Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الزرد نموذجا لتقييم إمكانات المسخية من النطرون

Published: February 16, 2016 doi: 10.3791/53615
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Summary

التعرض لteratogens قد يسبب تشوهات خلقية. الزرد مفيدة لتحديد إمكانية ماسخة للمواد الكيميائية. ونحن لشرح فائدة الزرد عن طريق تعريض الأجنة إلى مستويات مختلفة من النتريت وأيضا في أوقات مختلفة من التعرض. وتبين لنا أن النتريت يمكن أن تكون سامة وتسبب تشوهات تنموية حادة.

Abstract

مستويات عالية من النيترات في البيئة يمكن أن يؤدي إلى عيوب خلقية أو حالات الإجهاض في البشر. ويفترض، ويرجع ذلك إلى تحويل النترات إلى نتريت بواسطة القناة الهضمية والبكتيريا اللعابية هذا. ومع ذلك، في دراسات الثدييات الأخرى، ومستويات عالية النتريت لا تسبب تشوهات خلقية، على الرغم من أنها يمكن أن تؤدي إلى نتائج الإنجابية الفقيرة. وهكذا، فإن إمكانية ماسخة من النتريت ليست واضحة. وسيكون من المفيد أن يكون هناك نظام نموذج الفقاريات لتقييم بسهولة تأثيرات ماسخة من النتريت أو أي مادة كيميائية أخرى ذات اهتمام. هنا، ونحن لشرح فائدة الزرد (دانيو rerio) لفحص المركبات السمية والعيوب الجنينية. يتم تخصيب الأجنة الزرد خارجيا ويكون التطور السريع، مما يجعلها نموذجا جيدا للدراسات ماسخة. وتبين لنا أن زيادة وقت التعرض للنترات يؤثر سلبا البقاء على قيد الحياة. زيادة تركيز النتريت أيضا يؤثر سلبا على البقاء على قيد الحياة، في حين نترات لا. لثا الأجنةر البقاء على قيد الحياة التعرض النتريت، يمكن أن تحدث تشوهات مختلفة، بما في ذلك التامور وصفار ذمة الكيس، والسباحة noninflation المثانة، وتشوه القحفي. وتشير النتائج التي توصلنا إليها الزرد هو نظام ملائم لدراسة إمكانية ماسخة من النتريت. يمكن بسهولة أن تتكيف هذا النهج لاختبار المواد الكيميائية الأخرى لآثارها على التنمية الفقارية المبكرة.

Introduction

إمساخ هي العملية التي يعطل التطور الطبيعي للجنين أو الجنين عن طريق التسبب في تشوهات دائمة الهيكلية والوظيفية، وتأخر النمو، أو الإجهاض في الحالات الشديدة 1. ويمكن أن تسببها بعض العوامل الطبيعية (teratogens)، التي تتداخل مع التطور الجنيني بطرق متعددة 2. أثناء التطور الجنيني الإنسان، وقد تم الإبلاغ عن teratogens الشائعة مثل الإشعاع، والعوامل المعدية، المعادن السامة، والمواد الكيميائية العضوية أن يسبب تشوهات في طيات فوق المآقي (حظيرة الجلد في الجفن العلوي) وانحراف الأصابع (إصبع المنحني أو أخمص القدمين) من خلال أخطاء التخلق 1.

فهم الآلية الجزيئية من إمساخ هي الخطوة الأولى نحو تطوير العلاج والوقاية. العديد من النماذج الفقاريات مثل أفريقيا عوضت الضفدع (القيطم المورق) والزرد (دانيو rerio) استخدمت لتحديد المسارات الجزيئية تتأثر teratogens. وقد استخدمت الدراسات السابقة الزرد كنموذج لعلم الأوبئة، وعلم السموم وإمساخ 3-7. شولتس وآخرون. تعتبر الزرد بأنه "المعيار الذهبي" لتقييم سمية البيئي. ويرجع ذلك، في جزء منه، إلى الشفافية في الجنين الزرد، الذي يسمح للباحثين لتصور الخلل التنموي كما يحدث 8. ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية لديها orthologues في الزرد، مما يجعل الزرد نموذج الفقاريات مرغوب فيه لدراسة العيوب الإنسان 9.

وقد اقترحت بعض الدراسات الوبائية أن النترات والنتريت والحاضر عادة في الأطعمة الزراعية والمياه، وترتبط مع العيوب الخلقية أو الإجهاض التلقائي 10،11، في حين أن دراسات أخرى لا تدعم هذه الجمعية 12. نترات (NO 3 -) والنتريت (NO 2 -) موجودة بشكل طبيعي في التربة والمياه. وهي مصدر النيتروجين للنباتات وهي جزء من نitrogen دورة 13. الأطعمة مثل الفاصوليا الخضراء والجزر والقرع والسبانخ والبنجر من المزارع التي تستخدم الأسمدة عالية في نترات، زادوا بشكل ملحوظ من مستويات النترات والنتريت 7. الحليب من الأبقار التي تتغذى على الأطعمة عالية من النيترات والسمك في الماء نترات عالية (أساسا من جريان التربة 30) يمكن أن يؤدي إلى البشر تستهلك كميات كبيرة من النترات والنتريت 14. كما تستخدم النترات والنتريت عادة في حفظ الأغذية، مما يزيد بشكل كبير من كمية تناولها من قبل البشر 12.

المستويات المثلى من النترات والنتريت تلعب أدوارا أساسية في العمليات الفسيولوجية مثل التوازن الأوعية الدموية وظيفة، العصبي وآليات دفاع المضيف المناعية 13-15. ومع ذلك، والتعرض لمستويات عالية من النترات والنتريت يمكن أن يؤدي إلى آثار ضارة، خاصة عند الرضع والأطفال 16. نترات بلعها هو أبعد تحويلها إلى نتريت في تجويف الفم من البكتيريا وفي الالبريد الجهاز الهضمي عن طريق الأمعاء الدقيقة 17.

نترات يضع الأطفال عرضة لمخاطر عالية لمتلازمة الطفل الأزرق عن طريق الأكسدة الهيموغلوبين ل methemoglobin، إضعاف الهيموغلوبين من الأكسجين التي تحمل قدرة 18. وهذا يؤدي إلى اللون الأزرق من الجلد الذي يمتد إلى الأنسجة الطرفية في أكثر الحالات الشديدة. الأوكسجين تحول دون نتائج الأنسجة في أعراض أخرى، مما يؤدي أشد إلى الغيبوبة والوفاة 19،20. ولوحظت أعراض مماثلة في الأطفال والبالغين على تركيزات أعلى من نترات 21. مستويات مرتفعة من ميتهيموغلوبين في البالغين بسبب النتائج تسمم النتريت في زرقة، والصداع، واضطرابات التنفس 31، والموت إذا لم يعالج بسبب المضاعفات المتصلة نقص الأكسجة الأنسجة الحيوية 32،33.

نترات تناولها على مستويات أعلى يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات صحية مختلفة. مرض السكري في مرحلة الطفولة، والإسهال المتكرر، والتهابات الجهاز التنفسي المتكررةفي الأطفال وقد تم ربط مع ارتفاع النترات تناول 11،17،22. ويرتبط التعرض المزمن لمستوى عال من النترات مع التبول ونزيف الطحال. الحادة التعرض جرعة عالية من النترات يمكن أن يؤدي إلى مجموعة واسعة من الحالات الطبية مثل آلام في البطن، وضعف العضلات، والدم في البراز والبول، والاغماء، والموت 11. وقد ارتبط التعرض قبل الولادة لنترات عند مستويات مرتفعة مع الأنبوب العصبي وخلل العضلات والعظام 11.

وأظهر تقرير صدر مؤخرا إلى أن علاج الأجنة الزرد مع النتريت أدى إلى صفار ذمة SAC، تشوهات الوجه و المحورية، والسباحة المثانة noninflation 5. في هذه الدراسة، ونحن لشرح طريقة لعلاج الأجنة الزرد مع النترات والنتريت لتحديد قدراتهم ماسخة. وتعرض الأجنة إلى نتريت بتركيزات مختلفة وأطوال مختلفة من الزمن. تم استخدام الإيثانول كعنصر تحكم إيجابية، لأنه هو مشوه إنشاء 23. Oأظهر طريقة اور أن كلا من تركيزات عالية ومرات التعرض الطويل لالنتريت كانت وبالا على البقاء على قيد الحياة وأسفرت عن العديد من الظواهر، تتراوح ما بين خفيفة (وذمة) إلى (العيوب التنموية الإجمالية) شديدة. ولذلك، فإن الزرد هو نموذج مفيد لاستكشاف مباشرة آثار ماسخة المحتملة من النترات والنتريت على الأجنة لاستكمال الدراسات الوبائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة انديانا بنسلفانيا.

1. حصاد الأجنة

  1. الحفاظ على الزرد في 28.5 درجة مئوية، ودرجة الحموضة 7، والتوصيل بين 500-1،500 ميكرو ثانية، والخفيفة / دورة الظلام من 14 ساعة ضوء و 10 ساعة الظلام 24. استخدام النوع البري سلالات مثل تو، AB أو تو / AB الهجين. سلالات مختلفة قد يستجيبون بشكل مختلف للعلاج الكيميائي 25.
  2. إعداد الأسماك للتزاوج في الليلة السابقة البيض الحصاد وذلك بإضافة الماء نظام الأسماك في خزان التزاوج. إضافة الاناث والذكور في خزان وفصل السمكتين مع مقسم. وكل زوج الأسماك تنتج مجموعة من 50-300 بيضة. لضمان سيتم إنتاج هذا البيض ما يكفي، وإنشاء 30 زوجا من الأسماك. عادة، فإن حوالي 50٪ من أزواج الأسماك في سن التزاوج رئيس (6-9 أشهر من العمر) إنتاج البيض، مما أدى إلى 200 بيضة لكل زوج وبحد أقصى يصل إلى 3، 000 البيض لهذه التجربة.
  3. في صباح اليوم التالي بعد يتحول الضوء على، وإزالة مقسم إلى بدء التزاوج. تحقق الدبابات التزاوج للحصول على البيض كل 15 دقيقة.
  4. مرة واحدة الأسماك تضع بيضها، حصاد الأجنة باستخدام مصفاة الشاي والجمع بينهما في حاوية واحدة كبيرة مع العازلة E3 (5 ملم كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4). في 1.5 HPF، إزالة والتخلص بويضة غير مخصبة مع الماصة نقل من البلاستيك تحت المجهر تشريح. بويضة غير مخصبة هي مبهمة حين البيض المخصب شفافة 34.
  5. نقل 50 الأجنة إلى 100 × 15 ملم الزجاج طبق بتري تحتوي على 50 مل العازلة E3 لكل حالة العلاج. وهناك حاجة إلى ما مجموعه 33 أطباق لمدة 11 شروط العلاج و3 مكررات.

2. الأجنة علاج

  1. تنفيذ العلاجات في 2 ساعة بعد الإخصاب (HPF) 35. احتضان الأجنة / اليرقات في 28.5 درجة مئوية، ودراسة اليرقات في 120 HPF. تؤدي في مرجةالحادي وثلاثة مكررات لكل حالة علاج للتحليل الإحصائي.
  2. 3 أطباق بتري (تحتوي كل منها على 50 الأجنة) في 2 HPF، وإزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل وإضافة 50 مل من 300 ملي الإيثانول المخفف في المخزن E3. تغطية أطباق بتري مع بارافيلم لتقليل التبخر من الايثانول.
    1. تواصل تعريض الأجنة إلى الإيثانول لمدة 22 ساعة. ثم إزالة الايثانول مع الماصة نقل. إضافة 50 مل من العازلة E3 ودوامة الطبق عدة مرات لغسل الايثانول. إزالة هذا المخزن المؤقت E3 مع الماصة نقل وكرر الخطوة غسل 2 مرات أكثر.
  3. 3 أطباق بتري (تحتوي كل منها على 50 الأجنة) في 2 HPF، وإزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل وإضافة 50 مل من العازلة E3 الجديد.
  4. 9 أطباق بتري (تحتوي كل منها على 50 الأجنة) في 2 HPF، وإزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل وإضافة 50 مل من 1000 ملغم / لتر نترات الصوديوم الذائب في المخزن E3. تأكيد تركيز المحلول النتريت مسبقا باستخدامتعديل تدييز (وكالة الحماية البيئية الطريقة 354.1) طريقة الطيفي 28.
    1. مواصلة فضح 3 أطباق لمدة 46 ساعة، 3 أطباق لمدة 70 ساعة و 3 أطباق ل94 ساعة. استبدال حل النتريت مع حل النتريت تقدم طازجة يوميا.
    2. بعد كل وقت التعرض، وإزالة النتريت مع الماصة نقل. إضافة 50 مل من العازلة E3 ودوامة الطبق عدة مرات لتغسل النتريت. إزالة هذا المخزن المؤقت E3 مع الماصة نقل وكرر الخطوة غسل 2 مرات أكثر.
  5. 3 أطباق بتري (تحتوي كل منها على 50 الأجنة) في 2 HPF، وإزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل وإضافة 50 مل من 200 ملغم / لتر نترات الصوديوم. كرر هذا مع 400، 600، 800، و 1،000 ملغ / لتر من نتريت الصوديوم.
    1. تواصل تعريض الأجنة إلى النتريت لمدة 70 ساعة. استبدال حل النتريت مع حل النتريت تقدم طازجة يوميا.
    2. بعد وقت التعرض، وإزالة النتريت مع الماصة نقل. إضافة 50 مل من العازلة E3 ودوامة الطبق عدةمرات لتغسل النتريت. إزالة هذا المخزن المؤقت E3 مع الماصة نقل وكرر الخطوة غسل 2 مرات أكثر.
  6. 3 أطباق بتري (تحتوي كل منها على 50 الأجنة) في 2 HPF، وإزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل وإضافة 50 مل من 1000 ملغم / لتر نترات الصوديوم الذائب في المخزن E3. تأكيد تركيز المحلول نترات مسبقا باستخدام تعديل الحد الكادميوم (وكالة الحماية البيئية الطريقة 353.3) طريقة طيفية 28.
    1. تواصل تعريض الأجنة إلى نترات عن 70 ساعة. استبدال محلول نترات مع محلول نترات تقدم طازجة يوميا.
    2. بعد وقت التعرض، وإزالة النترات مع الماصة نقل. إضافة 50 مل من العازلة E3 ودوامة الطبق عدة مرات لتغسل نترات. إزالة هذا المخزن المؤقت E3 مع الماصة نقل وكرر الخطوة غسل 2 مرات أكثر.
  7. خلال كل يوم من التعرض، وإحصاء عدد القتلى جنين / اليرقات باستخدام مجهر تشريحي. علامات الموتتشمل عدم وجود نبضات القلب والدورة الدموية، أو عدم القدرة على الحركة بعد 1 دقيقة من المراقبة. إزالة الأجنة الميتة / اليرقات مع الماصة نقل للحد من التلوث من المخزن المؤقت E3.
  8. عندما تنتهي التجارب على 120 HPF، الموت ببطء اليرقات.
    1. إزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل. ثم إضافة 50 مل من 0.2٪ MS-222 (مخزنة لدرجة الحموضة 7) والانتظار لمدة 10 دقيقة.
    2. إزالة MS-222 مع الماصة نقل. إضافة 50 مل من العازلة E3 ودوامة لتغسل MS-222.
    3. إزالة المنطقة العازلة E3 مع الماصة نقل وإضافة 20 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) لإصلاح اليرقات. دوامة عدة مرات طبق. استخدام الماصة نقل لنقل اليرقات في قارورة زجاجية جنبا إلى جنب مع ما يكفي من PFA لملء القارورة. تخزين قوارير في الثلاجة بين عشية وضحاها (O / N).
  9. التقاط الصور من اليرقات الثابتة باستخدام المجسام مع كاميرا رقمية. استخدام 30X التكبير، ISO 200، و 200 وقت التعرض مللي ثانية. توجيه اليرقات بحيث الأمامي للجنيهقدم وظهري هو الجزء العلوي من الحقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كان التعرض إلى 300 ملي الإيثانول لمدة 22 ساعة أي تأثير على البقاء على قيد الحياة (لا تظهر البيانات)، بما يتفق مع التقارير السابقة 5،23،26. ومن المتوقع، كما الإيثانول هو مشوه المعروفة وبمثابة مراقبة إيجابية. وتضمنت الظواهر الملحوظة ذمة التامور، السباحة noninflation المثانة (الشكل 1)، والعيوب القحفي، وتأخر في النمو (لا تظهر البيانات).

أدت المعاملة مع النتريت في خفيفة الى تأثيرات شديدة على البقاء على قيد الحياة، وهذا يتوقف على الوقت من التعرض. على سبيل المثال، والتعرض إلى 1،000 ملغ / لتر 94 ساعة بقاء تضررا مقارنة مرات التعرض أقصر (الشكل 2).

نحن أيضا بتقييم تأثير تركيزات مختلفة النتريت على البقاء على قيد الحياة. وتعرض الأجنة لمدة 70 ساعة إلى 200، 400، 600، 800، و 1،000 ملغ / لتر. وكانت معدلات البقاء على قيد الحياة أقل عند تعرضها إلى الأعلىتركيزات النتريت، في حين نترات لم يكن لديها تأثير على البقاء على قيد الحياة (الشكل 3). تشبه الظواهر ليرقات المعالجة النتريت أن الإيثانول الأجنة المعالجة (الشكل 4).

الشكل 1
أظهرت تأثيرات التنموية من الايثانول علاج الأجنة تعامل مع الايثانول ذمة التامور (السهم)، والسباحة noninflation المثانة (خط متقطع)، وذمة الكيس المحي (رأس السهم)، والعيوب القحفي (لا تظهر البيانات): الشكل 1. وقد أخذت صور في 96 HPF. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: البقاء على قيد الحياة من 1000 ملغم / لتر النطرون العلاج بعد اوقات مختلفة من المعارضتعرضوا لدى عودتهم. الأجنة إلى 1000 ملغم / لتر النتريت في 2 HPF. وجرفت النتريت من بعد 46، 70، و 94 ساعة من التعرض، وحساب معدل البقاء على قيد الحياة. أدت زيادة مدة التعرض في معدل البقاء على قيد الحياة انخفضت. الانحرافات المعيارية: غير المعالجة = 24؛ 46 ساعة = 6؛ 70 ساعة = 6؛ 94 ساعة = ​​0.9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): البقاء على قيد الحياة بعد التعرض لتركيزات مختلفة النطرون تعرضت الأجنة لمدة 70 ساعة لزيادة تركيز النتريت. أسفرت تركيزات أعلى من النتريت في انخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة. كان نترات أي تأثير حتى على أعلى تركيز من 1000 ملغم / لتر بعد التعرض لمدة 70 ساعة. الانحرافات المعيارية لالنتريت: غير المعالجة = 19؛ 200 ملغم / لتر = 16؛ 400 ملغم / لتر = 21؛ 600 ملغم / لتر = 20؛ 800ملغم / لتر = 14؛ 1000 ملغم / لتر = 12. الانحراف المعياري للنترات يساوي 4. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: تأثيرات التنموية من النترات والنتريت الأجنة تعامل مع 1000 ملغ / نترات L (لوحة المتوسطة) لم يكن لها تأثير مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة (أعلى هيئة). أسفرت العلاج النتريت في 1000 ملغم / لتر في العيوب التنموية الجسيمة بالإضافة إلى الظواهر المماثلة الملحوظة في علاج الإيثانول (اللوحة السفلية). واتخذت صورة في 120 HPF. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يوضح فائدة الزرد في تقييم إمكانية ماسخة من النتريت والنترات. مقارنة الفقاريات الأخرى، الزرد لديها مزايا التي تشمل الخصوبة العالية، والإخصاب الخارجي، والشفافية البصرية، والتطور السريع. المسوخ المتاحة التي تفتقر تصبغ (مثل الزرد كاسبر 36) تساعد أيضا في تعزيز رؤية الأعضاء الداخلية. كما أنه من السهل لتوليد الزرد المعدلة وراثيا بجينات مراسل لتسهيل التحليل في الأسماك الحية 37. لأنه يتم حفظها الجينوم الزرد مع البشر، والمعلومات المكتسبة من دراستهم يمكن أن يؤدي إلى نتائج متعدية في البشر 9. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل التعبير الجيني، مثل التهجين في الموقع، للحصول على معلومات إضافية تتعلق misregulation من الجينات التي تسببها teratogens.

لم تعرض الايثانول لا تؤثر تأثيرا كبيرا على البقاء على قيد الحياة، لكنه لم يسبب أماهعيوب rked مماثلة لتقارير سابقة 5،23،26. هذا يدل على أن لدينا وسيلة موثوق بها في تكرار النتائج التي تم نشرها. كان نترات أي تأثير على البقاء على قيد الحياة، في حين النتريت لم يكون لها تأثير هام اعتمادا على التركيز ومدة التعرض. وكان أطول التعرض ومستويات أعلى من النتريت تأثير سلبي على البقاء على قيد الحياة، بما يتفق مع النتائج السابقة 5. وقد تبين مؤخرا أن التعرض المفرط النتريت تسبب تطوير صمام قلب المعيبة في الزرد 27، التحقق من صحة استخدام الزرد لدراسة آلية teratogens.

فمن الأهمية بمكان أن نؤكد على تركيزات حلول عمل بعد أنها مصنوعة. ويمكن قياس تركيزات النيترات والنيتريت باستخدام إدخال تعديلات على الحد الكادميوم (وكالة الحماية البيئية الطريقة 353.3) وتدييز (وكالة الحماية البيئية الطريقة 354.1) طرق طيفية، على التوالي 28. خطوة حاسمة أخرى هي تغطية لوحة بيتري مع بارافيلم لتقليل بخرالتموينية من الإيثانول إذا تم استخدام هذا كوسيلة لمراقبة إيجابية. إذا اليرقات لها وفيات غير متوقعة (عالية جدا أو منخفضة جدا)، انقر نقرا مزدوجا مراجعة الحسابات وتركيزات الحلول.

مؤخرا، تم استخدام طريقة مماثلة لتحديد آثار ماسخة من الايثانول 29. على الرغم من أن هذه الطريقة مشابهة لطريقة لدينا هنا، وإنما يعرض فقط الأجنة إلى الإيثانول لمدة تصل إلى 24 ساعة، ويفترض نظرا لسمية تعريض الأجنة إلى إيثانول لفترة طويلة من الزمن. في المقابل، أسلوبنا يعرض الأجنة إلى نترات ونتريت لعدة أيام مع استبدال الحلول اختبار يوميا. هذا هو مفيد لاختبار المواد الكيميائية أقل سمية.

نحن نتصور أن لدينا وسيلة يمكن تطبيقها على اختبار أدوية أخرى أو الظروف البيئية المحددة. ومع ذلك، يقتصر هذا الأسلوب لاختبار فقط الجزيئات القابلة للذوبان في الماء. حساسية خفيفة لبعض المواد الكيميائية هي عامل آخر للنظر فيها. إذا الكيماويات الاختبار sensit خفيفةإيف، والتفاف أطباق بتري في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. أيضا، فإن هذه الطريقة ليست جيدة لاختبار الماء مأخوذة من بيئة معينة لأن الزرد المختبر تتطلب ظروف محددة (مثل درجة الحموضة والموصلية) للنماء. وحتى مع ذلك، يخدم الزرد كنموذج إيجابي لتحديد بسرعة العيوب التنموية الناجمة عن teratogens المحتملين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DREL/2010 instrument Hach 26700-03
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
KIMAX glass Petri Dish VWR 89001-244
MS-222 Sigma-Aldrich E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent Hach 14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent Hach 14065-99
Parafilm Fisher Scientific 3-374-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
S6E stereomicroscope Leica 10446294
Sodium nitrate Fisher Scientific S343
Sodium nitrite Fisher Scientific S347
Transfer pipets Laboratory Products Sales L320072
Glass vials Fisher Scientific 03-338B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
  3. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
  4. Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
  5. Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
  6. Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
  7. Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
  8. Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
  9. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  10. CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
  11. Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
  12. Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
  13. Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
  14. Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
  15. Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
  16. Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
  17. Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
  18. Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
  19. Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
  20. Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf (1991).
  21. Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
  22. Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf (2001).
  23. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
  24. Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
  25. Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
  26. Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
  27. Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
  28. Methods for chemical analysis of water and wastes. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).
  29. Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
  30. Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , book 5 1-26 (1996).
  31. Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
  32. Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
  33. Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
  34. Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  35. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  36. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  37. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 108، مشوه، نترات، نتريت، الإيثانول، الزرد، جنين
الزرد نموذجا لتقييم إمكانات المسخية من النطرون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A.… More

Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A. E., Simmons, T. W., Diep, C. Q. Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite. J. Vis. Exp. (108), e53615, doi:10.3791/53615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter