We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
knockdowns mediada por RNA são amplamente utilizados para controlar a expressão do gene. Esta família de técnicas versátil faz uso de ARN curto (sRNA) que pode ser sintetizado com qualquer sequência e concebido para complementar a qualquer gene alvo para silenciamento. Porque sRNA construções podem ser introduzidas para muitos tipos de células, directa ou usando uma variedade de vectores, a expressão do gene pode ser reprimida nas células vivas sem modificação genética trabalhoso. O ARN mais comum tecnologia knockdown, a interferência de ARN (ARNi), faz uso da sequência de reconhecimento complexo de silenciamento (RISC) induzido por ARN para mediar endógena e a clivagem do ARNm alvo. Aplicações desta técnica são, por conseguinte, limitadas a organismos que expressam RISC, principalmente eucariotas. Recentemente, uma nova geração de ARN biotechnologists desenvolveram mecanismos alternativos para controlar a expressão do gene através de ARN, e assim tornada possível knockdowns de genes mediada por RNA de bactérias. Aqui nós descrevemos um método para silenciar genes expresSion em E. coli que funcionalmente se assemelha RNAi. Neste sistema, um fagomídeo sintético é desenhado para expressar sRNA, que podem concebidos para ter como alvo qualquer sequência. A construção de expressão é entregue a uma população de E. células de E. coli com o fago M13 não lítico, após o que é capaz de se replicar de forma estável como um plasmídeo. Reconhecimento de anti-sentido e silenciamento do ARNm alvo é mediada pela proteína HFQ, endógena para E. coli. Este protocolo inclui métodos para a concepção da sRNA anti-sentido, a construção do vector fagemídeo, o empacotamento do fagemídeo em bacteriófago M13, a preparação de uma população de células vivas para a infecção, e realizando a infecção em si. A proteína fluorescente mKate2 eo cloranfenicol acetiltransferase gene de resistência a antibiótico (CAT) são direcionados para gerar dados representativos e quantificar a eficácia knockdown.
knockdowns de genes mediada por ARN de proceder em duas fases. Em primeiro lugar, uma molécula de RNA é introduzido a uma linha de célula ou organismo de estudo. Em segundo lugar, as proteínas de ligação a ARN endógenos facilitar o reconhecimento de ARN-alvo e produzir o efeito de silenciamento. Todas as tecnologias de ARN knockdown beneficiar da natureza personalizada de sRNAs sintéticas, que podem ser facilmente produzidos a corresponder a um alvo específico de interesse. No entanto, os detalhes moleculares de captação de ARN e silenciamento variam amplamente entre sistema modelo, restringindo onde e como knockdowns ARN pode ser aplicada.
Em nemátodos, ARN de cadeia dupla moléculas (dsRNA) pode ser introduzido directamente nos meios de alimentação ou por os vermes com uma população de ARNcd-expressando E. células de E. coli 1,2. Em Drosophila, RNAi pode ser conseguida por microinjecção de embriões com três ARNcd, ou aplicada em linhas de células por simples adição de ARNdc para o meio de cultura quatro. Em linhas celulares de mamífero,sintéticos pequenos ARN interferentes (siRNAs) podem ser entregues a células vivas por electroporação 1,2,5, empacotado em lipossomas 3,6, ou expressas a partir de vectores de DNA do plasmídeo 4,7. Uma vez que as espécies de ARN atinge o citossol, a via de RNAi baseia-se no complexo RISC para processar ARNcd, anti-sentido de facilitar o reconhecimento do alvo, e catalisar a repressão de translação, a degradação de ARNm, ou a formação de heterocromatina, dependendo do hospedeiro.
Devido a esses requisitos, clássica RNAi pode ser realizada apenas em organismos que ocupam RNA exógeno de forma eficiente e expressam RISC ou uma atividade RISC-like. Notavelmente, isto exclui o modelo bactéria E. coli, que não possui a via de RNAi. No entanto, os recentes avanços na biologia sintética fornecer as ferramentas para resolver tanto o problema da entrega eo problema silenciamento.
Neste protocolo, as construções Srna estão expressos em E. coli a partir de um vector de ADN entregue a Living células utilizando o sistema de fagemídeo / ajudante M13. Um fagemideo é qualquer plasmídeo com uma origem F1 derivadas de fagos de replicação. Um plasmídeo auxiliar, neste caso M13KO, carrega toda a maquinaria necessária para a produção de partículas virais, mas não em si é competente para replicação e empacotamento. Quando um fagemídeo e o plasmídeo ajudante são co-transformada, o fagemídeo sozinho é replicada na origem f1, embalados e segregada. O fagemídeo vectorizado é então competente para infectar E. vivo coli através do pilus F.
Neste sistema, o efeito silenciador é produzido por cassetes srna costume combinando uma sequência de suporte com uma sequência de ligação ao alvo. A sequência de ligação ao alvo é de 24 pares de bases anti-sentido a um ARNm alvo, normalmente no local de ligação ao ribossoma (RBS). A sequência de suporte, desenvolvido pela Na e colegas 8, contém um motivo de ligação HFQ extraído de MICC, um pequeno ARN de regulação endógeno para E. coli. A proteína HFQ estimula ARN-ARN binding e degradação do mRNA, que serve um papel neste sistema semelhante ao RISC em RNAi. A Figura 1 representa um esquema completo para knockdowns srna mediada por fago, incluindo a estrutura sRNA cassete, vectorização fagemídeo, e um mecanismo de silenciamento.
Como um método para modular a expressão do gene em E. coli, sRNA silenciamento é simples, rápida e versátil. A E. alvo coli não é sobrecarregado além de propagar o fagemídeo e expressando a sRNA. Isto pode ser relevante no contexto da biologia sintética ou pesquisa básica em que a expressão de construções heterólogas maiores podem forçar os recursos celulares 9. Os fagemídeos com novos alvos pode ser produzido com uma única PCR e colhido um dia depois da transformação fagemídeo. Finalmente, quase todo o mRNA podem ser alvo. A cassete de regulação sRNA (num plasmídeo padrão) foi mostrado para trabalhar sobre uma variedade de alvos no metabolismo com níveis de repressão típicos> 90% 8.
<p class = "jove_content"> Este protocolo reproduz e se expande em trabalhos anteriores usando fagemídeo-nascido sRNA cassetes 10. Em primeiro lugar, um fagomídeo empacotado é introduzido a uma cultura em lotes de E. células de E. coli e utilizada para silenciar a expressão da proteína fluorescente mKate2. alterações de fluorescência subsequentes são monitorados em tempo real. Em segundo lugar, derrubar o gene CAT é mostrado para reduzir a resistência ao cloranfenicol fenotípica em placas de agar. Em ambos os casos, o próprio fagemídeo transporta um marcador GFP, permitindo que a taxa de infecção a ser medida independentemente da eficiência knockdown.O presente método conseguido redução de 80% nos níveis de fluorescência mKate comparação com controles não direcionados. Isto está de acordo com outros métodos de knockdown de ARN, onde silencioso completo não é observada e eficiência 50-90% é típico 16,17. Ao nível fenotípica, knockdowns alvo-CAT foram capazes de atenuar significativamente a resistência ao cloranfenicol, e eliminá-lo sob algumas condições.
O fenótipo knockdown foi detectável ao nível da população depois de apenas algumas horas após a infecção (Figura 3B). Isto ilustra uma característica importante de entrega à base de fagos: uma frequência alta knockdown pode ser obtida directamente na cultura em lotes, sem modificação genética antes. Ao contrário as modificações genéticas convencionais utilizando transformação ou plasmídeo de integração genómico, infecção fágica não exige que uma população ser re-cultivadas a partir de uma única colónia isolada. Isto permite que os efeitos da infecção por fagos para ser Explored em populações com dinâmicas espaciais complexos 11, com estruturas espaciais pré-existentes, como biofilmes 18, ou em populações naturais geneticamente mistos 19.
Um passo crítico neste método é a produção de fagemídeo embalados em título elevado. A carga metabólica associada com a produção de partículas de fago pode conduzir a altas taxas de mutação ou perda do plasmídeo na estirpe de produção fagemídeo. Recomenda-se que a estirpe de produção fagemídeo ser cultivado directamente a partir de uma única colónia co-transformadas e não refrigerados, congelados ou sub-cultivadas antes da colheita de fagos. A baixa eficiência de co-transformação também pode ser observada quando se introduz o plasmídeo fagemídeo e ajudante para E. coli simultaneamente. Neste caso, as eficiências mais elevadas podem ser obtidos por transformação do plasmídeo auxiliar em primeiro lugar, em seguida, a preparação de células competentes que ostentam o plasmídeo ajudante para a subsequente transformação com o fagemídeo.
Phainfecção gemid ou expressão sRNA também impõe uma carga metabólica detectável nas células alvo, e pode resultar em alguma perturbação fenotípica. Por exemplo, foi observada uma redução na fluorescência mKate2 mesmo quando as células foram infectadas com um fagemídeo segmentação CAT (Figura 3). A infecção com o M13 não é pensado para desencadear respostas de estresse sistêmico em E. coli 20, mas pode alterar os padrões de transcrição indiretamente. Alternativamente, os marcadores de resistência à ampicilina ou GFP incluídos no fagemídeo pode concorrer para recursos celulares, reduzindo a expressão e crescimento mKate2 9. Finalmente, a cassete de sRNA si pode alterar globalmente perfis de expressão de gene por titulação da proteína HFQ, ou por meio de silenciamento de ARNm para fora do alvo. Efeitos alvo Off são comuns em in vivo RNAi visando 21-23, mas eles ainda têm de ser sistematicamente investigada para este sistema.
Uma limitação deste método é que a efi infecçãoeficiência é inferior a 100%, permitindo que algumas bactérias não infectadas para persistir na população. Os resultados deste trabalho e trabalho anterior 10 sugerem que as células não infectadas representam 1-10% da população final, e são responsáveis pela maioria dos fenótipos nonsilenced observados. Uma variedade de rotas para a M13-resistência são conhecidos, com a perda mutacional sendo mais comum da expressão de pelos 24. À luz destas limitações, os controles devem ser utilizadas para confirmar a altas taxas de infecção e eficiência knockdown.
Outra limitação potencial para algumas aplicações é a transferência ocasional de contaminação do fago auxiliar. Embora M13K07 contém um sinal de empacotamento mutado, pode ser empacotado em cápside do fago em baixa frequência e transferido para populações infectadas, o que resulta em células competentes para a produção de fagos e a propagação continuada de fago além do evento infecção inicial 25. Modificações para o fago auxiliar têm se mostrado eficazesa redução de embalagens não específica, embora às vezes com o custo de produção de fagos reduzida 26.
Bacteriófago engenharia tornaram-se uma ferramenta indispensável para E. biologia sintética coli, permitindo a entrega rápida de novos genes de uma população crescente. Um trabalho recente produziu circuitos de comunicação intercelular 11 ou expressa fatores de transcrição para reprimir a resistência aos antibióticos vias 27. O protocolo aqui apresentado acrescenta a uma crescente coleção de ferramentas que permitem o controle da fisiologia bacteriana através de RNAs programados. Nucleases CRISPR-cas, quando sofre mutação para eliminar a actividade nuclease, foram mostrados para reprimir a transcrição de genes alvos guiados por RNA 17,28. Em contraste, sRNA silenciamento funciona ao nível da tradução e não requer a expressão de proteína exógena. biotecnologias da próxima geração podem se unir controle da transcrição e tradução, com entrega mediada por fago para programar pheno complexotipos em tempo real.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento para este trabalho foi fornecida pela Fondation Bettencourt Schueller em apoio da equipe de Paris Bettencourt iGEM. Agradecemos a unidade INSERM pesquisa U1001 e Chantal Lotton para a assistência técnica e aconselhamento. Fagemídeo Litmus28i_J23115-B0032-GFP foi fornecida por Monica Ortiz e Drew Endy de Stanford.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |