Summary
기형에 노출되면 기형아 출산의 원인이 될 수 있습니다. 제브라 피쉬는 화학 물질의 기형 가능성을 결정하는 데 유용합니다. 우리는 노출의 서로 다른 시간에 또한 아질산염의 다양한 수준에 배아를 노출에 의해 제브라 피쉬의 유틸리티를 보여줍니다. 우리는 아질산염은 독성이 심한 발달 결함을 야기 할 수 있음을 보여준다.
Abstract
환경에서 높은 질산 수준은 인간의 선천적 결함이나 유산의 원인이 될 수 있습니다. 아마도 이것은 장내 세균 및 타액에 의한 아질산 질산염의 전환에 기인한다. 이들은 불량 생식력을 초래할 수 있지만, 그러나, 다른 포유 동물 연구에서, 높은 수준의 아질산염은 기형아 발생하지 않는다. 따라서, 아질산 기형 전위는 명확하지 않다. 쉽게 아질산 또는 관심있는 다른 화학 기형의 효과를 평가하기 위해 척추 동물 모델 시스템을 갖는 것이 바람직하다. 여기서 우리는 독성과 배아 결함 화합물을 선별 제브라 피쉬 (다니오 레 리오)의 유틸리티를 보여줍니다. 제브라 피쉬 배아는 그들에게 기형 연구에 대한 좋은 모델을, 외부 적으로 수정 된 및 급속한 발전을하고 있습니다. 우리는 부정적인 아질산염의 노출 시간을 증가하는 것은 생존에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 질산하지 않는 반면 아질산염 농도를 증가하면 악영향 생존에 영향을 미친다. 배아 그쪽으로 들어t는 아질산염 노출을 생존, 다양한 결함이 심낭을 포함하여, 발생할 수 방광 noninflation 및 두개 안면 기형 수영, 주머니 부종 노른자. 우리의 결과는 제브라 피쉬가 아질산염의 기형 가능성을 연구하기위한 편리한 시스템을 나타냅니다. 이 방법은 용이하게 이른 척추 발달에 미치는 영향에 대한 다른 화학 물질을 테스트하도록 구성 될 수있다.
Introduction
기형이 심한 경우 1 영구 구조적 및 기능적 비정상 성장 지연, 또는 유산시킴으로써 태아의 정상적인 발달을 방해하는 과정이다. 그것은 여러 가지 방법으로 2 배아 발달에 방해가 특정 자연 에이전트 (기형)에 의해 발생 될 수있다. 인간의 태아 개발하는 동안, 방사선, 감염 인자, 독성 금속 및 유기 화학 물질 등의 일반적인 기형은 형태 발생 오류를 통해 epicanthic 주름의 결함 (상부 눈 뚜껑의 피부 배) 및 clinodactyly (곡선 손가락이나 발가락)을 일으키는 것으로보고되고있다 1.
기형의 분자 메커니즘을 이해하는 것은 치료 및 예방을 개발하기위한 첫 단계입니다. 이러한 아프리카 여러 척추 동물 모델 terat 영향 분자 경로를 결정하기 위해 사용되어왔다 개구리 (Xenopus의 laevis의 용) 및 지브라 피쉬 (다니오 레 리오)를 발톱병원균에. 이전의 연구는 역학, 독성학 및 기형 3-7의 모델로 제브라 피쉬를 사용했다. 숄츠 등. 환경 독성 평가를위한 "골드 표준"으로 간주 제브라 피쉬. 이는 8 발생으로 연구자들이 발달 결함을 가시화 할 수 제브라 피쉬 배아의 투명성에 부분적으로 기인한다. 인간 유전자의 약 70 %는 인간의 결함 (9) 공부 제브라 피쉬에게 바람직한 척추 동물 모델을 만들고, 제브라 피쉬에 orthologues 있습니다.
다른 연구는이 협회 12을 지원하지 않는 반면 일부 역학 연구 농장 음식과 물에 일반적으로 존재하는 질산염과 아질산염을, 제안, 출생 결함이나 자연 유산 (10, 11)과 연결되어 있습니다. 질산염 (NO 3 -) 및 아질산 (NO 2 -) 토양과 물에 자연적으로 존재한다. 이들은 식물 질소의 공급원이며, N의 일부itrogen주기 13. 이러한 질산 높은 비료를 사용 농장에서 녹색 콩, 당근, 호박, 시금치, 및 사탕무 등의 식품이 크게 질산염과 아질산염 (7)의 수준을 증강했다. (주로 토양 유출 30) 높은 질산 물에 높은 질산 음식과 물고기가 공급 소에서 우유 질산염과 아질산염 (14)의 많은 양을 소비하는 인간으로 이어질 수 있습니다. 질산염과 아질산염은 일반적으로 극적으로 인간 (12)에 의해 섭취 양을 증가 식품 보존에 사용된다.
질산염과 아질산염의 최적 수준은 혈관 항상성과 기능, 신경 전달 및 면역 호스트 방어 메커니즘 13-15과 같은 생리 학적 과정에 중요한 역할을한다. 그러나, 질산염과 아질산염의 높은 수준에 노출, 특히 유아와 어린이 16, 부작용을 초래할 수 있습니다. 섭취 질산 미생물에 의해 일의 구강에서 아질산염에 추가 변환입니다장내 미생물 (17)에 의해 전자 위장관.
질산염은 능력 (18)을 들고 그 산소로부터 헤모글로빈을 손상, 메트 헤모글로빈에 헤모글로빈의 산화에 의해 파란색 아기 증후군 위험이 높은 유아를 둔다. 이것은 더 심한 경우에 말초 조직을 확장하고 피부의 푸른 색을 초래한다. 다른 증상의 조직 결과의 억제 산소는 가장 심각한 혼수 및 사망 19, 20 선도. 비슷한 증상은 질산염 (21)의 높은 농도에서 아기와 성인에서 관찰된다. 상승으로 인한 청색증, 두통에서 아질산염 중독 결과에 성인 메트 헤모글로빈 수준, 호흡 장애 (31), 사망으로 인해 중요한 조직의 저산소증 (32, 33)과 관련된 합병증을 치료하지 않으면.
더 높은 수준에서 섭취 한 질산염은 다양한 건강 합병증이 발생할 수 있습니다. 어린 시절 당뇨병, 재발 성 설사 및 재발 성 호흡기 감염어린이 높은 질산 흡입 11,17,22와 연결되어있다. 질산 높은 만성 노출은 배뇨 비장 출혈과 관련된다. 질산염에 급성 고용량 노출은 복부 통증, 근육 약화, 대변과 소변, 실신 혈액과 죽음 (11)과 같은 건강 상태의 다양한 스펙트럼으로 이어질 수 있습니다. 높은 수준의 질산에 태아 노출은 신경 튜브와 근골격계 결함 (11)와 연결되었습니다.
최근의 보고서는 아질산염과 제브라 피쉬 배아를 치료하는 낭 부종, 두개 안면 기형 및 축 노른자하도록 인도하고, 방광 noninflation 5 수영 것으로 나타났다. 본 연구는 잠재적 인 기형 발생을 결정하는 질산염과 아질산염 제브라 배아를 치료하는 방법을 보여준다. 배아는 다른 농도와 시간의 상이한 길이에 아질산 노출시켰다. 그것은 확립 된 기형 23 때문에 에탄올, 양성 대조군으로 사용 하였다. 영형UR 방법은 아질산염에 높은 농도의 긴 노출 시간 모두 생존에 불리했고, 심한 (총 발달 결함)에 경도 (부종)에 이르기까지, 다양한 표현형의 결과 것으로 나타났다. 따라서, 제브라 피쉬가 직접 역학 연구를 보완하기 위해 배아에 질산염과 아질산염의 잠재적 인 기형 효과를 탐험을위한 유용한 모델입니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 설명하는 절차는 펜실베니아의 인디애나 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 수확 배아
- 28.5 ° C, pH가 7, 500-1,500 μS 사이의 전도성에 제브라 피쉬를 유지하고, 14 시간 조명 및 10 시간 24 어둠의 빛 / 어둠주기. 이러한 TU, AB 또는 TU / AB 하이브리드와 같은 야생형 균주를 사용합니다. 다른 균주는 화학 처리 (25)에 다르게 반응 할 수 있습니다.
- 상대 탱크에 물고기 시스템의 물을 첨가하여 수확 계란 전날 밤에 짝짓기를 위해 물고기를 설정합니다. 탱크로 남성과 여성의 물고기를 추가하고 분배기와 물고기 두 마리를 분리합니다. 각 생선 쌍은 50-300 계란의 범위를 생성합니다. 충분한 계란 물고기 30 쌍을 설정, 생산됩니다 보장합니다. 일반적으로, 주요 결합 나이에 생선 쌍의 약 50 % (6-9 개월)는 최대 200 쌍 당 계란, 최대 3 최대 결과, 계란을 생산합니다이 실험을 위해 000 계란입니다.
- 표시등이 켜지 후 다음날 아침, 짝짓기를 시작하는 디바이더를 제거합니다. 계란마다 15 분 상대 탱크를 확인합니다.
- 물고기가 알을 낳기되면, 차 여과기를 사용하여 모든 배아를 수확 E3 버퍼 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 CaCl2를, 0.33 mM의 황산 4) 하나의 대형 컨테이너로 결합. 1.5 HPF에서 제거하고 해부 현미경 플라스틱 전송 피펫으로 미 수정 난자를 폐기합니다. 수정란은 34 투명하면서 미 수정 난은 불투명하다.
- 각 처리 조건 50 ㎖ E3 버퍼를 포함하는 100 × 15mm 유리 페트리 접시에 넣고 50 배아. 식기 (33)의 총 11 처리 조건으로 3 회 반복을 위해 필요하다.
2. 치료 배아
- 2 시간 포스트 수정 (HPF) (35)에서 치료를 실시하고 있습니다. 28.5 ° C에서 배아 / 애벌레를 품어 120 HPF에서 유충을 검사합니다. 레아에서 수행세인트 통계 분석을 위해 각 처리 조건의 세 가지 복제.
- HPF (2)에 3 페트리 접시 (각 함유 배아 50)의 경우, 전달 피펫으로 E3 버퍼를 제거하고 E3 완충액에 희석 된 300mM의 에탄올 50 ㎖를 추가한다. 에탄올의 증발을 최소화하기 위해 파라 필름으로 배양 접시를 커버.
- 22 시간 동안 에탄올 배아를 노출 계속합니다. 그런 다음 전송 피펫과 에탄올을 제거합니다. E3 버퍼의 50 ML을 추가하고 에탄올을 씻어 접시를 여러 번 소용돌이 친다. 전송 피펫으로이 E3 버퍼를 제거하고 세척 단계를 2 회 이상 반복한다.
- 2 HPF에서 3 페트리 접시 (각 포함 50 배아)의 경우, 전송 피펫으로 E3 버퍼를 제거하고 새로운 E3 버퍼 50 ㎖를 추가합니다.
- 이 HPF 9에서 배양 접시 (각 함유 배아 50)의 경우, 전달 피펫으로 E3 버퍼를 제거하고 E3 완충 용액 1,000 ㎎ / ℓ의 아질산 나트륨 50 ㎖를 추가한다. 사전을 사용하여 스톡 아질산 용액의 농도를 확인디아 조화의 수정 (USEPA 방법 354.1) 분광 방법 28.
- 46 시간 동안 3 요리, 70 시간 동안 3 요리와 94 시간 동안 3 요리를 노출 계속합니다. 매일 갓 만든 아질산염 용액으로 아질산염 용액을 교체합니다.
- 각각의 노출 시간 후, 전송 피펫과 아질산염을 제거합니다. E3 버퍼의 50 ML을 추가하고, 아질산염을 씻어 접시를 여러 번 소용돌이 친다. 전송 피펫으로이 E3 버퍼를 제거하고 세척 단계를 2 회 이상 반복한다.
- HPF (2)에 3 페트리 접시 (각 함유 배아 50)의 경우, 전달 피펫으로 E3 버퍼를 제거하고, 200 ㎎ / ℓ의 아질산 나트륨 50 ㎖를 추가한다. 400, 600, 800이 단계를 반복하고, 아질산 나트륨을 1,000 ㎎ / ℓ.
- 70 시간 동안 아질산염으로 배아를 노출 계속합니다. 매일 갓 만든 아질산염 용액으로 아질산염 용액을 교체합니다.
- 노출 시간 후, 전송 피펫과 아질산염을 제거합니다. E3 버퍼의 50 ML을 추가하고 여러 접시를 소용돌이시간은 아질산염을 씻어. 전송 피펫으로이 E3 버퍼를 제거하고 세척 단계를 2 회 이상 반복한다.
- HPF (2)에 3 페트리 접시 (각 함유 배아 50)의 경우, 전달 피펫으로 E3 버퍼를 제거하고 E3 완충 용액 1,000 ㎎ / ℓ의 질산 나트륨 50 ㎖를 추가한다. 카드뮴 환원 (USEPA 방법 353.3) 분광 방법 (28)의 변형을 이용하여 미리 스톡 질산 수용액의 농도를 확인한다.
- 70 시간 동안 질산에 배아를 노출 계속합니다. 매일 갓 만든 질산 용액과 질산 용액을 교체합니다.
- 노출 시간 후, 전사 피펫과 질산을 제거한다. E3 버퍼의 50 ML을 추가하고 질산을 씻어 접시를 여러 번 소용돌이 친다. 전송 피펫으로이 E3 버퍼를 제거하고 세척 단계를 2 회 이상 반복한다.
- 노출의 하루 동안, 실체 현미경을 사용하여 죽은 배아 / 애벌레의 수를 계산합니다. 죽음의 징후심장 박동의 부족과 혈액 순환, 또는 관찰의 1 분 후 운동 부족 등이 있습니다. E3 버퍼의 오염을 줄이기 위해 전송 피펫으로 죽은 배아 / 애벌레를 제거합니다.
- 실험은 120 HPF에서 종료하면, 애벌레를 안락사.
- 전송 피펫으로 E3 버퍼를 제거합니다. 다음 (pH 7로 완충) 0.2 % MS-222의 50 ㎖를 추가하고 10 분 동안 기다립니다.
- 전송 피펫으로 MS-222를 제거합니다. MS-222을 씻어 E3 버퍼와 소용돌이의 50 ML을 추가합니다.
- 전송 피펫으로 E3 버퍼를 제거하고 애벌레를 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 20 ㎖를 추가합니다. 접시를 여러 번 소용돌이 친다. 병을 채우기에 충분한 PFA와 함께 유리 바이알에 유충을 전송할 전송 피펫을 사용한다. 냉장고에서 밤새 튜브 (O / N)을 저장한다.
- 디지털 카메라와 함께 입체경을 사용하여 고정 유충의 사진을 촬영합니다. 30 배 확대, ISO 200, 200 밀리 초 노출 시간을 사용합니다. 애벌레의 방향을되도록 제작에 전방피트와 등쪽 필드의 선두에있다.
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Representative Results
22 시간 동안 300 mM의 에탄올에 노출 이전의보고와 일치 5,23,26 생존 (미도 데이터)에 아무런 영향을 미치지 않았다. 에탄올 공지 기형 및 양성 대조군으로 같은 이는 예상된다. 관찰 된 표현형은 심낭 부종 부레의 noninflation (도 1), 두개 안면 결함 발달 지연 (데이터는 도시되지 않음) 포함.
아질산염과 치료는 노출 시간에 따라 생존에 심각한 영향 온화한 결과. 예를 들어, 94 시간에 심각한 영향을받는 생존을위한 노출에 1,000 ㎎ / ℓ 짧은 노출 시간 (그림 2)와 비교.
또한 생존 다른 아질산염 농도의 효과를 평가 하였다. 배아는 200에 70 시간, 400, 600, 800, 1,000 ㎎ / ℓ 노출되었다. 높은 노출되면 생존율이 낮았다생존율에 영향을 미치지 않은 반면, 아질산, 질산 농도 (도 3). 아질산염 처리 유충에 대한 표현형 (그림 4) 에탄올 처리 된 배아의 닮았다.
그림 1 :. 에탄올로 처리 에탄올 치료 배아의 발달 효과는 방광 noninflation (점선), 난황 부종 (화살촉), 및 두개 안면 결함 (데이터는 도시하지 않음) 수영, 심낭 부종 (화살표)를 보여 주었다. 이미지는 96 HPF에서 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 박람회의 다른 시간 이후에 1,000 밀리그램의 생존 / L 아질산염 처리URE. 배아는 2 HPF에서 1,000 ㎎ / ℓ의 아질산염에 노출되었다. 아질산 노출 46, 70 및 94 시간 후 세척하고, 생존율을 계산 하였다. 증가 된 노출 시간이 감소 생존율 결과. 표준 편차 = 24 처리되지 않은; 46 시간 = 6; 70 시간 = 6; 94 시간 = 0.9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 :. 다른 아질산염 농도에 노출 된 후 생존 배아 아질산염 농도 증가에 70 시간 동안 노출시켰다. 아질산염의 높은 농도는 낮은 생존율 결과. 질산염은 심지어 70 시간 동안 노출 된 후 1000 밀리그램 / L의 높은 농도에 영향을 미치지 않았다. 아질산염의 표준 편차 = 19 처리되지 않은; 200 ㎎ / ℓ = 16; 400 ㎎ / ℓ = 21; 600 ㎎ / ℓ = 20; (800)㎎ / ℓ = 14; 1,000 ㎎ / ℓ = 질산 12. 표준 편차 4. 동일 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 질산염과 아질산염 태아의 발달 효과는 1,000 ㎎ / ℓ 질산 (중간 패널)로 처리 치료 제어 (상단 패널)에 비해 영향을 미치지 아니합니다. 1,000 ㎎ / ℓ에서 아질산염 처리는 에탄올 처리 (하단 패널)에서 관찰 비슷한 표현형에 추가하여 총 발달 결함 발생했습니다. 이미지가 120 HPF에서 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 방법은 아질산 질산 기형 가능성을 평가 지브라 피쉬의 유용성을 보여준다. 다른 척추 동물에 비해, 제브라 피쉬는 높은 생산력, 체외 수정, 광학 투명성, 신속한 개발을 포함 장점이있다. (예 : 캐스퍼 제브라 피쉬 (36) 등) 색소 침착이 부족 가능한 돌연변이 체는 내부 장기의 가시성을 향상하는 데 도움이됩니다. 또한 활어 37에서 분석을 용이하게하기 위해 리포터 유전자 형질 전환 지브라 피쉬를 생성하기 쉽다. 제브라 피쉬 게놈이 인간과 보존되어 있기 때문에, 자신의 연구에서 얻은 정보는 인간 9 번역 결과가 발생할 수 있습니다. 방법 기형 의한 유전자 misregulation에 관한 추가 정보를 얻기 위해 이러한 동일계 하이브리드 화에서와 같이, 유전자 발현 분석에 적용될 수있다.
에탄올에 노출 크게 생존율에는 영향을주지 않았지만, 그것은 MA 발생할 않았다이전 보고서 5,23,26 유사 rked 결함. 이것은 우리의 방법은 게시 된 결과를 반복에서 신뢰할 수 있음을 보여줍니다. 아질산염은 상당한 농도 및 노출 시간에 따라 영향을 가지고 있었다 반면 질산 생존에 영향을 미치지 않았다. 긴 노출 아질산 높은 레벨 5 이전 결과와 일치 생존율에 부정적인 영향을 가지고 있었다. 이는 최근에 과도한 아질산 노출 기형의 메커니즘을 연구하는 제브라 사용 검증, 제브라 피쉬 (27)에 결함이있는 심장 판막 개발 인한 것으로 나타났다.
그들이 만든 후 작업 용액의 농도를 확인하는 것이 중요합니다. 질산염 및 아질산염 농도 카드뮴 감소 수정 (USEPA 방법 353.3) 디아 조화 (USEPA 방법 354.1) 분광 방법을 각각 (28)를 이용하여 측정 할 수있다. 또 다른 중요한 단계는 evapo을 최소화하기 위해 파라 필름으로 페트리 접시를 커버하는 것입니다에탄올 배급이를 양성 대조군으로 사용하는 경우. 애벌레 (너무 높거나 너무 낮은) 예기치 않은 사망이있는 경우, 솔루션의 계산과 농도를 두 번 확인합니다.
최근, 유사한 방법을 에탄올 29 기형 효과를 결정하는 데 사용되었다. 이 방법은 여기에 제안 된 방법과 유사하지만, 그것은 단지 아마도 인해 장기간 에탄올 배아를 노출 독성, 최대 24 시간 동안 에탄올 배아를 공개한다. 대조적으로, 우리의 방법은 매일 테스트 솔루션의 교체와 함께 며칠 동안 질산염과 아질산염에 배아를 노출합니다. 이것은 덜 독성 화학 물질을 테스트하는 것이 유리하다.
우리는 우리의 방법은, 다른 약물 또는 특정 환경 조건을 테스트하도록 적용될 수 있다는 것을 구상. 그러나,이 방법은 수용성 분자를 테스트로 제한된다. 특정 화학 물질의 빛이 감도는 고려해야 할 또 다른 요인이다. 시험 화학 물질은 빛 sensit 경우필자는, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 페트리 접시를 포장. 또한,이 방법은 실험실 제브라 피쉬는 최적의 개발 (예 : pH와 전도도 등) 특정 조건을 필요로하기 때문에 특정 환경에서 촬영 테스트 물 좋지 않다. 그렇다고하더라도, 제브라 빠르게 전위 기형 의한 발달 결함을 결정 우호적 모델로서 기능한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
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