Summary
ويستخدم صبغة ratiometric الحساسة درجة الحموضة في تركيبة مع متحد البؤر المجهر الليزر وتحليل الصور الرقمية لمراقبة درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان في الوقت الحقيقي.
Abstract
درجة الحموضة في الأغشية الحيوية البكتيرية على الأسنان ذات أهمية مركزية لتسوس الأسنان، وأمراض التي يتفشى في جميع أنحاء العالم. لا يتم توزيع المواد الغذائية ونواتج الأيض بالتساوي في الأغشية الحيوية الأسنان. وتفاعل معقد بين الامتصاص لوتفاعله مع المواد العضوية في بيوفيلم يقلل من طرق انتشار المواد المذابة ويخلق تدرجات حادة من الجزيئات المتفاعلة، بما في ذلك الأحماض العضوية، عبر بيوفيلم. طرق المجهرية الفلورسنت الكمية، مثل التصوير في الوقت حياة مضان أو ratiometry درجة الحموضة، ويمكن استخدامها لتصور درجة الحموضة في microenvironments مختلفة من الأغشية الحيوية الأسنان. درجة الحموضة ratiometry يستغل تحول تعتمد على درجة الحموضة في انبعاث الفلورسنت الأصباغ الحساسة درجة الحموضة. حساب نسبة الانبعاثات في اثنين من أطوال موجية مختلفة يسمح بتحديد درجة الحموضة المحلية في الصور المجهرية، بغض النظر عن تركيز الصبغة. وخلافا للالميكروية تقنية تتيح رصد كل التدرجات درجة الحموضة الرأسي والأفقي في الوقت الحقيقي معإزعاج من ميكانيكيا بيوفيلم. ومع ذلك، يجب الحرص على التفريق بدقة بين المقصورات من خارج وداخل الخلايا من بيوفيلم. هنا، وصبغ ratiometric، seminaphthorhodafluor-4F 5- (و6) حمض الكربوكسيلية (C-SNARF-4) يعمل على رصد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الجسم الحي في الأغشية الحيوية الأسنان نمت من تكوين الأنواع غير معروف. عند التعرض إلى جلوكوز الصبغة متروك المركزة داخل كل الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية. وبالتالي استخدامه على حد سواء باعتبارها وصمة عار البكتيرية العالمية وكعلامة من الرقم الهيدروجيني خارج الخلية. بعد متحد البؤر الحصول على الصور المجهرية، تتم إزالة الكتلة الحيوية البكتيرية من كل الصور باستخدام برمجيات تحليل الصور الرقمية، والذي يسمح لحساب حصرا الرقم الهيدروجيني خارج الخلية. درجة الحموضة ratiometry مع الصبغة ratiometric هي مناسبة تماما لدراسة درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية رقيقة تصل إلى 75 ميكرون سمك، ولكن يقتصر على مجموعة ودرجة الحموضة بين 4.5 و 7.0.
Introduction
الطريقة الموصوفة هنا يسمح برصد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان في نطاق بين 4.5 و 7، وذلك باستخدام الصبغة ratiometric seminaphthorhodafluor-4F 5- (و6) حمض الكربوكسيلية (C-SNARF-4) في تركيبة مع متحد البؤر المجهر الليزر و تحليل الصور الرقمية. صبغة الفلورسنت العاملين هو الرقم الهيدروجيني الحساسة ويعرض تحولا في الانبعاثات الفلورسنت اعتمادا على حالة بروتوناتيون. انبعاث الفلورسنت من قمم جزيء البروتونية في 580 نانومتر، وانبعاث جزيء deprotonated في 640 نانومتر 1. نسبة كثافة الانبعاثات الفلورسنت في إطارين الكشف تضم قمم الانبعاثات اثنين (576-608 نانومتر، و629-661 نانومتر) مما يعكس درجة الحموضة في الطور السائل، بغض النظر عن تركيز الصبغة. مع وPK من ~ 6.4 الصبغة هو مناسب لتصور درجة الحموضة في البيئات الحمضية باعتدال.
PH في الأغشية الحيوية البكتيرية له أهمية مركزية لجميع عمليات التمثيل الغذائي.في حالة الأغشية الحيوية الأسنان، ودرجة الحموضة في المصفوفة خارج الخلية هو عامل الفوعة رئيسيا لتطوير تسوس الأسنان. فترات طويلة مع انخفاض الرقم الهيدروجيني في واجهة الصدارة بيوفيلم الأسنان لإبطاء التنقية من المينا الأساسي 2. ويرجع ذلك إلى بنية ثلاثية الأبعاد معقدة من الأغشية الحيوية، الأيض، بما في ذلك الأحماض العضوية، ليست موزعة بشكل موحد في جميع أنحاء بيوفيلم. ويمكن الاطلاع على غاية وأقل microenvironments مولد الحموضة في القرب المكاني 3.
على مدى عقود، وسجلت التدرجات درجة الحموضة العمودية في الأغشية الحيوية بمساعدة الميكروية 4-6. في حين أنها توفر دقة مكانية جيدة نظرا لحجم رأس صغير، وأنها ليست مناسبة تماما لمراقبة التدرجات الأفقية. وعلاوة على ذلك، الإدراج من القطب يزعج بيوفيلم ميكانيكيا. الكمية التقنيات المجهرية الفلورسنت توفر ميزة تصور التغييرات درجة الحموضة في مناطق مختلفة من بيوفيلم دون الميكانيكية التدخلالامتحانات التنافسية الوطنية. الحقول المجهرية نظر مختلفة يمكن اختيار بحرية وتصوير مرارا وتكرارا على مدى فترات طويلة 1،7-9. ومع ذلك، عند تفسير الصور بيوفيلم المجهرية، فمن المهم أن نميز بين مضان المستمدة من الكتلة الحيوية الميكروبية ومضان المستمدة من الفضاء خارج الخلية. في الظروف الحمضية، ودرجة الحموضة داخل الخلايا البكتيرية مختلفة من درجة الحموضة في المصفوفة خارج الخلية، حيث أن البكتيريا نقل بنشاط البروتونات عبر غشاء الخلية على حساب من أدينوسين ثلاثي الفوسفات 10. في سياق تسوس الأسنان، وليس لديها درجة الحموضة البكتيرية بين الخلايا لها تأثير مباشر على المينا الكامنة في حين انخفاض الرقم الهيدروجيني خارج الخلية يؤدي إلى التنقيه. بلغ متوسط درجة الحموضة في الصور المجهرية التي تحتوي على كل مناطق خالية من البكتيريا والجراثيم يؤدي إلى نتائج خاطئة. استخدام بقع أخرى جنبا إلى جنب مع صبغة حساسة درجة الحموضة من أجل رؤية الكتلة الحيوية البكتيرية والتفريق بين المناطق الخارجة عن والخلايا يجلب أبمن خطر التلوث الفلورسنت من الفضاء خارج الخلية والقياسات الخاطئة 11.
لذا يصف المخطوطة الحالية على استخدام الصبغة ratiometric في وظيفة مزدوجة؛ على حد سواء باعتبارها علامة درجة الحموضة وباعتباره وصمة عار البكتيرية العالمية. كما أن الصبغة هي يصل تتركز في الخلايا البكتيرية، والجمع بين التصوير المجهري متحد البؤر وإجراء تحليل الصور الرقمية دقيق يسمح تحديد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في نطاق بين 4.5 و 7.0 في الأغشية الحيوية الأسنان رقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض البروتوكول التجريبي التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات من مقاطعة آرهوس (M-20100032).
1. متحد البؤر مجهرية معايرة Ratiometric صبغ
- لاقتناء الصور، استخدام مجهر مقلوب مبائر مجهزة حاضنة، هدفا الغمر بالماء فتحة 63X / 1.2 الرقمية، خط ليزر 543 نانومتر، وكاشف ميتا.
- إعداد HEPES العازلة الحلول الأسهم (50 ملي، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 4،5-8،5 في خطوات وحدات 0.1 درجة الحموضة). ماصة 100 ميكرولتر من كل حل في آبار واضحة القاع لوحة 96-جيدا للفحص المجهري الفلورسنت.
- ارتداء قفازات النتريل عند التعامل مع الصبغة ratiometric C-SNARF-4. إعداد 1 ملم حل سهم الصبغة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل. إضافة 5 ميكرولتر من محلول المخزون إلى كل بئر مع العازلة HEPES. وضع لوحة 96 جيدا على المجهر.
- تشغيل المجهر. فتح البرنامج المجهر. انقر على اللوحات التالية: الحصول → الليزر. الحصول → Micro. اكتساب التكوين →. الحصول → مسح. الحصول → المرحلة. الاحماء الحاضنة إلى 37 درجة مئوية.
- تشغيل خط ليزر 543 نانومتر من خلال النقر على الليزر نانومتر 543 و"على" زر في إطار "مكافحة الليزر". اختيار الهدف الغمر بالماء فتحة 63X / 1.2 الرقمية في إطار "مكافحة مجهر".
- تعيين كاشف ميتا لمراقبة مضان في وقت واحد داخل 576- إلى 608 نانومتر (الأخضر)، و629- 661 نانومتر (الأحمر) فترات ( "تحكم تكوين" → "كلية العلوم الصحية"). ضبط قوة الليزر ( "تحكم تكوين" → "الإثارة"). تعيين الثقب أن يؤديا إلى شريحة سمك البصرية من 1.6 ميكرون ( "التحكم تفحص" → "الثقب").
- الحصول على صورة من كل حل العازلة HEPES، 5 ميكرون فوق الجزء السفلي من الزجاج لوحة 96-جيدا. ملاحظة: بمجرد يقع الطائرة التركيز تحت أسفل الزجاج، لا ضوء الفلورسنت يمكن أن ينظر إليهعلى الشاشة. بعد كل صورة ثالثة، تعيين قوة الليزر إلى الصفر وأخذ صورة للخلفية الطرح.
- إجراء تجربة المعايرة في ثلاث نسخ (1،2-1،7).
- تحديد متوسط كثافة الفلورسنت والانحراف المعياري في جميع الصور الحمراء والخضراء.
- حساب نسبة R والخطأ المعياري للمتوسط، S R، عن كل صورة وفقا لمعادلات (1) و (2)
(1)
(2)
ز، ص، ق ز وق ص هي المتوسطات والانحرافات المعيارية في الصور الخضراء والحمراء منها. ب ز، ب ص، ق حرس الحدود وق ر هي القيم المقابلة للصور الخلفية. ن - رسم نسب تحسب لكل قيمة الرقم الهيدروجيني من ثلاث تجارب تكرار المعايرة في رسم تخطيطي وبناء منحنى المجهزة من هذه السلسلة من نقاط البيانات (أي باستخدام برنامج SigmaPlot 13). جعل وظيفة رياضية من منحنى المجهزة التي يمكن تحويل نسب إلى قيم الرقم الهيدروجيني 10.
- حساب نسبة R والخطأ المعياري للمتوسط، S R، عن كل صورة وفقا لمعادلات (1) و (2)
2. جمع في الموقع نمت عينات بيوفيلم الأسنان
- اختيار المتطوعين التي تلبي معايير التضمين والاستثناء ذات الصلة لهذه الدراسة. جعل الانطباعات الجينات من قوس الأسنان العلوية والسفلية الخاصة بهم. جعل نماذج المدلى بها من هذه الانطباعات وتصنيع جبيرة الاكريليك في الفك السفلي. تصميم جبيرة مع الشفاه الاكريليك الشدق متصلة بواسطة سلك تقويم الأسنان اللغات التي تسمح للمتطوعين لدغة إلى انسداد الطبيعي 12.
- الركود الحفر في الشفاه الشدق من جبيرة الاكريليك (الشكل 1
- لجمع بيوفيلم، استخدام ألواح مصنوعة خصيصا غير الفلورسنت الزجاج (4 × 4 × 1 مم 3) مع خشونة سطح حصى 1200 من أجل تقليد نمط الاستعمار على المينا الطبيعي 11.
- تعقيم ألواح الزجاج عن طريق التعقيم قبل التركيب. تركيب ألواح زجاجية مع الشمع لزجة في المنخفضات في الشفاه الشدق من كل جانب راحة قليلا على سطح سطح الاكريليك من أجل حماية بيوفيلم من قوى القص التي تنقل الخدين 11 المبذولة.
ملاحظة: قد تختلف عدد من ألواح الزجاج وضعت في حالة ركود بين 3 و 14، وهذا يتوقف على الهدف من هذه الدراسة. - إدراج الجهاز في الفم من المتطوعين. إرشاد volunطير إلى الإبقاء على الأجهزة داخل الفم طوال الفترة التجريبية. تكليف المتطوعين لتخزين الأجهزة في وعاء التجنيب تقويم الأسنان بقطعة من المناديل الورقية المبللة (لإبقائها رطبة) في درجة حرارة الغرفة خلال السواك وتناول الطعام والمشروبات غير الماء. تكليف المتطوعين لعدم لمس الشفاه الاكريليك الشدق مع ألواح الزجاج في حين وضع وإزالة الأجهزة.
ملاحظة: قد تختلف الفترة التجريبية حسب الهدف من هذه الدراسة (يوم واحد إلى عدة أسابيع). - بعناية إزالة ألواح الزجاج من الأجهزة في نهاية الفترة التجريبية. إزالة الشمع لزجة حول ألواح بسكين ونقلها مع زوج من ملاقط لحاوية مغلقة، بيوفيلم التي تواجه التصاعدي، وحتى التحليل المجهري. إبقاء الحاويات رطبة مع المناديل الورقية المبللة. أداء التصوير ودرجة الحموضة في غضون ساعات قليلة بعد جمع بيوفيلم.
3. بيوفيلم درجة الحموضة التصوير
- إعدادحل اللعاب عن طريق إضافة dithiothreitol إلى اللعاب التي تم جمعها وفقا لطريقة دي يونج وآخرون. 13. عاير الحل اللعابية لدرجة الحموضة 7.0 وإضافة الجلوكوز إلى تركيز 0.4٪ (وزن / المجلد). ماصة 100 ميكرولتر في بيوفيلم ليتم تحليلها في لوحة 96-جيدا الزجاج السفلي للفحص المجهري. إضافة 5 ميكرولتر من صبغ ratiometric لكل بئر.
- وضع لوحة 96 جيدا على المسرح المجهر. بدوره على المجهر وخط ليزر 543 نانومتر. الاحماء الحاضنة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الإعدادات المجهر نفس لمعايرة الصبغة (انظر الخطوات 1،5-1،6). الانتظار لمدة 30 دقيقة، حتى وصلت الى لوحة 96-جيدا درجة حرارة العمل.
- اختيار واحد أو أكثر من ألواح الزجاج مع مجموعة ضئيلة من ملاقط ووضعها في الآبار المليئة اللعاب، لوح واحد لكل بئر، مع الأغشية الحيوية أسفل.
- الحصول على صور واحدة ( "التحكم تفحص" → "واحدة") أو ض مداخن ( "التحكم تفحص" → "بدء") spanniنانوغرام عمق الأغشية الحيوية في مختلف المجالات. للحصول على زي رزمة اختيار عدد من شرائح إلى أن تصوير ( "التحكم تفحص" → "Z إعدادات" → "شرائح ارقام") ومارك ض الموقف للمرة الأولى وشريحة مشاركة في البرنامج المجهر ( "السيطرة على المسح الضوئي "→" Z إعدادات "→" مارك أولا "،" مارك آخر ").
ملاحظة: Z-مداخن وعلى عمق يصل إلى 75 ميكرون يمكن الحصول عليها مع النقيض جيدة بين المناطق خارج الخلية والخلايا. - لمتابعة التغيرات ودرجة الحموضة في حقل المجهري للعرض على مر الزمن، بمناسبة موقف س ص في البرنامج المجهر ( "المرحلة وتركيز الرقابة" → "كافة نقاط البيع") وأخذ الصور المتكررة في نقاط زمنية متتالية ( "التحكم تفحص" → " وحيد"). بانتظام التقاط صور مع قوة الليزر تعيين إلى صفر لخلفية الطرح.
4. تحليل الصور الرقمية
- إلى المعرضغ الصور المجهرية كملفات TIF، واستخدام تصدير ملف دفعة من البرنامج المجهر ( "ماكرو" → "دفعة تصدير ملف"). بمناسبة الملفات المراد تصديرها وحفظ الصور القناة الحمراء والخضراء في مجلدات منفصلة كما TIF ملفات ( "ابدأ دفعة تصدير"). إعادة تسمية الملفات في كلا المجلدين منحهم أرقام تسلسلية.
- استيراد الحمراء والخضراء سلسلة صورة في صناعة البرمجيات مثل daime (تحليل الصور الرقمية في البيئة الميكروبية) 14. شريحة الصور قناة خضراء مع عتبات اختيار فردي سطوع (الجزء → التلقائية تجزئة → عتبة مخصص). اختيار عتبات سطوع بعناية (عادة ما بين 20 و 80)، بحيث، ولكن لن يتم تسجيل جميع البكتيريا (أكثر إشراقا من المصفوفة خارج الخلية) مصفوفة ككائنات خلال تجزئة. التحقق بصريا أن المناطق المعترف بها ككائنات تتوافق بشكل جيد مع الكتلة الحيوية البكتيرية.
- نقل طبقة الهدف من ز مجزأةصور reen قناة إلى صور القناة الحمراء المقابلة (الجزء → طبقة كائن نقل). استخدام الكائن وظيفة محرر لرفض وحذف كافة الكائنات في الصور القناة الحمراء والخضراء. الآن لم يبق سوى المصفوفة خارج الخلية في الصور بيوفيلم. تصدير صورة سلسلة معالجتها كملفات TIF.
- استيراد سلسلة الصورة في يماغيج (http://rsb.info.nih.gov/ij، v.1.47). تحديد متوسط كثافة مضان في خلفية الصور التي اتخذت مع الليزر إيقاف تشغيل (تحليل → الرسم البياني). طرح الخلفية المناسبة من الصور الحمراء والخضراء (عملية → الرياضيات → إطرح).
- لا يزال في ImageJ، تقسيم الصورة الخضراء سلسلة (G1) في حد ذاته (عملية → صورة آلة حاسبة). ثم ضرب سلسلة الصورة الناتجة (G2) مع سلسلة صورة خضراء (G1). هذا وسوف تسفر عن سلسلة صورة (G3)، حيث يتم تعيين نان لجميع بكسل ينتمون إلى المناطق التي تم الاعتراف بها الكائنات في daime. المضي قدما في تيانه بنفس الطريقة مع سلسلة صورة الحمراء (R1 / R1 = R2، R2 س R1 = R3).
ملاحظة: كما تم إزالة الكتلة الحيوية البكتيرية من الصور في خطوة 4.3، وشدة الفلورسنت 0 في هذه المجالات. خطوة 4.5 ضرورية لتحويل القيمة من 0 إلى نان، والذي يسمح لحساب النسبة في خطوة 4.6. - تطبيق "يعني" تصفية (عملية → مرشحات → المتوسط، نصف قطرها: 1 بكسل) للتعويض عن الضوضاء كاشف. تقسيم صورة سلسلة الخضراء سلسلة صورة الحمراء (عملية → صورة آلة حاسبة). وهذا يؤدي إلى نسبة / أحمر أخضر لكل بكسل المتبقية في الفضاء خارج الخلية من الصور. استخدام التلوين كاذبة عن التمثيل البياني للنسب في الصور (الجداول صورة → بحث). حساب نسبة متوسط لكل صورة (تحليل → الرسم البياني).
- تحويل نسب خضراء / حمراء للقيم الرقم الهيدروجيني وفقا للوظيفة تركيبها تحت 1.9.2). ملاحظة: يمكن رؤية مثال لبيانات المعايرة ومنحنى المجهزة في Schlafer وآخرونآل، 2015 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح الطريقة المعروضة مراقبة خارج الخلية درجة الحموضة قطرات في microenvironments مختلفة من الأغشية الحيوية الأسنان في نطاق درجة الحموضة 4،5-7 في الوقت الحقيقي. إذا تم اختيار الظروف التجريبية كما هو موضح أعلاه، يبدأ الرقم الهيدروجيني إلى إسقاط في جميع المجالات من الأغشية الحيوية بعد فترة وجيزة من التعرض إلى جلوكوز.
عندما تنخفض درجة الحموضة في بيوفيلم، الخلايا البكتيرية تصبح مرئية في غضون فترة زمنية قصيرة (<1 دقيقة)، كما هو upconcentrated الصبغة ratiometric في الخلايا (الشكل 2A). في البداية، قبل إنتاج حامض في بدايات بيوفيلم، لا فرق يمكن أن ينظر إليه بين الخلفية والخلايا. صور المصدرة في daime البرمجيات يجب أن تكون مجزأة مع عتبات سطوع اختيار فردي من أجل الحصول على التطابق الجيد بين الكتلة الحيوية البكتيرية في الصور والكائنات معترف بها من قبل برنامج (الشكل 2B). إذا مجزأة appropri¢ الأمر، حذف الكائنات في daime يزيل كل الإشارات الفلورسنت التي تنبع من الخلايا البكتيرية (الشكل 2C). معالجة الصور لاحقا في ImageJ النتائج في نسب خضراء / حمراء لبكسل في الفضاء خارج الخلية من الصور. مع مساعدة من منحنى المعايرة وهذه النسب يمكن تحويلها إلى قيم الرقم الهيدروجيني وتصور مع التلوين كاذبة عن التمثيل البياني (الشكل 2D). ويمكن حساب متوسط درجة الحموضة لكل من الصور ومعالجتها، ويمكن أن يتبع تطور درجة الحموضة على مر الزمن (الشكل 2E). قد تختلف قطرات درجة الحموضة بين الحقول المجهرية نظر مختلفة، ويمكن رصد أفقيا ورأسيا التدرجات درجة الحموضة. ومع ذلك، في ظل ظروف ثابتة، داخل الأغشية الحيوية رقيقة، طفيفة فقط التدرجات درجة الحموضة العمودية يمكن ملاحظتها.
في بعض الحالات، الحقل المجهري بأكمله نظر قد تكون مغطاة الخلايا البكتيرية مما يجعل حساب خارج الخليةدرجة الحموضة المستحيل (الشكل 3A). قد يكون حل المشكلة عن طريق اختيار طائرة التركيز مختلفة قليلا. يجب الحرص على عدم مفرط، الصور المجهرية، لأن الكتلة الحيوية البكتيرية في الصور ثم يغطي مساحة أكبر مما كانت عليه في الواقع (الشكل 3B). عندما بتجزئة الصورة في daime لا بد من اختيار عتبات سطوع التي تعترف جميع الخلايا البكتيرية، وإذا كان موجودا، والخلايا الظهارية الإنسان (الشكل 3C) ككائنات. إذا يتم تجزئة خارجا مع عتبات سطوع عالية جدا، وسيتم إدراج المناطق داخل الخلايا في حساب الرقم الهيدروجيني، وتؤدي إلى نتائج خاطئة (الشكل 3D). رصد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية مع الصبغة ratiometric يقتصر باستخدام المجهر متحد البؤر. تصل إلى عمق الاختراق من 75 ميكرون، والمناطق الخارجة والخلايا يمكن تمييزها بشكل موثوق (الشكل 3E). لقياس درجة الحموضة التدرجات الرأسي في الأغشية الحيوية سمكا، لا تزال الميكروية والتقتهود في الاختيار.
الشكل 1: الاكريليك جبيرة لداخل الفم بيوفيلم مجموعة تم تصميم جبيرة مع الشفاه الاكريليك الشدق متصلة بواسطة سلك تقويم الأسنان اللغات التي تسمح للمتطوعين لدغة إلى انسداد الطبيعي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معالجة الصور لمجهرية قياس خارج الخلية بيوفيلم درجة الحموضة (A) متحد البؤر صورة مجهرية من بيوفيلم ملطخة الصبغة ratiometric، 9 دقيقة بعد التعرض للجلوكوز. الكتلة الحيوية البكتيرية في الصورة يمكن تمييزها عن خلفية الخلية. (B) نفس الصورة بعد تجزئة في daime. وقد اعترف الكتلة الحيوية البكتيرية بأكملها في مجال المجهري للرأي ككائنات خلال تجزئة، كما يدل على ذلك خطوط البرتقال. (ج) نفس الصورة بعد إزالة الكتلة الحيوية البكتيرية. تمت إزالة جميع مضان المستمدة من الخلايا البكتيرية، وتبقى مضان الوحيد المستمدة من المصفوفة خارج الخلية في الصورة. (د) التمثيل البياني الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في نفس المجال المجهري للعرض. وقد تم حساب نسب خضراء / حمراء في ImageJ، وتم تطبيق التلوين كاذبة عن التمثيل البياني الرقم الهيدروجيني خارج الخلية. متوسط الرقم الهيدروجيني خارج الخلية = 5.86. (م) مقياس الحانات = 20 ميكرون. (E) متوسط انخفاض درجة الحموضة في نفس المجال المجهري للعرض، مراقبة لمدة 15 دقيقة. انخفاض الرقم الهيدروجيني في هذا المجال من بيوفيلم هو الأسرع في البداية، بعد وقت قصير من التعرض للجلوكوز. ثم أنه يبطئ ولكن لا تصل إلى الاستقرار في غضون الوقت المراقبة.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس المجهري خارج الخلية بيوفيلم درجة الحموضة - المشاكل المحتملة والأخطاء (A) متحد البؤر صورة مجهرية من بيوفيلم كثيفة يتعرض إلى جلوكوز وملطخة الصبغة ratiometric. في هذا المجال المجهري للعرض، وتغطي كامل الصورة مع الخلايا البكتيرية، وسوف إزالة البكتيريا لا تترك مناطق خارج الخلية لحساب الرقم الهيدروجيني. (ب) تعرض مفرط للضوء صورة مجهرية متحد البؤر من بيوفيلم ملطخة الصبغة ratiometric. خلال تجزئة صورة من الصور تعريض يتم التعرف على مناطق أوسع من الواقع عن طريق البكتيريا مغطاة ككائنات وفقدت جزءا من الفضاء خارج الخلية لحساب الرقم الهيدروجيني. (C) Biofصورة ILM مع الخلايا الظهارية (السهام). عتبات السطوع للتجزئة الصورة يجب أن يتم اختيار، بحيث يتم التعرف على الخلايا الظهارية ككائنات وإزالتها من الصور قبل حساب الرقم الهيدروجيني. (د) نفس الصورة بيوفيلم كما في الشكل 1B، مجزأة مع عتبة سطوع خاطئة. لم يتم التعرف جزءا من الكتلة الحيوية البكتيرية أشياء لا يمكن إزالتها من الصورة. وهذا يؤدي إلى إدراج المناطق داخل الخلايا في حساب الرقم الهيدروجيني وبالتالي نتائج خاطئة. (E) طبقة عميقة من بيوفيلم ملطخة الصبغة ratiometric. وقد اكتسب صورة 90 ميكرون من واجهة بيوفيلم-التحتية. للخطر التمايز بين المناطق الخارجة عن والخلايا. الحانات النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مراقبة مجهرية من درجة الحموضة بيوفيلم يوفر العديد من المزايا، بالمقارنة مع القطب أو مسرى مكروي القياسات 4-6. تسمح التقنيات المجهرية لتحديد درجة الحموضة مع دقة مكانية عالية والسماح التقاط التدرجات درجة الحموضة أفقيا ورأسيا في الأغشية الحيوية من دون إزعاج بيوفيلم ميكانيكيا. وكانت محاولات سابقة لمراقبة درجة الحموضة المجهرية، ومع ذلك، فشلت في التفريق بين الرقم الهيدروجيني خارج الخلية والخلايا في الأغشية الحيوية 1،7،9. بسبب التوازن البكتيري، ودرجة الحموضة داخل الخلايا تختلف من درجة الحموضة خارج الخلية، والحسابات ودرجة الحموضة لا يمكن أن يكون صحيحا إذا وتساهم كل من المقصورات البينية وخارج الخلية إلى انبعاث الفلورسنت المسجلة. استخدام صبغة الفلورسنت الثاني جنبا إلى جنب مع صبغة حساسة درجة الحموضة إلى تصور الخلايا البكتيرية إشكالية، لأنه حتى تداخل صغير بين أطياف الانبعاثات من الأصباغ قد تعرض للخطر الكمي لضوء الفلورسنت. وبالتالي فإن أسلوب المقدمة هنايعتمد على التدرج تركيز الصبغة ratiometric بين المقصورات من خارج وداخل الخلايا من بيوفيلم لتحديد وبعد إزالة الخلايا البكتيرية من الصور الحموضة المكتسبة.
على تلطيخ مع صبغة الفلورسنت، الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية استيعاب ويصل تركيز جزيء، ولكن فقط في الظروف الحمضية. ولذلك فإن درجة الحموضة ratiometry مع الصبغة يقتصر على نطاق درجة الحموضة بين 4.5 و 7.0. في قيم درجة الحموضة أعلى من 7، وصبغ unprotonated وبالتالي تهمة لا تخترق الخلايا البكتيرية جيدا بما فيه الكفاية لتمييزها عن خلفية الخلية، وعلى قيم الرقم الهيدروجيني أقل من 4.5 أكثر من جزيئات الصبغة هي البروتونية وأي تغييرات أخرى في الانبعاثات الفلورسنت يمكن أن يكون لوحظ. منحنى المجهزة (الرقم الهيدروجيني مقابل نسبة أخضر / أحمر) هو أشد حول درجة الحموضة 6 ويسطح من نحو 4.5 درجة الحموضة. ويرد مثال في Schlafer وآخرون، 2015، الشكل S2 11 في الوقت الحاضر استخدام صبغة الفلورسنت لratiometry درجة الحموضة يقتصر علىمراقبة الرقم الهيدروجيني خارج الخلية 1. من حيث المبدأ، يمكن أيضا صبغ استخدامها لرصد الخلايا تغيرات درجة الحموضة البكتيرية، ولكن حتى الآن، لم يتم إجراء معايرة للاستخدام داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، فإنه سيكون من الصعب على التمييز بدقة بين الانبعاثات الفلورسنت داخل الخلايا والفلورسنت مستمد الضوء من جزيئات الصبغة المرفقة إلى خارج جدار الخلية البكتيرية. وعلاوة على ذلك، كما يستخدم تلطيخ مع الصبغة ratiometric في تركيبة مع الفحص المجهري متحد البؤر، الحصول على الصور في طبقات بيوفيلم أعمق من 75 ميكرون من واجهة الغطاء الزجاجي / بيوفيلم للخطر. تقليل التباين بين الخلايا البكتيرية والمصفوفة خارج الخلية يجعل التمايز بين داخل وخارج الخلية المناطق صعوبة. وقد تبين الصبغة ratiometric المستخدمة لتصور موثوق 15 الأنواع البكتيرية المرتبطة بيوفيلم الأسنان، والبقع جميع الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية الأسنان المزروعة في الموقع 11. في حين أنه من المرجح أنصبغ ratiometric هو وصمة عار البكتيرية العالمية، وهذا لم يتم حتى الآن أثبتت وصمة عار لا بد من اختبار على الأغشية الحيوية من الموائل الأخرى من تجويف الفم. هذه الطريقة لا تسمح لإنتاج مكررات التقنية لقياس درجة الحموضة معينة، كما يأخذ الحصول على الصور بعض الثواني وتغيير بيوفيلم درجة الحموضة بشكل حيوي. التصوير المتكرر للحلول عازلة خالية من بيوفيلم، ومع ذلك، والتصوير المتكررة من الأغشية الحيوية في المخزن أسفرت عن قيم درجة الحموضة مستقرة (لا تظهر البيانات).
يجب اتباع جميع الخطوات من الإجراء الموضح أعلاه لمعالجة الصور بدقة. يجب الحصول على الصور بيوفيلم مع الليزر كافيا السلطة / ربح للحصول على مستويات كافية من إشارة الفلورسنت في المصفوفة خارج الخلية، ولكن ينبغي تجنب التعرض المفرط للخلايا البكتيرية. إذا تم تعريض خلايا بكتيرية (قوة الليزر عالية جدا أو ربح) يتم التعرف على مناطق أوسع من الواقع عن طريق البكتيريا تغطيتها كما يتم فقدان الكائنات أثناء تقسيم الصورة وجزء من الفضاء خارج الخليةلحساب الرقم الهيدروجيني (انظر الشكل 3B). من ناحية أخرى، إذا تم الحصول على الصور مع منخفضة للغاية قوة الليزر / ربح، وكثافة الفلورسنت في الفضاء خارج الخلية قد لا يكون كافيا لحساب موثوق بها من نسب الانبعاثات أخضر / أحمر. يمكن استخدام أداة المؤشر متوسط في البرنامج المجهر لضبط إعدادات المجهر، بحيث يتم التقاط الخلايا البكتيرية مع الحد الأقصى لكثافة، ولكن من دون التعرض المفرط. يجب التحكم الآلي تجزئة الصورة لجميع الصور بيوفيلم للتأكد من أن جميع بكتيريا، وإذا كان موجودا، يتم التعرف على الخلايا حقيقية النواة ككائنات من قبل البرنامج. بعد تجزئة، ويجب مقارنة جميع الصور بيوفيلم واحدا تلو الآخر إلى الصور unsegmented المعنية للتأكد التطابق بين الكتلة الحيوية البكتيرية ومنطقة المعترف بها الكائنات. إذا يتم التعرف على مناطق أوسع من تلك التي تغطيها البكتيريا بأنها أجسام عتبة سطوع منخفضة جدا لتمييز دقيق، ويجب أن يؤديها تجزئة مع مرحباعتبة سطوع gher. إذا كان جزء من الكتلة الحيوية البكتيرية ليس بين الكائنات، لا بد من خفض عتبة سطوع أن تسفر عن التمايز الصحيح بين الفضاء خارج الخلية والخلايا. لتحليل مجموعات البيانات الكبيرة وقد ثبت فائدة لشريحة جميع الصور مع صف من عتبات سطوع مختلفة، وتحديد وقت لاحق العتبة المثالية لكل صورة. مرة واحدة يتم التوصل إلى تمييز الصحيح بين البكتيريا والمصفوفة خارج الخلية، ولا توجد مشاكل أخرى وينتظر أن تتم خلال معالجة الصور. ومع ذلك، قد يكون هناك بعض الصور مع بيوفيلم كثيفة جدا، حيث تغطي البكتيريا مجال المجهري بأكمله نظر. في هذه الصور، من الواضح، ودرجة الحموضة خارج الخلية لا يمكن تحديدها. في بعض الحالات يمكن حل المشكلة عن طريق الحصول على الصور في مختلف قليلا ض الطائرة، حيث لم الكتلة الحيوية البكتيرية تغطي كامل مجال الرؤية.
مزيد من الطلبات من ratiometry الرقم الهيدروجيني خارج الخلية قد يكون لدراسةالمناظر الطبيعية ودرجة الحموضة في المجتمعات الميكروبية أخرى من الأغشية الحيوية الأسنان (أي الأغشية الحيوية الزائفة الزنجارية أو الأغشية الحيوية البكتيرية الحالية المنتجة). يمكن تحديد تأثير عوامل بيئية مختلفة، مثل تركيز الأكسجين، وإمدادات الكربوهيدرات أو تطبيق تيار كهربائي على درجة الحموضة بيوفيلم. قد يكون التحقيق في تأثير سن بيوفيلم، سماكة بيوفيلم والنشاط الأيضي على درجة الحموضة، وكذلك تأثير درجة الحموضة تحوير كلاء على الأغشية الحيوية البكتيرية. هذا الأخير هو أهمية خاصة في سياق الأغشية الحيوية الأسنان، حيث تمثل عوامل التخزين المؤقت نهج علاجي واعد للسيطرة على تسوس الأسنان 15. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تركز البحوث المستقبلية لتطبيق طريقة عرض في ظل ظروف التدفق. حتى الآن وقد استخدم الرقم الهيدروجيني خارج الخلية ratiometry فقط لمراقبة درجة الحموضة في ظل ظروف ثابتة. ومن المرجح أن يكون لها تأثير كبير على تطوير microenvironments درجة الحموضة، وفي امدادات ثابتة من متوسطة الاوكسيجين جديدةمعينة، التدرجات درجة الحموضة العمودية داخل الأغشية الحيوية رقيقة. إزالة الأحماض عن طريق التدفق المتوسط قد تسهم في إنشاء التدرجات العمودية حتى في الأغشية الحيوية رقيقة جدا.
Ratiometric التصوير المجهري متحد البؤر مع الصبغة ratiometric C-SNARF-4 في تركيبة مع تحليل نتائج العمل الدقيق لتصاريح الصور الرقمية المكتسبة لحساب وتصور بيوفيلم درجة الحموضة في المصفوفة خارج الخلية، في الوقت الحقيقي، في نطاق درجة الحموضة بين 4.5 و 7.0 وتصل إلى سمك بيوفيلم من 75 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر خافيير غارسيا هاء ولين جرونكيار لتقديم المساعدة التقنية وMerete ك Raarup لإجراء مناقشات مثمرة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث جامعة آرهوس وسيمون جواسيس مؤسسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B.
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
