Summary
催奇形への曝露は、先天性欠損症を引き起こす可能性があります。ゼブラフィッシュは、化学物質の催奇形性を決定するのに有用です。私たちは、亜硝酸塩のも露出の異なる時点で様々なレベルに胚を暴露することによって、ゼブラフィッシュの有用性を実証しています。私たちは、亜硝酸塩は毒性があると重度の発達障害を引き起こす可能性があることを示しています。
Abstract
環境における高い硝酸塩濃度は、ヒトの先天性欠損または流産になることがあります。おそらく、これは腸および唾液細菌による亜硝酸塩への硝酸塩の転換によるものです。彼らは貧しい生殖成果につながることができますが、しかし、他の哺乳動物の研究では、高亜硝酸塩レベルは、先天性欠損症を引き起こすことはありません。このように、亜硝酸塩の催奇形性は明らかではありません。容易に亜硝酸塩または関心のある他の化学物質の催奇形性を評価するために、脊椎動物モデル系を有することが有用であろう。ここでは、毒性および胚の欠陥のための化合物をスクリーニングするためにゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の有用性を実証しています。ゼブラフィッシュの胚は彼らに催奇形性研究のための良好なモデルを作り、外部から受精かつ急速な発展を持っています。我々は、亜硝酸塩への暴露の時間を増加させると負の生存に影響を与えることを示しています。硝酸塩がないのに対し、亜硝酸塩の濃度を増加させるとも悪影響、生存に影響を与えます。胚thaのためのトン亜硝酸塩曝露を生き残る、様々な欠陥が心膜と卵黄嚢の浮腫を含め、発生する可能性があり、膀胱noninflation、および頭蓋顔面奇形を泳ぎます。我々の結果は、ゼブラフィッシュは、亜硝酸塩の催奇形性を研究するための便利なシステムであることを示しています。このアプローチは、容易に初期の脊椎動物の発生に対する効果について他の化学物質を試験するために適合させることができます。
Introduction
催奇形性は重症例1で恒久的な構造的および機能的な異常、発育遅延、または流産を引き起こすことによって、胚または胎児の正常な発育を妨害するプロセスです。これは、複数の方法2に胚発生を妨害する特定の天然薬剤（催奇形）によって引き起こされ得ます。ヒト胎児開発中に、このような放射線、感染性物質、有害金属、および有機化学物質などの一般的な催奇形は、形態形成のエラーを通じてエピカンスィクひだの欠陥（上眼瞼内の皮膚のひだ）と斜指症（曲がった指やつま先）を引き起こすことが報告されています1。
奇形発生の分子機構を理解することは、治療と予防の開発に向けた最初のステップです。このようなアフリカのようないくつかの脊椎動物のモデルがteratによって影響を受ける分子経路を決定するために使用されているカエル（ アフリカツメガエル ）とゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）をツメガエルogens。以前の研究は疫学、毒性および催奇形性3-7のモデルとしてゼブラフィッシュを使用してきました。ショルツら 。環境毒性評価のための「ゴールドスタンダード」としてゼブラフィッシュを検討しました。これは、8を生じるよう、研究者が発達欠陥を可視化することを可能にするゼブラフィッシュ胚の透明性に一部、起因します。ヒト遺伝子の約70％は、人間の欠陥9を研究するためのゼブラフィッシュ望ましい脊椎動物のモデルを作り、ゼブラフィッシュにおけるオルソログを持っています。
いくつかの疫学研究では、他の研究は、この関連付け12をサポートしていませんが、ファーム食品や水の中に一般に存在硝酸塩と亜硝酸塩は、出生欠陥や自然流産10,11と関連していることを示唆しています。硝酸イオン（NO 3 - ）及び亜硝酸塩（NO 2 - ）は、自然土壌や水の中に存在しています。彼らは植物のための窒素の供給源であり、nの一部でありますitrogenサイクル13。硝酸塩の高い肥料を使用する農家からインゲン、ニンジン、カボチャ、ほうれん草、およびテンサイなどの食品が大幅に硝酸塩と亜硝酸塩7のレベルを増強しています。 （主に土壌流出30から）高硝酸水に高硝酸塩食品や魚を与えた牛のミルクは硝酸塩と亜硝酸塩14を大量に消費するヒトにつながることができます。硝酸塩及び亜硝酸塩は、一般劇的ヒト12によって摂取量を増加させる食品の保存に使用されます。
硝酸塩と亜硝酸塩の最適レベルは、血管の恒常性と機能、神経伝達および免疫学的宿主防御機構13-15のような生理学的プロセスに基本的な役割を果たしています。しかし、硝酸塩と亜硝酸塩の高レベルへの暴露は、特に幼児や子供16に、悪影響をもたらす可能性があります。摂取された硝酸塩は、微生物叢によると、目で口腔内で亜硝酸にさらに変換され腸内細菌叢17による電子消化管。
硝酸塩は能力18を運ぶその酸素からヘモグロビンを損なう、メトヘモグロビンをヘモグロビンの酸化によってブルーベビー症候群のリスクが高い乳児を置きます。これは、より重症例では末梢組織にまで及ぶ皮膚の青色になります。最も深刻な昏睡と死19,20につながる他の症状における組織の結果の阻害した酸素、。同様の現象は、硝酸21のより高い濃度で乳児および成人において観察されます。チアノーゼ中の亜硝酸塩中毒の結果に起因する成人のメトヘモグロビン、頭痛、障害31呼吸 、そして死のレベルの上昇による生体組織の低酸素症32,33に関連する合併症を治療しなければ。
より高いレベルで摂取硝酸塩はまた、種々の健康上の合併症を生じ得ます。小児糖尿病、再発性下痢、および再発性呼吸器感染症子どもたちに高い硝酸塩摂取11,17,22とリンクされています。硝酸塩のハイレベルへの慢性暴露は、排尿および脾臓の出血と関連しています。硝酸塩への急性高用量の暴露は、腹痛、筋力低下、便や尿中の血液、失神、死亡11のような医学的条件の広いスペクトルにつながることができます。高レベルでの硝酸塩への出生前暴露は神経管と筋骨格欠陥11と関連していました。
最近の報告では、亜硝酸塩とのゼブラフィッシュの胚を処理すること嚢浮腫、頭蓋顔面および軸方向の奇形を卵黄につながって、膀胱noninflation 5を泳ぐことを示しました。本研究では、その催奇形性を決定するために硝酸塩と亜硝酸塩とのゼブラフィッシュ胚を治療するための方法を示します。胚を、異なる濃度および時間の異なる長さで亜硝酸塩に曝露しました。それが確立された催奇形物質23であるので、エタノールは、陽性対照として使用しました。 Oウル方法は、亜硝酸塩の両方に高濃度と長い露光時間は、生存に有害であり、軽度（浮腫）から重度（総発達障害）に至るまで、様々な表現型をもたらしたことを示しました。したがって、ゼブラフィッシュは、直接の疫学的研究を補完するために胚の硝酸塩と亜硝酸塩の潜在的な催奇形性を探索するための有用なモデルです。
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Protocol
このプロトコルで説明する手順は、ペンシルベニア州のインディアナ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
1.ハーベスト胚
- 28.5°C、pHは7、500〜1,500μSの間の導電率でゼブラフィッシュを維持し、14時間の光と10時間24暗いの明/暗サイクル。このようなTú、ABまたはTU / ABハイブリッドなどの野生型株を使用してください。異なる株は、化学的処理25に異なる反応を示すことがあります。
- 交配タンクに魚系の水を加えて卵を採取する前に夜を嵌合するための魚を設定します。タンクにオスとメスの魚を追加し、分周器と二匹の魚を分離します。各魚のペアは、50〜300卵の範囲を生成します。十分な卵が生成される保証するために、魚の30ペアを設定します。一般的に、（6-9ヶ月齢）プライム交配年齢で魚のペアの約50％が200ペアごとに卵、最大3の最大値まで、その結果、卵を生産します、この実験のための000の卵。
- 翌朝ランプが点灯した後に、交配を開始するための仕切りを取り外します。卵のために15分ごとに交配タンクを確認してください。
- 魚が卵を産むたら、茶こしを使用して、すべての胚を収穫し、E3バッファー（5 mMの塩化ナトリウム、0.17のKCl、0.33mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4）しを持つ1つの大きな容器にそれらを組み合わせます。 1.5 HPFでは、解剖顕微鏡下でのプラスチック転送ピペットで未受精卵を除去し、廃棄します。受精卵は34透明でありながら未受精卵は不透明です。
- 各処理条件のために50 mlのE3緩衝液を含む100×15ミリメートルのガラスペトリ皿に移す50胚。 33皿の合計は、11処理条件3の複製のために必要とされます。
2.治療胚
- 2時間後に受精（HPF）35での処理を行います。 28.5℃で胚/幼虫をインキュベートし、120 HPFで幼虫を調べます。 LEAで実行ST統計分析のために各処理条件の3つの複製。
- 2 HPFで3ペトリ皿（それぞれが50の胚を含む）の場合、転送ピペットでE3バッファを削除して、E3緩衝液で希釈した300 mMのエタノール50ミリリットルを追加します。エタノールの蒸発を最小限にするためにパラフィルムでペトリ皿をカバーしています。
- 22時間エタノールに胚を露出させ続けます。そして、転送ピペットでエタノールを除去。 E3バッファの50ミリリットルを加え、エタノールを洗い流すために皿を数回旋回。転送ピペットでこのE3バッファを削除し、洗浄工程を2回以上繰り返します。
- 2 HPFで3ペトリ皿（それぞれが50の胚を含む）の場合、転送ピペットでE3バッファを削除し、新しいE3バッファーの50ミリリットルを追加します。
- 2 HPFで9ペトリ皿（それぞれが50の胚を含む）の場合、転送ピペットでE3バッファを削除して、E3緩衝液に溶解千mg / Lの亜硝酸ナトリウムの50ミリリットルを追加します。使用して、事前に在庫の亜硝酸溶液の濃度を確認しますジアゾ化の変更（USEPAメソッド354.1）分光光度法28。
- 94時間46時間、3皿、70時間、3皿と3皿を露出し続けます。毎日焼きたての亜硝酸溶液と亜硝酸を交換してください。
- 各露光時間の後、転送ピペットで亜硝酸塩を除去します。 E3バッファの50ミリリットルを追加し、亜硝酸塩を洗い流すために皿を数回旋回。転送ピペットでこのE3バッファを削除し、洗浄工程を2回以上繰り返します。
- 2 HPFで3ペトリ皿（それぞれが50の胚を含む）の場合、転送ピペットでE3の緩衝液を除去し、200 mg / Lの亜硝酸ナトリウムの50ミリリットルを追加します。 400、600、800、および1,000mgの亜硝酸ナトリウムの/ Lでこれを繰り返します。
- 70時間亜硝酸塩に胚を露出させ続けます。毎日焼きたての亜硝酸溶液と亜硝酸を交換してください。
- 露光時間の後、転送ピペットで亜硝酸塩を除去します。 E3バッファの50ミリリットルを追加し、いくつかの料理を旋回回亜硝酸塩を洗い流します。転送ピペットでこのE3バッファを削除し、洗浄工程を2回以上繰り返します。
- 2 HPFで3ペトリ皿（それぞれが50の胚を含む）の場合、転送ピペットでE3バッファを削除して、E3緩衝液に溶解千mg / Lの硝酸ナトリウムの50ミリリットルを追加します。カドミウム還元（USEPAメソッド353.3）分光光度法28の修正を使用して、事前に在庫硝酸溶液の濃度を確認してください。
- 70時間硝酸塩に胚を露出させ続けます。毎日焼きたての硝酸溶液と硝酸液を交換してください。
- 露光時間の後、転送ピペットで硝酸を取り除きます。 E3バッファの50ミリリットルを追加し、硝酸を洗い流すために皿を数回旋回。転送ピペットでこのE3バッファを削除し、洗浄工程を2回以上繰り返します。
- 各露光日中、実体顕微鏡を使用して死んだ胚/幼虫の数を数えます。死の兆候ハートビートと血液循環の欠如、または観察の1分後の運動性の欠如が含まれます。 E3バッファの汚染を低減するために、転送ピペットで死んだ胚/幼虫を削除します。
- 実験は120 HPFで終了すると、幼虫を安楽死させます。
- 転送ピペットでE3のバッファを削除してください。その後、0.2％MS-222の50ミリリットル（pH7に緩衝さ）を追加し、10分間待ちます。
- 転送ピペットでMS-222を削除してください。 MS-222を洗い流すためにE3バッファとスワールの50ミリリットルを追加します。
- 転送ピペットでE3バッファを削除し、幼虫を修正するために4％パラホルムアルデヒド（PFA）の20ミリリットルを追加します。皿を数回旋回。バイアルを満たすのに十分なPFAと一緒にガラスバイアルに幼虫を転送する転送ピペットを使用してください。冷蔵庫で一晩（O / N）でバイアルを保管してください。
- デジタルカメラでステレオスコープを用いて固定幼虫の写真を撮ります。使用30X倍率、ISO 200、200ミリ秒の露光時間は。オリエント幼虫ルへの前方となるようフィートと背側は、フィールドの先頭にあります。
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Representative Results
22時間、300 mMのエタノールへの曝露は、以前の報告5,23,26と一致生存（データは示していない）には影響を及ぼしませんでした。エタノールが知られている催奇形物質であり、ポジティブコントロールとして役立ったように、これは、期待されています。観察された表現型は、心膜浮腫、スイム膀胱noninflation（ 図1）、頭蓋顔面欠損、及び発達遅延（データは示さず）を含んでいました。
亜硝酸塩での処理は、露光時間に応じて、生存に深刻な影響をマイルドになりました。例えば、94時間深刻な影響を受けた生存のための露光1,000 mg / Lでは、短い露光時間（ 図2）と比較します。
また、生存上の異なる亜硝酸塩濃度の効果を評価しました。胚は、200から70時間、400、600、800、1000 mg / Lで暴露しました。ハイに曝されたときの生存率が低かったです生存に影響を及ぼさなかった硝酸塩のに対し、亜硝酸塩の濃度が、（ 図3）。亜硝酸処理した幼虫のための表現型は、エタノール処理した胚（ 図4）のそれに似ていました。
図1：エタノールで処理エタノール治療胚の発育への影響は膀胱noninflation（破線）、卵黄嚢の浮腫（矢印）、および頭蓋顔面の欠陥を（データは示していない）泳ぐ、心膜浮腫（矢印）を示しました。画像は96 HPFで撮影した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：エクスポズの異なる時間後に1,000mgのの生存/ L亜硝酸トリートメントURE。胚は2 HPF 1,000 mg / Lの亜硝酸に曝露しました。亜硝酸塩が暴露の46、70、及び94時間後に洗浄した後、生存率を算出しました。増加した暴露時間が減少生存率をもたらしました。標準偏差：= 24未処理; 46時間= 6; 70時間= 6; 94時間= 0.9。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：異なる亜硝酸塩濃度への曝露後の生存胚は、亜硝酸塩の濃度を増加させ、70時間曝露しました。亜硝酸塩の濃度が高いほど、より低い生存率をもたらしました。硝酸塩は、70時間の曝露の後でさえ千mg / Lでの最高濃度では効果がなかったです。亜硝酸塩のための標準偏差：= 19未処理;が200mg / L = 16; 400 mg / Lで= 21; 600 mg / Lで= 20; 800mg / Lで= 14;千mg / Lで=硝酸塩のための12の標準偏差は4に等しい。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：硝酸塩と亜硝酸塩胚の発育への影響が1000 mg / Lの硝酸（中央のパネル）で処理された未処理の対照（上のパネル）と比較して効果がなかったです。千mg / Lでで亜硝酸塩治療は、エタノール処理（下のパネル）で観察された類似の表現型に加えて、総発達障害が生じました。画像は120 HPFで撮影した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する方法は、亜硝酸塩と硝酸塩の催奇形性を評価する際にゼブラフィッシュの有用性を示します。他の脊椎動物と比較すると、ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、体外受精、光学的透明性、および急速な発展を含む利点を有しています。 （このようなキャスパーゼブラフィッシュ36など）の色素沈着を欠いている利用可能な変異体はまた、内臓の視認性を高めるのに役立ちます。生きた魚37に分析を容易にするために、レポーター遺伝子を有するトランスジェニックゼブラフィッシュを生成することも容易です。ゼブラフィッシュのゲノムは人間と保存されているので、彼らの研究から得られた情報は、人間9の並進の結果につながることができます。この方法は、催奇形物質によって引き起こされる遺伝子の誤調節に関する追加情報を得るために、例えば、in situハイブリダイゼーションのような 、遺伝子発現分析に適用することができます。
エタノール曝露は、生存率を有意に影響しなかったが、それはミリアンペアを引き起こしました以前の報告5,23,26に類似の欠陥をrked。これは私たちの方法が公表された結果の繰り返しに信頼性があることを示しています。亜硝酸塩が重要なの暴露の濃度や時間に応じて影響を与えていなかったのに対し、硝酸塩は、生存に影響を及ぼしませんでした。長い露出と亜硝酸塩のより高いレベルは、以前の結果5と一致して生存率に負の影響を、持っていました。最近、過剰な亜硝酸塩の曝露は、催奇形物質のメカニズムを研究するためにゼブラフィッシュの使用を検証する、ゼブラフィッシュ27不良心臓弁の開発を引き起こしたことが示されました。
彼らが行われた後、ワーキング溶液の濃度を確認することが重要です。硝酸塩及び亜硝酸塩の濃度は、それぞれカドミウム還元（USEPA法353.3）およびジアゾ化（USEPA法354.1）分光光度法、28の修飾を使用して測定することができます。別の重要なステップは、エバポを最小限にするためにパラフィルムでペトリ皿をカバーするものですエタノールの比これは、ポジティブコントロールとして使用した場合。幼虫は（高すぎる、または低すぎる）予期しない死亡率を持っている場合は、ソリューションの計算と濃度をダブルチェック。
最近、同様の方法は、エタノール29の催奇形性を決定するために使用しました。この方法は、ここで私たちの方法と同様であるが、それだけでおそらく長時間のエタノールに胚を露出させる毒性のために、最大24時間、エタノールに胚を公開します。これとは対照的に、我々の方法は、毎日の試験溶液の交換で数日間硝酸塩と亜硝酸塩への胚を公開します。これは、低毒性の化学物質を試験するのに有利です。
我々は、我々の方法は、他の薬物または特定の環境条件をテストするために適用することができることを想定しています。しかし、この方法は、水溶性の分子を試験に限られています。特定の化学物質の光感度は、考慮すべきもう一つの要因です。試験化学物質が光sensitある場合IVEは、光から保護するためにアルミホイルでペトリ皿を包みます。また、この方法は、実験室でのゼブラフィッシュは、最適な開発のための（例えば、pH、導電率など）特定の条件を必要とするので、特定の環境から採取した試験水のために良いではありません。そうであっても、ゼブラフィッシュはすぐに潜在的な催奇形物質によって引き起こされる発達障害を決定するために有利なモデルとして機能します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
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