Abstract
knockdowns בתיווך RNA נמצא בשימוש נרחב לשלוט ביטוי גנים. המשפחה צדדי זה של טכניקות עושה שימוש RNA קצר (Srna) כי יכול להיות מסונתז עם כל רצף שנועדו להשלים כל הגן ממוקד עבור השתקה. בגלל Srna בונה יכולה להיות מוצגת בפני סוגי תאים רבים ישירות או באמצעות מגוון של וקטורים, ביטוי גנים יכול להיות מודחק בתאים חיים ללא הנדסה גנטית מייגעת. הטכנולוגיה הנפוצה ביותר RNA מציאה, התערבות RNA (RNAi), עושה שימוש מושרה RNA אנדוגני השתקה מורכב (RISC) לתווך רצף הכרת המחשוף של mRNA היעד. יישומים של הטכניקה הזו ולכן מוגבלים RISC להביע אורגניזמים, אאוקריוטים בעיקר. לאחרונה, דור חדש של biotechnologists RNA פתח מנגנונים חלופיים לשליטת ביטוי גנים באמצעות RNA, וכך מתאפשר knockdowns גן בתיווך RNA בחיידקים. כאן אנו מתארים שיטה להשתקת הבעת גןשיאון ב E. coli מבחינה תיפקודית דומה RNAi. במערכת זו יש phagemid סינתטי נועד להביע Srna, אשר עשוי שנועד למקד כל רצף. בונת הביטוי מועברת לאוכלוסייה של E. קולי תאים עם הפאג M13 לא אלים, שלאחריו הוא מסוגל לשכפל כמו פלסמיד ביציבות. הכרה והשתקה אנטיסנס של mRNA היעד מתווכת על ידי חלבון Hfq, אנדוגני E. coli. פרוטוקול זה כולל שיטות לעיצוב antisense Srna, בניית וקטור phagemid, אריזת phagemid לתוך bacteriophage M13, הכנת האוכלוסייה תא חי עבור זיהום, וביצוע הזיהום עצמו. חלבון פלואורסצנטי mKate2 ואת acetyltransferase chloramphenicol גן עמידות לאנטיביוטיקה (CAT) ממוקדות להפיק נתונים נציג לכמת האפקטיביות מציאה.
Introduction
knockdowns הגן בתיווך RNA להמשיך בשני שלבים. ראשית, מולקולת רנ"א הוא הציג קו תא או אורגניזם של המחקר. שנית, חלבונים קושרי RNA אנדוגני להקל הכרה RNA-היעד ולייצר אפקט השתקה. כל טכנולוגיות מציאת RNA ליהנות מן הטבע להתאמה האישי של sRNAs הסינטטי, אשר ניתן להפיק בקלות כדי להתאים למטרה ספציפית של עניין. עם זאת, את הפרטים המולקולריים של ספיגת RNA והשתקה להשתנות משמעותי על פני מערכת מודל, מגבילים איפה ואיך knockdowns RNA יכול להיות מיושם.
נמטודות, RNA פעמיים תקועים (dsRNA) מולקולות יכול להיות מוצג באופן ישיר בתקשורת או על ידי האכלה תולעים עם אוכלוסייה של dsRNA להביע E. 1,2 קולי תאים. תסיסנית, RNAi יכול להיות מושגת על ידי microinjecting עוברים עם dsRNA 3, או מיושם שורות תאים פשוט על ידי הוספת dsRNA עד בינוני התרבות 4. בשורות תאי יונקים,RNAs התערבות קטנה סינתטי (siRNAs) עשויה להיות מועברת לתאים חיים על ידי electroporation 1,2,5, ארוזים ליפוזומים 3,6, או לידי ביטוי מתוך וקטורים פלסמיד דנ"א 4,7. לאחר מינים RNA מגיע cytosol, מסלול RNAi מסתמך על מורכבות RISC לעבד dsRNA, להקל הכרה antisense של היעד, ולזרז את דיכוי translational, השפלה mRNA, או היווצרות heterochromatin, תלוי המארח.
בגלל דרישות אלה, קלסי RNAi יכול להתבצע רק באורגניזמים כי תופסי RNA אקסוגניים ביעילות ולהביע RISC או פעילות RISC דמוית. יש לציין, זו אינה כוללת את חיידק מודל E. coli, אשר חסרה את מסלול RNAi. עם זאת, התקדמות ביולוגיה סינטתית לספק את הכלים לפתור גם את בעית המשלוח ובעית ההשתקה.
בפרוטוקול זה, בונה Srna באים לידי ביטוי E. coli מן וקטור DNA נמסר liוינג התאים באמצעות מערכת phagemid / עוזר M13. Phagemid הוא כל פלסמיד עם ממוצא F1 הנגזרות הפאג של שכפול. פלסמיד עוזר, במקרה זה M13KO, נושאת את כל המנגנון הנדרש כדי לייצר חלקיקים נגיפיים, אך היא עצמה אינה מוסמכת לשכפול ואריזה. כאשר phagemid ו פלסמיד עוזר משתפים טרנספורמציה, phagemid לבד משוכפל בראשית הצירים F1, ארוז ומופרשת. Phagemid vectorized אז המוסמכות להדביק חי E. coli באמצעות pilus F.
במערכת זו, ההשפעה השתקה מופק על ידי קלטות מנהג Srna שילוב רצף פיגום עם רצף מחייב היעד. רצף מחייב היעד הוא 24 זוגות בסיסים antisense כדי יעד mRNA, בדרך כלל באתר מחייב הריבוזום (RBS). רצף הפיגום, שפותח על ידי Na ועמיתיו 8, מכיל מוטיב מחייב Hfq מופק MICC, RNA רגולטוריים קטן אנדוגני E. coli. החלבון Hfq מגרה RNA-RNA bindin g והשפלה mRNA, ממלאת את תפקידי במערכת זו דומה RISC ב RNAi. איור 1 מתאר תוכנית מלאה הנוקאוט Srna בתיווך הפאג, לרבות המבנה קלטת Srna, vectorization phagemid, ומנגנון השתקה.
כשיטה לווסת ביטוי גנים א השתקת coli, Srna היא פשוטה, מהירה צדדית. וממוקדי E. coli הוא לא עמוס מעבר להפצת phagemid ומבטא את Srna. זה עשוי להיות רלוונטי בהקשר של ביולוגיה סינתטית או מחקר בסיסי מה מקור הביטוי של מבנים Heterologous גדול יכול להתאמץ משאבים הסלולר 9. Phagemids עם מטרות חדשות יכול להיות מיוצר עם יחיד PCR וקצר יום אחד לאחר שינוי phagemid. לבסוף, כמעט כל mRNA יכול להיות ממוקד. הקלטת תקנת Srna (על פלסמיד סטנדרטי) הוכחה לעבוד על מגוון רחב של מטרות במטבוליזם עם רמות דיכוי טיפוסיות> 90% 8.
ss = "jove_content"> פרוטוקול זה מתרבה ומרחיב על העבודה קודמת באמצעות phagemid יליד Srna קלטות 10. ראשית, phagemid ארוז הוא הציג את התרבות אצווה של E. קולי תאים והשתמשו להשתיק ביטוי של חלבון פלואורסצנטי mKate2. שינויי קרינה לאחר מנוטר בזמן אמת. שנית, דריסת גן CAT מוצג להפחית התנגדות chloramphenicol פנוטיפי על צלחות אגרו. בשני המקרים, phagemid עצמה נושאת סמן GFP, המאפשר שיעור זיהום להימדד באופן בלתי תלוי את יעילות מציאה.
Protocol
עיצוב 1. בניית וקטורי phagemid Bearing Srna השתקת קלטות
- דה נובו עיצוב Srna השתקת קלטות 8
- זהה את הרצף השלם של mRNA להיות מושתק באמצעות מסד נתוני רצף DNA. כדי ליצור רצף היעד, לציין את 24 נ"ב הראשונים של רצף קידוד, מעמדת 1-24 החל קודון ההתחלה (למשל, ATG).
הערה: ההשתקה היא פחות יעילה כאשר אתרים או מקטעים נוספים של mRNA ממוקדות 8. - קח את המשלים השני של רצף היעד לייצר רצף מורה קלטת Srna. ראה טבלה מס '1 עבור דוגמאות של רצפי היעד ומדריך עבור acetyltransferase chloramphenicol (CAT).
- כדי לעצב את הביטוי Srna קלטת להשלים 292 נ"ב, לארגן האמרגן PR, רצף GUIDE, Hfq חלבון מושלם מחייב T1 / TE רצפים terminator תעתיק בסדרה (טבלה 2).
- הוסף אתרי שיבוט נוספים של בחירה כדי להקל שיבוט של קלטת Srna לתוך וקטור היעד.
- השג את קלטת Srna להשלים באמצעות סינתזת גן מסחרית או שיטה דומה ולשכפל אותו לתוך כל וקטור phagemid עם ממוצא שכפול F1 התפקודי 11. ראה מידע תומך עבור הרצף השלם של וקטור phagemid הסופי.
- זהה את הרצף השלם של mRNA להיות מושתק באמצעות מסד נתוני רצף DNA. כדי ליצור רצף היעד, לציין את 24 נ"ב הראשונים של רצף קידוד, מעמדת 1-24 החל קודון ההתחלה (למשל, ATG).
- לשנות את הרצף הממוקד על ידי קלטת ביטוי Srna קיים באמצעות PCR מבוסס אתר הבימוי mutagenesis 12
- זהה את רצף GUIDE 24 נ"ב קלטת ביטוי Srna קיימת. הערה: הפלסמיד pAB.001 המבואר, המשמש בעבודה זו, זמין כקובץ רצף משלים.
- עיצוב קדימה ולהפוך פריימרים עם אזורים קצרים הומולוגיה לקסטת Srna קיימת איגוף רצף GUIDE 24 נ"ב החדש. השג את פריימרים באמצעות סינתזת oligonucleotide מסחרית.
הערה: עיצוב פריימר עבור mutagenesis אתר מכוון הוא depicטד באיור 2. רצפי תבנית המדויק פריימר ניתנים בטבלה 3. - הכן תרבות 5 מ"ל של E. coli נושאת את phagemid ביטוי Srna תבנית. לגדל את התאים לילה בשעה 37 ° C עם רעד, בתקשורת LB עם אנטיביוטיקה מתאימה.
- חלץ ולטהר את phagemid ביטוי תבנית Srna מן התרבות חיידקים 5 מ"ל באמצעות ערכת DNA miniprep או שיטה דומה 12.
- הכן שתי תגובות PCR באמצעות phagemid ביטוי Srna תבנית פולימראז באיכות גבוהה, אחד עם קדימה ואחד עם פריימר ההפוך (לוח 4). השתמש תנאי PCR כפי שהומלץ על ידי ספק פולימראז (לוח 5). להגדיל את ריכוז תבנית 10-50x גבוה יותר מאשר תגובה סטנדרטית להסביר את העובדה שהתגובה פריימר היחידה אינה מייצרת הגברת מעריכים.
- מערבב את תגובות PCR מעל השנייה בתוך שפופרת microcentrifuge. Anneal המוצרים על ידי חימום עד 98 מעלות צלזיוס באמבט מים רותחים. מיד לאחר הנחת הצינור microcentrifuge באמבט מים, להסיר את מקור החום ולאפשר באמבטיה לחזור לאט לטמפרטורת החדר במשך 1-2 שעות.
- על מנת לפסול את phagemid ביטוי תבנית Srna unmutated, להוסיף 1 μl. אנזים הגבלה DpnI לתערובת לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, או הזמן המומלץ על ידי היצרן לעיכול שלם.
הערה: DpnI מעכל רק לנקודות היעד מפוגל, אשר נמצאים על phagemids מאכסן משוכפל אבל לא מוצרי ה- PCR. - להפוך לרכוש או מוכן 13 כימית המוסמכות E. coli עם 1-5 μl של מוצר ה- PCR המרותק. לבודד מושבות אחת של המתח הפך על ידי ציפוי סלקטיבי על צלחות אגר LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה.
- כדי לאמת את ההתאגדות של רצף GUIDE הנכון, מסך המושבות שהתקבלו על ידי מושבת PCR. בעזרת קצה פיפטה 200 μl, שיתוףllect כמות קטנה של תאים ממושבת טרנספורמציה יחידה. מארק ולשמר את המושבה המקורית לשימוש במורד הזרם לאחר אימות.
- מוסיפים את התאים שנאספו עד 50 μl של מים nuclease ללא בצינור microcentrifuge. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- באמצעות thermocycler הספסל העליון או באמבט מים רותחים, lyse התאים על ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- PCR-להגביר את האזור phagemid באמצעות 1 μl של תאים lysed חום כתבנית DNA. תנאי PCR ופרוטוקולי thermocycler ניתנים בלוחות 6 ו -7. ראה את קובץ הרצף pAB.001 משלים עבור רצפים פריימר אימות.
- רצף מוצר PCR לאמת התאגדות של רצף GUIDE הנכון.
- לחסן תרבות 5 מ"ל של E. שיבוט coli נושא את phagemid Srna הביטוי מאומת הרצף. לגדל את התאים לילה בשעה 37 ° C עם רעד, בתקשורת LB סלקטיבית.
- הכנתי מלאה גליצרולשל שיבוט רצף-מאומת. הוסף 750 μl של תרבות לילה 250 μl של גליצרול 60% בתוך שפופרת קריו בורג מכסה.
- אחסן את המניה גליצרול ב -80 ° C ללא הגבלת זמן. שאר תרבות הלילה ניתן להשתמש כמקור עבור phagemid ביטוי Srna בשלב 2.
2. ייצור קציר של מניות phagemid ארוזים M13
- הכן תרבות 5 מ"ל של E. coli נושאת את phagemid ביטוי Srna. לגדל את התאים לילה בשעה 37 ° C עם רעד, בתקשורת LB עם אנטיביוטיקה מתאימה. הערה: phagemid הביטוי Srna ניתן לקבל באמצעות שיבוט דה נובו כמתואר בשלב 1.1.5, או שונה מן phagemid קיים וקצר בשלב 1.2.16.
- באופן דומה להכין תרבות 5 מ"ל של E. coli נושאת פלסמיד עוזר M13KO7. לגדל את התאים לילה בשעה 37 ° C עם רעד, בתקשורת LB סלקטיבית.
- חלץ ולטהר את expressio Srnan phagemid ו פלסמיד עוזר באמצעות ערכת חילוץ DNA או שיטה דומה 12.
- Cotransform שנרכש או מוכן 13 חיידק מוסמך כימי עם 1 μl כל אחד phagemid ביטוי Srna ו פלסמיד עוזר. בחר עבור cotransformants ידי ציפוי על אגר LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית עבור שני המבנים.
- הכן תרבות 10 מיליליטר ממושבה אחת של זן cotransformed ב LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 8-12 שעות או לילה.
- צנטריפוגה התרבות ב 3,300 XG במשך 10 דקות. אסוף את supernatant ולסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. זהירות: במקרה של דליפת תקשורת, לנקות את האזור עם אקונומיקה מדוללת (0.5%) להרוס חלקיקים הפאג זיהומיות.
- אחסן את התסנין הארוז phagemid על 4 מעלות צלזיוס. הערה: דוגמאות יכולות להישמר במשך ימים עד שבועות ללא הפסד של פעילות.
3. הכנת תאי F + יעד השתקה
- לקבוע אם התאים להיות ממוקד עבור השתקה לבטא את pilus F 14. אם pilus F קיים כבר, המשך לשלב 4.
הערה: זני מעבדה משותפים של E. coli הוא מבואר כמו F + או F 'כדי לציין את נוכחותו של pilus F בגנום שלהם או על פלסמיד. - השג זן F + של E. coli כגון TOP10F '.
הערה: ודא כי מתח יעד נושא סמן התנגדות ייחודי כדי להפריד בין תורם F-פלסמיד לאחר הצמיד. - כדי להציג pilus F על ידי נטיה עם זן F +, להכין 5 מ"ל תרבויות הן של זן היעד התורם F-פלסמיד 14. לגדל את התאים לילה בשעה 37 ° C עם רעד, בתקשורת LB עם אנטיביוטיקה מתאימה.
- למחרת, לדלל שני זני 1: 100 ב 5 מ"ל של LB סלקטיבית ולהמשיך culturing על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- לקבוע את שלב הצמיחה של תאים על ידי מדידת optצפיפות iCal של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות ספקטרופוטומטר המעבדתיים. תרבות התאים למשך כ -2 שעות עד OD 600 של 0.3 מושגת, על צמיחת יומן פאזיים 15.
- כן 3 תגובות נטיית צינורות microcentrifuge: 0.5 מיליליטר F-פלסמיד תורם + 0.5 מיליליטר זן יעד, 0.5 מיליליטר תורם F-פלסמיד + 0.5 מיליליטר תקשורת LB (שליטה שלילית) ו -0.5 מיליליטר זן יעד + 0.5 מיליליטר תקשורת LB (שליטה שלילית). אפשר הנטייה להמשיך במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- פלייט 100 μl של כל תגובה נטיה על אגר LB סלקטיבית עם אנטיביוטיקה ספציפית-פלסמיד F (בדרך כלל טטרציקלין) ומתח היעד. פלייט תגובות הבקרה השליליות על מנת לאשר כי לא תורמים או זן נמען מבטא הוא התנגדויות אנטיביוטיות.
4. זיהום עם Phagemids הארוז עבור השתקה
- לחסן מושבה אחת של תאים היעד F + לתוך תרבות 5 מ"ל של Medi LBA עם אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה לילה בשעה 37 ° C עם רעד.
- למחרת, לדלל את תאי יעד F + 1: 100 ב 5 מיליליטר של תקשורת LB סלקטיבית ולהמשיך תרבות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- לקבוע את שלב הצמיחה של התאים על ידי מדידת הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות ספקטרופוטומטר המעבדתיים. תרבות התאים למשך כ -2 שעות עד OD 600 של 0.3 מושגת, על צמיחת יומן פאזיים 15. הערה: הביטוי של יעילות pilus וזיהום F הוא הגבוה ביותר בשלב יומן.
- מוסיף את phagemids ארוז M13 (משלב 2.6) על תאי היעד ביחס נפח של 1: 100 להשיג כמעט זיהום 99% של אוכלוסיית היעד. אפשר הזיהום להמשיך ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 30-60 דקות.
- Assay הפנוטיפ Srna-השתקה לפי שיטת הבחירה.
הערה: יעד חלבון פלואורסצנטי, השפעת ההשתקה ניתן לכמתישירות על ידי fluorometry 10. לחלופין, מבחני פנוטיפי ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשלכות פנוטיפי של גן מציאת 8. - הכינו מלאי גליצרול עבור המארח phagemid Srna להביע ביצוע השלבים 1.2.14-1.2.16. הערה: phagemid יהיה להפיץ זן המארח ללא הגבלת זמן יכול להישמר עם אנטיביוטיקה דומה פלסמיד קונבנציונאלי.
Representative Results
השתקת mKate2 קרינת מדיה נוזלית
איור 1 מתאר את ערכת הנוקאוט בתיווך Srna המתואר בעבודה זו, לרבות עיצוב קלטת Srna, vectorization phagemid, ומנגנון השתקה. בעקבות פרוטוקול 1.2, את הקלטת השתקה Srna של פלסמיד pAB.001 שונתה למקד mKate. הקלטת Srna היה synthetized ו משובטים לתוך phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP, מתנת מוניקה אורטיז דרו אנדי 11. phagemid זו נושאת סמנים לביטוי GFP והתנגדות kanamycin, המאפשרת זיהומים מוצלחים להיות במעקב. מניות phagemid ארוזים הוכנו לאחר פרוטוקול 2.
הוא נגזר של E. coli K12 MG1655 נושאת הביע constitutively, סמן mKate2 משולב כרומוזומלית הוכנה עבור זיהום הפאג ידי נטייה עם זן תורם פלסמיד F בעקבות פרוטוקול 3. התאים גדלו לשלב יומן אמצע ואת phagemid הציג בעקבות פרוטוקול 4. לאחר ההדבקה phagemid, 200 תרבויות μl הועברו קורא צלחת פלואורסצנטי הקרינה היה פיקוח רציף במשך 24 שעות.
איור 3 מראה את ההשפעה של השתקה בתיווך Srna על הביטוי mKate2. הזן נגוע עם phagemid אנטי mKate2 לא הראה קרינת mKate2 לגילוי מעל ברקע. בניגוד לכך, זן זה עשה להביע את הסמן GFP, המציין ספיגת המוצלח של phagemid. לתאי קבוצה נגועים מיוצרים קרינת mKate2 אבל לא GFP. פקד נוסף, שבו תחום מיקוד אנטי mKate2 הוחלף CAT מיקוד רצף, לא הייתה השפעה על הקרינה mKate2.
השתקה של Chloramphenicol התנגדות על צלחות אגרו
התוכן "FO: keep-together.within-page =" 1 "> בעקבות פרוטוקול 1.1, קלטת השתקה Srna הופק למקד CAT הוא נגזרת של E. coli K12 MG1655 נושאת הביע constitutively, סמן CAT משולבת כרומוזומלית הוכן עבור. זיהום הפאג ידי נטיה עם זן תורם F-פלסמיד בעקבות פרוטוקול 3. התאים גדלו לשלב יומן אמצע ואת phagemid הציג בעקבות פרוטוקול 4. לאחר שעה 1 של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, תאים נגועים דוללו באופן סדרתי מצופה טווח הריכוזים chloramphenicol. צלחות הודגרו לילה, ואת חלקם של תאים עמידים בכל ריכוז chloramphenicol נקבע על ידי ספירת יחידות המושבה להרכיב (CFUs) למחרת.איור 4 מראה את ההשפעה של השתקה בתיווך Srna על הפנוטיפ התנגדות chloramphenicol. תאים נגועים, או תאים נגועים עם phagemid מיקוד mKate2, היו עמידיםchloramphenicol בכלל ריכוזי נבדק. לעומת זאת, תאים נגועים מיקוד phagemid CAT הראו מופחת הישרדות בריכוזים chloramphenicol נמוך, וכמעט 99% להרוג בריכוזים גבוהים. התוספת של אמפיצילין, כדי לבחור עבור חיידקים רק נושאים את phagemid, מופחת הישרדות chloramphenicol לרמות בלתי מורגשות. זה עולה בקנה אחד עם עבודה קודמת מראה שבריחה מזיהום הפאג הוא מסלול משותף לברוח השתקת 10.
איור 1: ג'ין השתקה ב E. coli עם Srna ביטוי קלטות נמסר על ידי M13 הפאג קלטת Srna מורכבת 4 מודולים:. אמרגן PR (אמרגן מכונן נגזר למבדה bacteriophage), תחום מיקוד 24 נ"ב, תחום מחייב Hfq מופק MICC ו שליחות קטלנית 8 תעתיק E. coli המבטא את pilus F, שבו ביטוי Srna מתחיל. Srna ואז מגייס חלבון Hfq (המתואר באדום) ונקשר מטרת mRNA antisense סמוך לאתר מחייב הריבוזום, וכתוצאה מכך הדחקת translational ושפלת mRNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. עיצוב פריימר ואת לאתר בימוי mutagenesis באתר Srna יעד שני פריימרים נועדו עם הומולוגיה חלקית קלטת Srna הקיים. פריימר קדימה מכיל 20 נ"ב הומולוגי אמרגן PR בסוף '5, ואחריו24 נ"ב המייצג את רצף המדריך החדש, אז 18 נ"ב הומולוגי לתחום מחייב Hfq בסוף '3. פריימר ההפוכה הוא משלים הפוך המדויק של פריימר קדימה, עם אזורים של הומולוגיה לקסטת Srna קיימת איגוף המשלים השני של רצף המדריך החדש. רצפים פריימר מדויקים מובאים בטבלה 3. PCR תגובות יחידה פריימר נפרדות עם קדימה פריימרים הפוכים לייצר ליניארי, דנ"א חד-גדילים עם הרצף השונה הרצוי. חישול קדימה ואחורה תוצרי תגובה, לאחר לנקות כמתואר בפרוטוקול, תוצאות ב- DNA פלסמיד פעמים תקועות הנושאים את קלטת Srna השונה הרצויה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Knockdown של כתב ניאון כרומוזומלית משולב mKate2. E. coli MG1655 K12 להביע mKate2 היו או לא מטפלים בהם (הקווים האדומים וברים), נגוע עם phagemid אנטי mKate2 (קווים ירוקים וברים), או נגוע CAT מיקוד שליטה phagemid (קווים כחולים וברים). (א) מטופל E. coli גדל לצפיפויות רוויות גבוהות יותר, מה שמעיד על עלות מטבולית לזיהום הפאג. קווים מקווקווים מצביעים סטיית התקן של 3 חזרות. (ב) אות mKate2 הופחתה לרמות רקע הקרובות-mKate2 אנטי מטופלים ניטלים, אך לא זנים שליטים. (C) GFP הקרינה, גם נישאה על ידי phagemid, לא הורגשה רק שולט phagemid שטופל. (D, E) קריאות קרינה סופיות לאחר 24 שעות של צמיחה היו מנורמלות OD. אות ה- GFP, המציין זיהום phagemid, נעדר שולטת ללא טיפול, אלא גם הקטינה באופן משמעותי בעקבות p אנטי-CATטיפול hagemid. הדבר עשוי להעיד על השפעות חוץ-היעד של phagemid. אות mKate2 הופחתה טיפול phagemid אנטי mKate2 בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה. Phagemid השליטה במיקוד CAT לא הראתה כל השפעה על קרינת mKate2. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן של 3 חזרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מציאה של CAT משחזר רגישות Chloramphenicol לאוכלוסייה גנטית עמידה א. coli MG1655 K12 להביע גן CAT משולב כרומוזומלית נותר ללא טיפול (מוטות אדומות), שטופל phagemid מלא מיקוד mKate2 (פסים ירוקים), או שטופל phagemid בעת-CAT אנטי Srna (סורגים כחולים). אחרי שעת 1 של זיהום, כדאיות על הנמלה הצביעהibiotics הוערכה על ידי דילולים ציפוי סדרתי. זנים שטופלו phagemid אנטי-CAT נהרגו משמעותי (> 90%) על ידי chloramphenicol בריכוזים גבוהים, בעוד טיפולים מלאים לא הושפעו. הוספת אמפיצילין אל צלחות התרבות בוחר באופן חיובי עבור זיהום phagemid ומונע תאים נגועים. בתנאים אלה, אין מושבות עמידות chloramphenicol נצפו לאחר טיפול אנטי-CAT. זה מצביע על כך שרוב ניצולי מייצגי כישלון של זיהום, ולא כשל של השתקה. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של 3 חזרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| רצף יעד CAT | 5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3' |
| רצף GUIDE CAT | 5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3' |
טבלת 1:. דוגמא TARGET ומדריך רצף עבור CAT ג'ין הערת היחסים השלמים ההפוכים.
| אמרגן PR | TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC | ||||
| רצף GUIDE | ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT | ||||
| תחום מחייב Hfq | TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG | ||||
| T1 / Terminator TE | CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA | ||||
ether.within-page = "1"> טבלה 2:. רכיבי רצף של קלטת Srna כל רצף כתוב 5'-3 '. הקלטת המלאה היא השרשור של 4 אלמנטים אלה כדי וכוללת 292 נ"ב.
| פריימר קדימה | 5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [מדריך] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3' |
| פריימר הפוך | 5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3' |
טבלה 3: פריימר עיצוב לאלטר אלמנטי GUIDE קיימים פריימר קדימה כולל את 20 נ"ב האחרונים של אמרגן PR, רצף המדריך החדש, ואת נ"ב 18 הראשונים של התחום מחייב Hfq.. רצף היעד הוא משלים ההפוך המדויק של רצף GUIDE. פריימר ההפוכה הוא משלים הפוך המדויק של פריימר קדימה.
לוח 4: מוצע תנאים לסינגל-פריימר מוטגנים PCR.
| שָׁלָב | Temp | זְמַן |
| denaturation הראשונית | 98 ° C | 30 שניות |
| 30 מחזורים | 98 ° C | 10 שניות |
| 55 ° C | 30 שניות | |
| 72 ° C | 120 שניות | |
| רחבה סופית | 72 ° C | 300 שניות |
| אִחסוּן | 10 ° C |
לוח 5: מוצע thermocycler פרוטוקול עבור יחיד פריימר מוטגנים PCR.
| רְכִיב | כֶּרֶך |
| DNA תבנית | 1 μl |
| פריימר 10 מיקרומטר קדימה | 0.5 μl |
| פריימר 10 מיקרומטר הפוך | 0.5 μl |
| מערבבים תקי 2X מאסטר | 25 μl |
| wate nuclease ללאr | 23 μl |
| נפח כולל | 50 μl |
לוח 6: מוצע תנאים עבור PCR אימות הרצף.
| שָׁלָב | Temp | זְמַן |
| denaturation הראשונית | 95 ° C | 30 שניות |
| 30 מחזורים | 95 ° C | 30 שניות |
| 55 ° C | 30 שניות | |
| 68 ° C | 30 שניות | |
| רחבה סופית | 68 ° C | 300 שניות |
| אִחסוּן | 10 ° C |
לוח 7: מוצע thermocycler Protocol עבור PCR אימות הרצף.
Discussion
השיטה הנוכחית השיגה 80 הפחתת% ברמות קרינת mKate בהשוואה לקבוצת ביקורת לא ממוקדת. זו עולה בקנה אחד עם שיטות מציאה RNA אחרים, שבהם השתקה מוחלטת לא נצפו ויעילות 50-90% אופייני 16,17. ברמת פנוטיפי, knockdowns במיקוד CAT הצליח להחליש התנגדות chloramphenicol משמעותית, ולחסל אותו בתנאים מסוימים.
פנוטיפ המציאה לא הורגש ברמת האוכלוסייה רק לאחר כמה שעות לאחר הדבקה (איור 3 ב). זה ממחיש תכונה חשובה של משלוח מבוסס הפאג: תדר מציאה גבוה ניתן להשיג ישירות בתרבות תצווה ללא הנדסה גנטית מוקדמת. בניגוד שינויים גנטיים קונבנציונליים באמצעות טרנספורמציה פלסמיד או אינטגרציה הגנומי, זיהום הפאג אינו מחייב כי אוכלוסייה מחדש גדלה ממושבה אחת מבודדת. זה מאפשר את ההשפעות של זיהום הפאג להיות Explored באוכלוסיות עם דינמיקה מרחבית מורכבת 11, עם מבנים מרחביים קיימים כמו biofilms 18, או באוכלוסיות טבעיות מעורבות גנטי 19.
שלב קריטי שיטה זו הוא ייצור של phagemid ארוז ב כייל גבוה. נטל מטבוליות הקשורות ייצור החלקיקים הפאג עלול להוביל שיעור גבוה של מוטציה או הפסד פלסמיד ב זן הייצור phagemid. מומלץ כי זן ייצור phagemid להיות מתורבת ישירות ממושבת cotransformed יחידה ולא בקירור, קפוא או תת תרבות לפני הקציר הפאג. יעילות נמוכה של שינוי שיתוף יכול להיות גם ציין בעת השקת הפלסמיד phagemid ועוזרו כדי E. coli זמנית. במקרה זה, יעילות גבוהה יותר ניתן לקבל על ידי הפיכת פלסמיד עזר הראשונה, ולאחר מכן הכנת תאים מוסמכים הנושאת את הפלסמיד עוזר לטרנספורמציה הבא עם phagemid.
Phaזיהום gemid או ביטוי Srna גם מטיל עומס מטבולים לזיהוי על תאי המטרה, ועלול לגרום לכך שחלק הפרעות פנוטיפי. לדוגמא, צמצום קרינת mKate2 נצפה גם כאשר תאים נדבקו עם CAT מיקוד phagemid (איור 3). זיהום עם M13 ככל הנראה אינו לעורר תגובות לחץ מערכתיות ב E. 20 coli, אך הוא עשוי לשנות את דפוסי תעתיק בעקיפין. לחילופין, סמנים GFP או התנגדות אמפיצילין כלל על phagemid עשויים להתחרות על משאבים הסלולר, הפחתת mKate2 ביטוי וצמיחה 9. לבסוף, קלטת Srna עצמו עשויה גלובלי לשנות פרופילי ביטוי גנים על ידי titrating חלבון Hfq, או באמצעות השתקת mRNA מחוץ יעד. תופעות יעד כבויות נפוצות in vivo RNAi מיקוד 21-23, אבל הם עדיין צריכים להיחקר באופן שיטתי עבור מערכת זו.
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי אפי זיהוםciency הוא פחות מ -100%, המאפשר כמה חיידקים שאינם נגועים להתמיד האוכלוסייה. את התוצאות של העבודה הזאת קודם לכן העבודה 10 מראים כי תאי noninfected לייצג 1-10% מהאוכלוסייה הסופי, וכן הם אחראים ביותר של פנוטיפים nonsilenced ציין. מגוון מסלולים-התנגדות M13 ידוע, עם אובדן מוטציוני להיות הנפוץ ביותר של ביטוי pilus 24. לאור המגבלות הללו, שולטים יש להשתמש כדי לאמת את שערי זיהום גבוהים ויעילות מציאה.
הגבלת פוטנציאל נוספת עבור יישומים מסוימים היא העברת המזדמנים של זיהום הפאג עוזר. למרות M13K07 מכיל אות אריזת מוטציה, זה יכול להיות ארוז לתוך קפסיד הפאג בתדירות נמוכה והועבר אוכלוסיות נגועות, וכתוצאה מכך תאים מוסמכים לייצור הפאג והתפשטות משך הפאג מעבר לאירוע הזיהום הראשוני 25. עשיית שינויים הפאג עוזר הוכיחו יעילותלצמצם אריזה ספציפית, אם כי לפעמים על חשבון ייצור הפאג מופחת 26.
בקטריופאג מהונדסים הפכו לכלי הכרחי עבור E. ביולוגיה סינתטית coli, המאפשר אספקה מהירה של גנים חדשים הגידול באוכלוסייה. מחקר שנערך לאחרונה הפיק מעגלים תקשורת בין תאית 11 או הביעו גורמי שעתוק לדכא עמידות לאנטיביוטיקה מסלולים 27. הפרוטוקול המובא כאן מוסיף אוסף גדל והולך של כלים המאפשרים שליטת פיזיולוגית חיידקים באמצעות RNAs המתוכנת. Nucleases CRISPR-קאש, כאשר מוטציה לחסל פעילות nuclease, הוכחו להדחיק שעתוק לעבר מטרות הגן מונחה RNA 17,28. לעומת זאת, השתקת Srna עובדת ברמת translational ואינה דורשת ביטוי חלבון אקסוגני. ביוטכנולוגיות הדור הבא עשויה להתאחד מלאת translational ו תעתיק עם משלוח בתיווך הפאג לתכנת pheno מורכבסוגים בזמן אמת.
Acknowledgments
מימון עבור עבודה זו סופק על ידי Fondation בטנקור שולר בתמיכה של צוות פריז בטנקור iGEM. אנו מודים ביחידת המחקר U1001 INSERM ושנטל Lotton לקבלת סיוע טכני וייעוץ. Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP סופק על ידי מוניקה אורטיז דרו Endy של סטנפורד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
| M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
| DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
| LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
| Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
| Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G |
References
- Ohkumo, T., Masutani, C., Eki, T., Hanaoka, F.
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. J Vis Exp. (50), e2477 (2011).
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2 (9), 2245-2264 (2007).
- Tsong, T. Y.
- Kim, W. J., Chang, C. -W., Lee, M., Kim, S. W. Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy. J Control Release. 118 (3), 357-363 (2007).
- Shi, Y.
- Na, D., Yoo, S. M., Chung, H., Park, H., Park, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs. Nat Biotechnol. 31 (2), 170-174 (2013).
- Ceroni, F., Algar, R., Stan, G. -B., Ellis, T. Quantifying cellular capacity identifies gene expression designs with reduced burden. Nat Methods. 12 (5), 415-418 (2015).
- Libis, V. K., Bernheim, A. G., et al. Silencing of Antibiotic Resistance in E. coli with Engineered Phage Bearing Small Regulatory RNAs. ACS Synth Biol. 3 (12), 1003-1006 (2014).
- Ortiz, M. E., Endy, D. Engineered cell-cell communication via DNA messaging. J Biol Eng. 6 (1), 16 (2012).
- Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnol. 9 (1), 61 (2009).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Recombinant DNA Part I. , 621-627 (1993).
- Phornphisutthimas, S., Thamchaipenet, A., Panijpan, B.
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat Rev Genet. 5 (5), 355-365 (2004).
- Qi, L. S., Larson, M. H., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Lu, T. K., Collins, J. J. Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (27), 11197-11202 (2007).
- Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (23), 7267-7272 (2015).
- Karlsson, F., Malmborg-Hager, A. -C., Albrekt, A. -S., Borrebaeck, C. A. K. Genome-wide comparison of phage M13-infected vs. uninfected Escherichia coli. Can J Microbiol. 51 (1), 29-35 (2005).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Caveat of RNAi in plants: the off-target effect. Methods in molecular biology. 744, Clifton, N.J. 13-25 (2011).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 57-67 (2010).
- Cho, S. W., Kim, S., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Hagens, S., Blasi, U. Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study. Lett Appl Microbiol. 37 (4), 318-323 (2003).
- Kasman, L. M., Kasman, A., Westwater, C., Dolan, J., Schmidt, M. G., Norris, J. S. Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy. J Virol. 76 (11), 5557-5564 (2002).
- Chasteen, L., Ayriss, J., Pavlik, P., Bradbury, A. R. M. Eliminating helper phage from phage display. Nucleic Acids Res. 34 (21), e145 (2006).
- Lu, T. K., Collins, J. J. Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4629-4634 (2009).
- Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., Marraffini, L. A. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7429-7437 (2013).
