Summary
pH敏感比例染料以共聚焦激光扫描显微镜和数字图像分析结合用于监测实时牙科生物膜的细胞外pH值。
Abstract
牙齿上细菌生物膜的pH值是对于龋齿，具有高的全球流行的疾病至关重要。营养物和代谢物没有在牙科生物膜分布均匀。吸附并反应在生物膜有机物质之间复杂的相互作用降低了溶质的扩散路径，并创建活性分子的陡坡，包括有机酸，整个生物膜。定量荧光显微方法，例如荧光寿命成像或pH ratiometry，可以采用在牙科生物膜不同微环境可视化的pH值。 pH值ratiometry利用在pH敏感染料的荧光发射的pH依赖性移。在两个不同波长的发射的比例的计算允许确定在显微图像局部pH，不论染料的浓度。相反微电极的技术允许与监测实时垂直和水平的pH梯度出机械干扰生物膜。然而，必须小心以生物膜的细胞内外室之间准确区分。在这里，比例染料，seminaphthorhodafluor-4F 5-（和-6）羧酸（C-SNARF-4）被用来监测在未知物种组成的体内生长牙科生物膜的细胞外pH值。在暴露于葡萄糖的染料是向上集中在生物膜的所有细菌细胞内;因此它被用来作为一个通用细菌染色和细胞外pH值的标记。共聚焦显微图像采集后，细菌的生物量从使用数字图像分析软件，它允许以独占方式计算外pH的所有照片删除。 pH值ratiometry与比例染料是非常适合于研究高达75微米厚的薄的生物膜的细胞外pH值，但被限制在pH范围4.5至7.0之间。
Introduction
这里所描述的方法可以监控在牙科生物膜外pH在4.5和7之间的范围内，使用比例染料seminaphthorhodafluor-4F 5-（和-6）羧酸（C-SNARF-4）在共聚焦激光扫描显微镜组合和数字图像分析。所采用的荧光染料是pH敏感，并显示在其荧光发射取决于质子化的状态的转变。在580处的质子化分子峰的荧光发射，并且去质子分子在640nm 1的发射。荧光发射强度的两个探测窗口包括两个发射峰的比率（576 - 608 nm和629 - 661纳米）从而反映pH值在液相，不论染料浓度。用〜6.4的pK a的染料适用于适度酸性环境中的可视化的pH值。
PH值在细菌生物膜是对所有代谢过程至关重要。在牙科生物膜的情况下，pH值在细胞外基质为龋齿的发展的关键毒力因子。 pH值较低的生物膜牙接口引线过长，以减缓潜在的搪瓷2脱钙。由于生物膜，代谢物，包括有机酸的复杂的三维结构，不是均匀地在整个生物膜分布。高少产酸微环境可以紧密的空间接近3被发现。
几十年来，在生物膜垂直pH梯度进行记录微电极4-6的帮助。虽然他们提供了一个良好的空间分辨率，由于其小针尖大小，他们不是非常适合于监控水平梯度。此外，电极的插入机械干扰生物膜。荧光定量显微技术提供可视化生物膜中的不同区域的pH值的变化没有机械干扰的优势NCE。视不同的显微镜视野可以自由选择和过长时间1,7-9反复成像。然而，解译显微生物膜图像时，它的荧光从微生物生物质和荧光从细胞外空间导出导出区分是重要的。在酸性条件下，pH值的细菌细胞内是从pH值在细胞外基质不同，因为细菌在积极三磷酸腺苷10的费用运输在其细胞膜质子。在龋齿的上下文中，而低外pH导致脱矿质胞内细菌的pH不会对底层搪瓷有直接影响。在同时包含无菌区域和细菌显微图像均pH值会导致错误的结果。为了可视化的细菌的生物量和细胞内外区域之间区分使用具有pH敏感的染料沿着其它污渍带来从头出细胞外空间的荧光污染和假测量11的风险。
因此，本手稿描述了一个双重功能的比例染料;既作为pH标记，并作为通用细菌污点。作为染料是向上集中在细菌细胞中，共焦显微成像的组合和一个准确的数字图像分析过程允许在薄牙科生物膜确定4.5和7.0之间的范围外的pH值。
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Protocol
实验方案进行了审查，并通过奥胡斯郡的伦理委员会（M-20100032）的批准。
1.成比例的染料的共聚焦显微镜校准
- 对于图像采集，使用配有孵化器倒置共聚焦显微镜，一个63X / 1.2数值孔径的水浸泡的目的，一个543纳米激光线和一个META检测器。
- 制备的HEPES缓冲液储备溶液（50mM的，以0.1个pH单位的步骤调节至pH 4.5-8.5）。吸取100μl的每种溶液成用于荧光显微镜一个透明底96孔板的孔中。
- 处理比例染料C-SNARF-4时，戴上丁腈橡胶手套。制备在二甲基亚砜染料的1mM储备溶液。加入5微升原液，以每孔HEPES缓冲液。放置在显微镜的96孔板中。
- 打开显微镜。打开显微镜软件。点击以下面板：采集→激光;收购→MICRO;收购→配置;收购→扫描;收购→舞台。热身孵化器至37℃。
- 通过点击543 nm激光和“关于”按钮，在“激光控制”窗口打开543纳米激光线。选择在“显微镜控制”窗口中的63X / 1.2数值孔径的水浸泡的目的。
- 将META探测器576- 608纳米（绿色）和629- 661纳米（红色）的时间间隔（“配置控制”→“CHS”）中同时监测荧光。调整激光功率（“配置控制”→“激励”）。设置针孔，得到1.6微米的光学切片厚度（“扫描控制”→“针孔”）。
- 获得的每个的HEPES缓冲液，5微米的96孔板的玻璃底部上方的图像。注意：只要聚焦平面位于下方的玻璃底部，没有荧光可以看出屏幕上。每三个图像后，将激光功率为零，拍摄图像的背景减除。
- 执行一式三份的标定实验（1.2-1.7）。
- 确定在所有的红色和绿色的图像的平均荧光强度和标准偏差。
- 根据等式计算比R和平均值的标准误差，S R，对于每一个图像（1）和（2）
（1）
（2）
克，R，S G和S R是在各自的绿色和红色的图像的平均值和标准偏差; B G，B R，S BG和宽单峰都是为背景图像的对应值。1. - 绘制所计算的比率，用于从图中的三次重复校准实验各pH值，并从该系列的数据点的构建拟合曲线（ 即使用软件SIGMAPLOT 13）。使从可比率转换成的pH值10的拟合曲线的数学函数。
- 根据等式计算比R和平均值的标准误差，S R，对于每一个图像（1）和（2）
2. 在原位生长的生物膜牙样品采集
- 选择履行相关的研究入选和排除标准的志愿者。使它们的上和下齿弓的藻曝光。使从这些展示铸造模型和下颚制造的丙烯酸系夹板。设计与舌正畸钢丝，使志愿者咬入正常咬合连接12颊丙烯酸法兰夹板。
- 在丙烯酸夹板的颊凸缘钻头衰退（ 图1
- 生物膜收集，使用定做的非荧光玻璃板坯（4×4×1毫米3）与砂砾1200的表面粗糙度，以模仿天然釉质11定植图案。
- 通过之前安装高压灭菌玻璃砖。安装在每个侧的颊凸缘稍微凹进至丙烯酸表面的表面上的凹陷粘蜡玻璃板坯，以保护从由面颊11的移动施加剪切力的生物膜。
注意：放置在一个衰退玻璃板坯的数目可以，3和14之间变化取决于研究的目的。 - 插入志愿者口设备。指示volunTEER保留器具口内整个实验期间。指示志愿者以存储在用一块湿纸巾的正畸保持器容器的器具刷牙和食物和水以外的饮料的摄取期间，在室温（保持它湿润）。指示志愿者不接触与玻璃砖颊丙烯酸法兰同时放置和移除设备。
注意：实验周期可以根据研究（一天至几周）的目的而有所不同。 - 仔细实验期结束时删除该设备上的玻璃砖。用刀除去周围的板坯粘性蜡并用一对镊子的传递它们到一个密闭容器中，朝上生物膜，直到显微分析。保持与湿纸巾湿润的容器。生物膜收集后进行几个小时内pH值成像。
3.生物膜的pH成像
- 准备通过根据德容等人 13的方法中加入二硫苏糖醇，以收集唾液的唾液溶液。滴定唾液溶液至pH 7.0，并添加葡萄糖至0.4％（重量/体积）的浓度。每生物膜移液器将100μl要分析成用于显微镜的玻璃底96孔板中。加入5微升每孔的比例染料。
- 放置在显微镜载物台96孔板中。打开显微镜和543纳米的激光线。热身孵化器至37℃。使用相同的显微镜设置作为染料的校准（见步骤1.5-1.6）。等待30分钟，直到96孔板已达到工作温度。
- 拿起一个或多个玻璃砖采用了超薄一套镊子，并将其放置在唾液充满井，每口井一个平板，朝下的生物膜。
- 获取单个图像（“扫描控制”→“单”）或Z-栈（“扫描控制”→“开始”）spanni纳克在不同领域的生物膜的深度。获得的z栈选择要被成像（“扫描控制”→“Z设置”→“数片”）的片数，并标记为第一，并在显微镜软件的最后切片的z位置（“扫描控制“→”Z设置“→”标记为先“;”马克最后“）。
注意：Z-栈具有高达75微米的可与细胞外和细胞内区域之间的良好的对比度被收购的深度。 - 要遵循的观点随着时间的推移微观领域pH值的变化，标志着显微镜软件（“第一阶段和聚焦控制”→“马克·波什”），XY位置，并在连续的时间点采取重复图像（“扫描控制”→“单”）。经常服用的图像与背景减除设置为零激光功率。
4.数字图像分析
- 世博RT显微图像为TIF文件，使用显微镜软件（“宏”→“文件批量导出”）的文件批量出口。标记要导出的文件，并保存红色和绿色通道图像单独的文件夹为TIF-文件（“开始批量导出”）。重命名这两个文件夹给他们的顺序编号的文件。
- 导入红色和绿色图像串联成软件如daime（在微生物生态学数字图像分析）14。段与个人选定的亮度阈值（段→自动分割→自定义阈值）的绿色通道图像。小心地选择（通常是20与80之间）的亮度的阈值，以使所有的细菌（除外基质亮），但不是矩阵将被识别为分割期间的对象。验证目视即识别为对象的区域对应井到细菌生物质。
- 传输分段克对象层颖通道图像对应的红色通道图像（段→传输对象层）。使用对象编辑器功能，拒绝和删除红色和绿色通道图像的所有对象。现在仅外基质被留在所述生物膜的图像。导出处理的图像系列为TIF文件。
- 导入图像串联成的ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47）。确定在与激光拍摄的背景图像的平均荧光强度断开（分析→直方图）。减去红色和绿色的图像适当背景（流程→数学→减）。
- 仍然在ImageJ的，本身（过程→图像计算器）划分绿色形象系列（G1）。然后乘以所产生的图像系列（G2）的绿色形象系列（G1）。这将产生一个图象系列（G3），其中NaN被分配给属于该被确认为在daime对象区域的所有像素。继续在T他相同的方式与红色图象系列（R1 / R1 = R2，R2点¯xR1 = R3）。
注意：作为细菌的生物质从图像在步骤4.3除去，荧光强度是在这些区域0。步骤4.5是必要的值0转换为NaN时，其允许在步骤4.6比计算。 - 应用'是什么意思“过滤器（处理→过滤器→均值;半径：1像素），以补偿检测器噪音。除以红色图像系列（过程→图像计算器）的绿色形象系列。这导致的绿色/红色比在图像的外空间中的每个剩余的像素。利用虚假的着色图像中的比例图示（图像→查找表）。计算每个图像的平均比率（分析→直方图）。
- 根据1.9.2下安装的功能）转换绿/红比值的pH值。注：校正数据和拟合曲线的例子可以在Schlafer 等可见人2015年11。
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Representative Results
所提出的方法允许监测外pH在pH范围牙科生物膜从4.5至7中的实时的不同微环境下降。如果如上述被选择的实验条件下，pH值开始于生物膜的所有领域滴暴露于葡萄糖后不久。
当pH值在生物膜滴剂，细菌细胞成为短时间（<1分钟）内可见，随着比例染料在细胞（ 图2A）upconcentrated。在一开始，生物膜开始酸生产之前，没有差别可以背景和细胞间可见。导出到软件daime图像必须以获得图像中的细菌生物质和由程序（ 图2B）识别的对象之间的良好的一致性与个人选定亮度阈值分割。如果分段appropriately，对象的缺失daime移除从细菌细胞（ 图2C）中获得所有的荧光信号。在ImageJ的随后的图像处理中的绿色/红色比导致在图像的外空间像素。与校正曲线的帮助下，这些比率可以被转换为的pH值和与图形表示（ 图2D）假着色可视化。平均pH值可以计算为每个经处理的图像，并且pH发展可以跟随随时间（ 图2E）。 pH值下降可能的视图不同微观场之间不同，并且横向和纵向的pH梯度可以被监视。然而，在静态条件下，薄的生物膜内，只有轻微的垂直pH梯度可以观察到。
在一些情况下，整个视显微镜视野可能与细菌细胞覆盖这使得细胞外的计算pH值不可能的（ 图3A）。这个问题可能通过选择一个稍微不同的聚焦平面来解决。必须小心不要过度曝光的显微图像，因为在图像中的细菌生物质，然后覆盖更大的面积比现实（ 图3B）。当在daime分割图像关键是要选择能识别所有细菌细胞和，如果存在的话，人上皮细胞（ 图3C）作为对象的亮度的阈值。如果分割与过高的亮度的阈值进行的，细胞内的区域将被包括在pH值计算和导致错误的结果（ 图3D）。外pH与比例染料的监测是通过使用共焦显微镜的限制。高达75微米的穿透深度，细胞内外区域可以可靠地区别（ 图3E）。为了测量较厚的生物膜垂直pH梯度，微电极保持在会见选择HOD。
图1：亚克力夹板口腔内生物膜收集夹板设计与舌正畸钢丝，使志愿者咬入正常牙颊连接法兰丙烯酸请点击此处查看该图的放大版本。
图2：图像处理对胞外生物膜pH值的显微测量 （A）和成比例的染料染色生物膜的共焦显微镜图像，9分钟后暴露于葡萄糖。图像中的细菌生物量可以从细胞外的背景区分开来。 （B）在daime分割后的相同的图像。在视显微镜视野整个细菌生物量分割期间已被确认为目的，由橘线所指示的。 （℃）除去细菌生物量后的相同的图像。所有荧光从细菌细胞衍生已被去除，并且只有来自细胞外基质衍生荧光留在映像中。 （D）中的观点相同微观领域外pH的图形表示。绿色/红色比已在ImageJ的被计算出来，并假着色施加于外pH的图形表示。平均外pH = 5.86。 （AD）比例尺= 20微米。 （E）的平均pH值下降的视图相同的微观领域，监测15分钟。 pH值下降在这一领域的生物膜是在开始的时候最快，暴露于葡萄糖后不久。然后它会减慢但不到达观察时间内平稳状态。https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：生物膜外pH值显微测量-潜在的问题和错误 （A）暴露于葡萄糖，并与比例染料染色密集的生物膜的共聚焦显微图像。在视此显微镜视野中，整个图像上覆盖的细菌细胞，并除去细菌不会留下胞外区中对pH值的计算。 （B）曝光过度与比例染料染色生物膜的共焦显微图像。在过度曝光的图像的图像分割更大的区域比实际由细菌覆盖被识别为对象和细胞外空间的一部分被丢失pH值的计算。 （C）Biof上皮细胞（箭头）ILM图像。图像分割亮度的阈值必须选择，使上皮细胞被识别为对象，并从图像中之前至pH计算除去。 （D）相同的生物膜图像如在图1B中 ，用一个错误的亮度阈值分割。细菌的生物质的一部分没有被识别为对象，不能从图像中移除。这导致pH值计算纳入内区，因此错误的结果。 （E）的比例染料染色生物膜的深层。图像从生物膜基质界面获得90微米。细胞内外区域之间的差异就会大打折扣。比例尺= 20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
相比，电极或微电极测量4-6生物膜pH为微观监测提供了若干优点。显微技术允许确定pH值以高空间分辨率和允许在不机械地扰乱生物膜捕获在生物膜水平和垂直的pH梯度。的微观pH监测先前的尝试，但是，没能在生物膜1,7,9外和细胞内pH值之间进行区分。由于细菌的动态平衡，细胞内pH从外pH不同，并且如果内和细胞外隔室向记录荧光发射的pH计算可以是无效的。使用第二荧光染料与pH敏感染料沿着可视化的细菌细胞是有问题的，因为染料的发射光谱之间，即使一个小的重叠可能损害荧光的定量。因此，这里的技术介绍依赖于生物膜从所获取的pH值的图像识别和后来除去细菌细胞的细胞内外隔室之间的比率的染料的浓度梯度。
在用荧光染料染色，在生物膜的细菌细胞内化和向上集中的分子，但只有在酸性条件下。因此pH值ratiometry与染料被限制在pH范围4.5至7.0之间。在高于7的pH值，则未质子化并因此带电染料不穿透细菌细胞以及足以从细胞外的背景区分开来，并在低于4.5的pH值大多数在染料分子被质子化，并在荧光发射没有进一步的变化可以是观察到的。拟合曲线（pH值与比绿/红）是pH6左右最陡变平，向着pH值4.5。一个例子示于Schlafer。等 ，2015年，如图S2。11目前的使用用于pH ratiometry荧光染料的被限制为监控外pH 1。原则上，该染料还可以用于监测细胞内细菌pH变化，但到目前为止，校准尚未为胞内使用进行。此外，这将是困难的细胞内的荧光发射以及从连接到细菌细胞壁的外侧染料分子的荧光推定准确区分。另外，作为染色用比例染料在组合使用共焦显微镜，图像采集生物膜层深度超过75微米的从盖玻璃/生物膜界面受到损害。细菌细胞和细胞外基质之间减小对比度使得内和胞外区中难以之间的分化。所采用的比例染料已被证明可靠地可视牙科生物膜相关的15种细菌，它染色所有的细菌细胞在原位 11生长牙科生物膜。虽然这是可能的比例染料是一种普遍的细菌染色，这还没有被证实和污渍需要对从其他栖息地比口腔生物膜测试。该方法不容许产生给定的pH值测量的技术重复，如图像获取需要一些秒和生物膜pH值动态地变化。的但是自由生物膜缓冲溶液，重复成像，并在缓冲生物膜重复成像，得到稳定的pH值（数据未显示）。
用于图像处理的上述过程的所有步骤都必须被精确地遵循。生物膜图像必须具有足够的激光功率/增益获取，以获得在细胞外基质的荧光信号的足够的水平，但应避免细菌细胞的过度曝光。如果细菌细胞过度曝光（过高的激光功率或增益）更大的区域比实际由细菌所涵盖被确认为图像分割和细胞外空间的一部分时对象将丢失pH值计算（参见图3B）。另一方面，如果图像具有非常低的激光功率/增益获得的，在细胞外空间的荧光强度可能不足以为绿色/红色发射比率的可靠计算。在显微镜软件范围指示器工具可能被用于调整显微镜的设置，从而使细菌细胞与最大强度捕获，但没有过度。自动图像分割必须控制所有生物膜的图像，以确保所有的细菌和，如果存在的话，真核细胞被识别为通过软件对象。分割后，所有生物膜的图像应该比较逐一给各个分段的图像的细菌生物量和识别为对象的区域之间确定一致性。如果比那些通过菌覆盖更大的区域被识别为对象的亮度的阈值太低，一个准确的分化，并分割必须用喜来执行gher亮度阈值。如果细菌的生物质的部分不是对象之间，亮度阈值必须降低，以产生细胞外和细胞内空间之间的正确的分化。用于大型数据集的分析已经证明有利的是段中的所有的图像具有不同的亮度阈值的行，并随后确定每个图像的理想阈值。一旦细菌和细胞外基质之间的正确区分实现的，没有进一步的问题是在图像处理期间可以预期的。有可能，但是，有一些图像具有非常致密生物膜，其中细菌覆盖整个视显微镜视野。在这些图像中，很明显，外pH不能确定。在某些情况下，这个问题可通过在稍微不同的z平面，其中该细菌的生物质不包括的整个视场采集图像来解决。
外pH ratiometry的进一步应用程序可能是研究pH值景观比牙齿生物膜（ 即 铜绿假单胞菌生物膜或电流产生细菌生物膜）等微生物群落。可能被确定的不同的生态参数，如氧浓度，碳水化合物供给或生物膜pH值电流的应用的效果。生物膜年龄，生物膜厚度和代谢活性的pH值的影响，可能会进行调查，以及对细菌生物膜的pH调节剂的效果。后者是在牙科生物膜，其中缓冲剂代表一个有希望的治疗方法，以控制龋齿15的上下文中特别相关。此外，今后的研究重点应放在流动条件下应用该方法。迄今外pH ratiometry只被用来监测在静态条件下的pH值。新鲜的含氧介质的恒定供应是可能对pH值的微环境和发展的一个相当大的影响，在薄生物膜内的特定垂直pH梯度。酸靠介质流动的间隙可能有助于建立垂直梯度，即使在非常薄的生物膜。
比例共焦显微成像与比例染料的C-SNARF-4在与所获取的数字图像的许可证精确后处理组合来计算和可视化生物膜pH值在细胞外基质，实时，在pH范围4.5和7.0以及高达之间为75μm的生物膜的厚度。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想感谢哈维尔·加西亚·E.琳恩和对格隆克沙尔技术援助和莫雷特K. Raarup了富有成果的讨论。这项工作是由奥胡斯大学研究基金会资助并西蒙基金会探马。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B.
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
