenik RNAi fare modelleri nesil içerir. Her iki yaklaşım da emek ve zaman yoğun bulunmaktadır. Bunun aksine, in vitro olarak siRNA mikroenjeksiyon hali hazırda belirgin fonksiyonel test edilmesi için de kullanılabilirdaha az zaman ve kaynaklar. Bir nakavt / transgenik fare modeli üretme görevi başlamadan önce hedef proteinin fonksiyonel etkileri hakkında fikir edinmek için özellikle değerli bir yaklaşımdır.
SiRNA mikro enjeksiyon ve immünofloresan analiz kombinasyonu siRNA aracılı hedef protein tükenmesine karşılık olarak öz değişmesine ait ilerlemesinin değişik aşamaları sırasında protein ekspresyonu ve hücre içi dağılımı desen çalışma için güçlü bir analitik araç sağlar. Oositten oosit siRNA'nın etkinlik potansiyel farkları kolaylıkla tanımlanabilir ve başarılı hedef protein tükenmesi ve fenotipik / fonksiyonel analiz arasında doğru korelasyon için izin verir. Histon H2B-GFP füzyon-proteinleri (ya da diğer floresan etiketli belirteçleri) kodlayan şapkalı haberci RNA'lar belirli siRNA moleküllerinin eş enjeksiyon için protokoller daha da geliştirilmesi canlı cel tarafından gerçek zamanlı olarak hedef protein fonksiyonunun değerlendirilmesini sağlayacakl görüntüleme.
Özetle, uygun şartlarda, transkript susturma için siRNA mikroenjeksiyon gibi immünoflüoresans analizi gibi diğer güçlü analitik araçlar ile birlikte, özellikle hücre bazında bir hücre, fare oosit belirli hedef proteinlerin fonksiyonlarını test etmek için değerli bir mekanik bir yaklaşım sağlar. Bu kombine yaklaşım, MTOC ilişkili proteinler tüketen ve mayoz iğ formasyonunun elde etmek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P.
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
