Ratiometrisk Imaging af ekstracellulære pH i Dental biofilm

Summary

En pH-følsom ratiometrisk farvestof anvendes i kombination med konfokal laser scanning mikroskopi og digital billedanalyse til at overvåge ekstracellulær pH ​​i dental biofilm i realtid.

Abstract

PH i bakterielle biofilm på tænderne er af central betydning for caries, en sygdom med en høj forekomst på verdensplan. Næringsstoffer og metabolitter ikke jævnt fordelt i dental biofilm. Et komplekst samspil af sorption til og reaktion med organisk stof i biofilmen reducerer diffusion stier opløste stoffer og skaber stejle stigninger af reaktive molekyler, herunder organiske syrer, på tværs af biofilmen. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske metoder, såsom fluorescens levetid billeddannelse eller pH ratiometry, kan anvendes til at visualisere pH i forskellige mikromiljøer af tand biofilm. pH ratiometry udnytter en pH-afhængig forskydning i fluorescerende emission af pH-følsomme farvestoffer. Beregning af forholdet emission ved to forskellige bølgelængder tillader bestemmelse af lokale pH i mikroskopiske billeder, uanset koncentrationen af ​​farvestoffet. I modsætning til mikroelektroder teknikken tillader overvågning både lodrette og vandrette pH-gradienter i realtid medmekanisk forstyrre biofilmen. Imidlertid skal der drages omsorg for at skelne klart mellem ekstra- og intracellulære rum i biofilmen. Her ratiometrisk farvestof, seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) carboxylsyre (C-snarf-4) anvendes til at overvåge ekstracellulær pH i in vivo dyrket dental biofilm i sammensætningen ukendt art. Ved udsættelse for glucose farvestoffet er op-koncentreret inde alle bakterieceller i biofilm; det anvendes således både som en universel bakteriel plet og som en markør af ekstracellulært pH. Efter konfokal mikroskopisk billede erhvervelse, er den bakterielle biomasse fjernes fra alle billeder ved hjælp af digital billedanalyse software, som tillader udelukkende beregne ekstracellulær pH. pH ratiometry med ratiometrisk farvestof er velegnet til at studere ekstracellulær pH ​​i tynde biofilm på op til 75 um tykkelse, men er begrænset til pH-intervallet mellem 4,5 og 7,0.

Introduction

Den her beskrevne fremgangsmåde tillader overvågning ekstracellulære pH i dentale biofilm i intervallet mellem 4,5 og 7, ved hjælp af ratiometrisk farvestof seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) carboxylsyre (C-snarf-4) i kombination med konfokal laser scanning mikroskopi og digital billedanalyse. Den anvendte fluorescerende farvestof er pH-følsom og viser et skift i sin fluorescerende emission afhængigt af tilstanden af ​​protonering. Den fluorescerende emission af de protonerede molekyle topper ved 580 nm og emission af deprotoneret molekyle ved 640 nm ^1. Forholdet mellem de fluorescerende emissionsintensiteter i to detektionsvinduer omfattende de to emissionstoppe (576 - 608 nm og 629-661 nm) afspejler således pH i den flydende fase, uanset koncentrationen farvestof. Med en _pKa på ~ 6.4 farvestoffet er egnet til at visualisere pH i moderat sure miljøer.

PH i bakterielle biofilm, er af central betydning for alle metaboliske processer.I tilfælde af dental biofilm, pH i den ekstracellulære matrix er nøglen virulensfaktor for udvikling af karies. Udvidede perioder med lav pH-værdi på biofilmen-tand interfaceledning at bremse demineralisering af den underliggende emalje ^2. På grund af den komplekse tredimensionale arkitektur af biofilm, metabolitter, herunder organiske syrer, er ikke ensartet fordelt hen over biofilmen. Meget og mindre syrefase mikromiljøer kan findes i tæt rumlig nærhed ^3.

I årtier blev lodrette pH-gradienter i biofilm indspillet med hjælp fra mikroelektroder ^4-6. Mens de tilbyder en god rumlig opløsning på grund af deres lille spids størrelse, er de ikke velegnede til at overvåge horisontale gradienter. Endvidere indsættelse af elektroden forstyrrer biofilmen mekanisk. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske teknikker har den fordel at visualisere pH-ændringer i forskellige områder af en biofilm uden mekanisk blandence. Forskellige mikroskopiske synsfelter kan vælges frit og filmede gentagne gange over længere perioder ^1,7-9. Men når fortolkningen mikroskopiske biofilm billeder, er det vigtigt at skelne mellem fluorescens hidrørende fra den mikrobielle biomasse og fluorescens stammer fra det ekstracellulære rum. Under sure betingelser, pH inde bakterieceller er forskellig fra pH i den ekstracellulære matrix, som bakterierne aktivt transportere protoner tværs deres cellemembran på bekostning af adenosintriphosphat ^10. I forbindelse med caries, er intracellulær bakterie pH ikke har en direkte indvirkning på de underliggende emalje mens lav ekstracellulære pH fører til demineralisering. Gennemsnit pH i mikroskopiske billeder, der indeholder både bakterier-frie områder og bakterier fører til fejlagtige resultater. Anvendelse af andre pletter sammen med det pH-følsomme farvestof for at visualisere den bakterielle biomasse og skelne mellem ekstra- og intracellulære områder bringer abud risikoen for fluorescerende forurening af det ekstracellulære rum og falske målinger ^11.

Den foreliggende manuskript beskriver derfor anvendelsen af ​​den ratiometriske farvestof i en dobbelt funktion; både som pH markør og som en universel bakteriel plet. Som farvestoffet er op-koncentreret i bakterieceller er kombinationen af ​​konfokal mikroskopiske billeddannelse og en præcis billedanalyse procedure digital tillader bestemmelse af ekstracellulær pH ​​i området mellem 4,5 og 7,0 i tynde dental biofilm.

Protocol

Den eksperimentelle protokol blev gennemgået og godkendt af den etiske komité i Århus Amt (M-20.100.032).

1. Konfokal Mikroskopisk Kalibrering af Ratiometrisk Dye

1. For erhvervelse billede, bruge en omvendt konfokal mikroskop udstyret med en inkubator, en 63X / 1.2-numerisk blænde vand nedsænkning mål, en 543 nm laser linje og en META detektor.
2. Forbered HEPES buffer stamopløsninger (50 mM, justeret til pH 4,5 til 8,5 i trin af 0,1 pH-enheder). Tilsæt 100 pi af hver opløsning i brøndene på en klar-bottom 96-brønds plade til fluorescensmikroskopi.
3. Bær nitrilhandsker ved håndtering af ratiometrisk farvestof C-snarf-4. Forbered en 1 mM stamopløsning af farvestoffet i dimethylsulfoxid. Tilsæt 5 pi af stamopløsningen til hver brønd med HEPES buffer. Placer plade med 96 brønde på mikroskopet.
4. Tænd mikroskopet. Åbn mikroskop software. Klik på følgende paneler: Anskaf → Laser; Anskaf → Micro; Anskaf → Config; Anskaf → Scan; Erhverve → Stage. Varme op inkubatoren til 37 ° C.
5. Tænd 543 nm laser linje ved at klikke på 543 nm laser og "On" knappen i "Laser Control" vinduet. Vælg 63X / 1.2-numerisk blænde vand nedsænkning mål i "mikroskop Control" vinduet.
6. Indstil META-detektor til samtidig overvågning af fluorescens inden 576- til 608-nm (grøn) og 629- til 661 nm (rød) intervaller ( "Konfiguration Kontrol" → "CHS"). Juster laser power ( "Configuration Control" → "Excitation"). Indstil pinhole hvilket gav en optisk skive tykkelse på 1,6 um ( "Scan Control" → "Pinhole").
7. Erhverve et billede af hver HEPES bufferopløsning, 5 um over glas bunden af ​​96-brønds plade. Bemærk: Så snart fokusplanet ligger under glasbund, kan ingen fluorescerende lys sespå skærmen. Efter hver tredje billede, sæt laser magt til nul og tage et billede til baggrund subtraktion.
8. Udføre kalibreringen eksperiment i tre eksemplarer (1,2-1,7).
9. Bestem den gennemsnitlige fluorescerende intensitet og standardafvigelse i alle røde og grønne billeder.
   1. Beregne forholdet R og standardfejl på middelværdien, S _R, for hvert billede ifølge ligningerne (1) og (2)
      (1)
      (2)
      g, r, s _g og s _r er gennemsnit og standardafvigelser i de respektive grønne og røde billeder. b _g b _R, S _bg og s _br er de tilsvarende værdier for baggrundsbilleder. n 2 er antallet af pixels afbildet.
   2. Plot de beregnede nøgletal for hver pH-værdi fra de tre replikate kalibrering eksperimenter i et diagram og konstruere en monteret kurve fra denne serie af datapunkter (dvs. ved hjælp af softwaren SigmaPlot 13). Lav en matematisk funktion fra tilpassede kurve, der kan konvertere nøgletal i pH-værdier ^10.

2. Indsamling af In Situ Grown Dental Biofilm Prøver

1. Vælg frivillige, der opfylder inklusions- og eksklusionskriterier er relevante for undersøgelsen. Lav alginat indtryk af deres øvre og nedre dental arch. Lav støbte modeller fra disse indtryk og fremstille en acryl skinne i underkæben. Design skinnen med buccale akryl flanger forbundet med en flersprogede tandregulering ledning, der gør det muligt for frivillige til at bide i normal okklusion ^12.
2. Bor recessioner i de bukkale flanger akryl skinne (Figur 1
3. For biofilm samling, brug skræddersyede ikke-fluorescerende glas plader (4 x 4 x 1 mm ³⁾ med en overfladeruhed på grus 1200 med henblik på at efterligne kolonisering mønster på naturlig emalje ^11.
4. Sterilisere glas plader ved autoklavering før montering. Monter glasplader med klæbrig voks i fordybningerne i de bukkale flanger hver side lidt forsænket til overfladen af akryl overflade for at beskytte biofilmen fra forskydningskræfter, som udøves ved bevægelse af kinderne ^11.
   Bemærk: Antallet af glasplader anbragt i en recession, kan variere mellem 3 og 14, afhængigt af formålet med undersøgelsen.
5. Sæt apparatet i munden af ​​den frivillige. Instruer frivillig bevægTEER at fastholde apparatet inden oralt i forsøgsperioden. Instruer den frivillige til at gemme apparatet i en ortodontisk holder beholder med et stykke vådt papir væv (for at holde det fugtigt) ved stuetemperatur under tandbørstning og indtagelse af fødevarer og andre end vand drikkevarer. Instruer frivillige til ikke røre ved buccale akryl flanger med glas plader samtidig lægge og fjerne apparatet.
   Bemærk: Den eksperimentelle periode kan variere afhængigt af formålet med undersøgelsen (en dag til flere uger).
6. Fjern forsigtigt glasplader fra apparatet ved afslutningen af ​​forsøgsperioden. Fjern den klæbende voks omkring pladerne med en kniv og overføre dem med en pincet til en lukket beholder, biofilmen vender opad, indtil mikroskopisk analyse. Hold beholderen fugtigt med vådt papir væv. Udfør pH billedbehandling inden for få timer efter biofilm kollektion.

3. Biofilm pH Imaging

1. Forberedespyt opløsning ved tilsætning dithiothreitol til opsamlet spyt i overensstemmelse med fremgangsmåden af de Jong et al. ^13. Titrere spyt opløsningen til pH 7,0 og tilføje glucose til en koncentration på 0,4% (vægt / volumen). Tilsæt 100 pi pr biofilm, der skal analyseres i et glas-bundplade med 96 brønde til mikroskopi. Tilsæt 5 pi af ratiometrisk farvestof per brønd.
2. Placer plade med 96 brønde på objektbordet. Tænd mikroskopet og 543 nm laser linje. Varme op inkubatoren til 37 ° C. Brug de samme mikroskop indstillinger som for kalibrering af farvestof (se trin 1,5-1,6). Vent i 30 minutter, indtil 96 brønde har nået arbejdstemperatur.
3. Saml et eller flere plader med en slank sæt af pincet og placere dem i spyt fyldt brønde, en plade per brønd, med biofilm vender nedad.
4. Anskaf enkeltbilleder ( "Scan Control" → "Single") eller z-stakke ( "Scan Control" → "Start") spanning af dybden af ​​biofilm i forskellige områder. At erhverve z-stakke vælge det antal skiver, der skal afbildes ( "Scan Control" → "Z Indstillinger" → "Num Skiver") og markere z-position til den første og den sidste skive i mikroskopet software ( "Scan Kontrol "→" Z Indstillinger "→" Mark First "," Mark Last ").
   Bemærk: Z-stakke med en dybde på op til 75 um kan erhverves med god kontrast mellem ekstracellulære og intracellulære områder.
5. For at følge pH-ændringer i en mikroskopisk synsfelt over tid, markerer xy-stillingen i mikroskopet software ( "Stage og Focus Control" → "Mark Pos"), og tage gentagne billeder på hinanden følgende tidspunkter ( "Scan Control" → " Enkelt"). Regelmæssigt tage billeder med laser magt sat til nul baggrund subtraktion.

4. Digital Image Analysis

1. Til export de mikroskopiske billeder som TIF filer, bruge filen batch eksport af mikroskopet software ( "Macro" → "File Batch Export"). Marker de filer, der skal eksporteres, og gem røde og grønne kanal billeder i separate mapper som TIF-filer ( "Start Batch Export"). Omdøb filerne i begge mapper giver dem sekventielle numre.
2. Importer rød og grøn billedserier i software som Daime (digital billedanalyse i mikrobiel økologi) ^14. Segment den grønne kanal billeder med individuelt valgte lysstyrke tærskler (Segment → Automatisk segmentering → Brugerdefineret tærskel). Vælg lysstyrke tærskler med omhu (typisk mellem 20 og 80), således at alle bakterier (lysere end den ekstracellulære matrix), men ikke matricen vil blive anerkendt som objekter under segmentering. Kontroller visuelt, at de områder, der er anerkendt som objekter svarer godt til den bakterielle biomasse.
3. Overfør objektet lag af den segmenterede gReen kanal billeder til de tilsvarende røde kanal billeder (Segment → Transfer objekt Layer). Brug objektet editor funktion til at afvise og slette alle objekter i de røde og grønne kanal billeder. Nu kun den ekstracellulære matrix er tilbage i biofilm billeder. Eksporter behandlede billede serien som TIF-filer.
4. Importer billedserier i ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij, v.1.47). Bestem den gennemsnitlige fluorescensintensitet i baggrunden billeder taget med laseren slukkes (analyse → Histogram). Træk den nødvendige baggrund fra de røde og grønne billeder (Process → Math → Træk).
5. Stadig i ImageJ, opdele grønne image-serien (G1) af sig selv (Process → Billede lommeregner). Så ganger det resulterende billede serien (G2) med det grønne image serien (G1). Dette vil give et billede serie (G3), hvor NaN er tildelt alle pixels der tilhører områder, der blev anerkendt som objekter i Daime. Fortsæt i than samme måde med den røde billedserien (R1 / R1 = R2, R2 x R1 = R3).
   Bemærk: Som den bakterielle biomasse blev fjernet fra billederne i trin 4.3, fluorescensintensiteten er 0 på disse områder. Trin 4.5 er nødvendigt at konvertere værdien 0 til NaN, som giver mulighed for forholdet beregning i trin 4.6.
6. Påfør "Mean" filter (Process → Filtre → Mean; radius: 1 pixel) for at kompensere for detektor støj. Opdel grønne image serien ved den røde billedserien (Process → Billede lommeregner). Dette resulterer i en grøn / rød-forhold for hver resterende pixel i det ekstracellulære rum af billederne. Brug falsk farve til grafisk repræsentation af forholdene i billederne (billede → opslagstabeller). Beregn den gennemsnitlige ratio for hvert billede (analyse → Histogram).
7. Konverter de grønne / røde nøgletal til pH-værdier i henhold til den funktion, monteres under 1.9.2). Bemærk: Et eksempel på kalibreringsdata og tilpassede kurve kan ses i Schlafer etal, 2015 ^11.

Representative Results

I denne procedure tillader overvågning ekstracellulære pH falder i forskellige mikromiljøer af tand biofilm i pH-området fra 4,5 til 7 i realtid. Hvis der vælges de eksperimentelle betingelser som beskrevet ovenfor, pH begynder at falde inden for alle områder af biofilm kort efter udsættelse for glucose.

Når pH i en biofilm dråber, bakterieceller bliver synlige inden for kort tid (<1 min), som den ratiometrisk farvestof upconcentrated i celler (figur 2A). I begyndelsen, før syreproduktion i biofilm starter, ingen forskel kan ses mellem baggrund og celler. Billeder, der eksporteres i softwaren Daime skal segmenteres med tærskler individuelt valgte lysstyrke for at opnå en god overensstemmelse mellem den bakterielle biomasse i billederne og de ​​objekter, der er anerkendt af programmet (figur 2B). Hvis segmenteret er passende,bart, sletning af objekter i Daime fjerner alle fluorescerende signaler, der stammer fra bakterielle celler (Figur 2C). Efterfølgende billedbehandling i ImageJ resulterer i grøn / rød-forhold for pixel i det ekstracellulære rum af billederne. Med hjælp fra kalibreringskurven, kan disse forhold konverteres til pH-værdier og visualiseret med falsk farve til grafisk repræsentation (figur 2D). Gennemsnitlig pH kan beregnes for hver af de behandlede billeder, og pH udvikling kan følges over tid (figur 2E). pH-dråber kan variere mellem forskellige mikroskopiske synsfelter, og både vandrette og lodrette pH-gradienter kan overvåges. Men under statiske betingelser, inden tynde biofilm, kun mindre lodrette pH-gradienter kan observeres.

I nogle tilfælde kan hele mikroskopisk synsfeltet være dækket med bakterieceller, som gør beregning af ekstracellulærpH umulig (figur 3A). Problemet kan løses ved at vælge en lidt anden fokusplan. Der må drages omsorg for ikke at overeksponere de mikroskopiske billeder, fordi den bakterielle biomasse i billederne derefter dækker et større område end i virkeligheden (figur 3B). Når segmentere billedet i Daime er det afgørende at vælge lysstyrke tærskler, der genkender alle bakterieceller, og hvis nuværende, humane epitelceller (figur 3C) som objekter. Hvis segmentering udføres med tærskelværdier for høje lysstyrke, vil intracellulære områder indgå i beregningen pH og føre til fejlagtige resultater (figur 3D). Overvågning af ekstracellulært pH med ratiometrisk farvestof er begrænset af anvendelsen af ​​konfokal mikroskopi. Op til en indtrængningsdybde på 75 um, kan ekstra- og intracellulære områder skelnes pålideligt (figur 3E). For at måle lodrette pH-gradienter i tykkere biofilm, mikroelektroder forbliver opfyldthod af valg.

Figur 1:.. Akryl Splint for Intraoral Biofilm Collection Skinnen er designet med buccale akryl flanger forbundet med en flersprogede tandregulering ledning, der gør det muligt for frivillige til at bide i normal okklusion Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Image Processing for Mikroskopisk Måling af Ekstracellulær Biofilm pH (A) Konfokal mikroskopisk billede af en biofilm farvet med ratiometrisk farvestof, 9 min efter udsættelse for glukose. Den bakterielle biomasse i billedet kan adskilles fra den ekstracellulære baggrund. (B) Det samme billede efter segmentering i Daime. Hele bakteriel biomasse i mikroskopisk synsfelt er blevet anerkendt som objekter under segmentering, som angivet ved de orange linjer. (C) Det samme billede efter fjernelse af den bakterielle biomasse. Alle fluorescens stammer fra bakterieceller er blevet fjernet, og kun fluorescens stammer fra den ekstracellulære matrix er tilbage i billedet. (D) Grafisk repræsentation af ekstracellulært pH i samme mikroskopisk synsfelt. Grønne / røde nøgletal er beregnet i ImageJ, og falsk farve blev anvendt til grafisk repræsentation af ekstracellulær pH. Gennemsnitlig ekstracellulære pH = 5,86. (AD) Skala barer = 20 pm. (E) Gennemsnitlig pH-fald i samme mikroskopisk synsfelt, overvåget i 15 min. PH-faldet i dette område af biofilmen er hurtigst i begyndelsen, kort efter udsættelse for glucose. Så det sinker, men ikke når et plateau inden observationstiden.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3:. Mikroskopisk Måling af Ekstracellulær Biofilm pH - potentielle problemer og fejl (A) Konfokal mikroskopisk billede af en tæt biofilm udsat til glukose og farves med ratiometrisk farvestof. I denne mikroskopisk synsfelt, er hele billedet dækket med bakterieceller, og fjernelse af bakterierne vil ingen ekstracellulære områder til pH beregning. (B) Overeksponeret konfokalt mikroskopisk billede af en biofilm farvet med ratiometrisk farvestof. Under billedet segmentering af overeksponerede billeder større områder end faktisk omfattet af bakterier indregnes som objekter og en del af det ekstracellulære rum er tabt for pH beregning. (C) Biofilm billede med epithelceller (pile). Lysstyrke tærskler for billedsegmentering skal vælges, således at epitelceller indregnes som objekter og fjernes fra billederne før pH beregning. (D) Det samme biofilm billede som i figur 1B, opdelt af en forkert tærskel lysstyrke. En del af den bakterielle biomasse er ikke anerkendt som objekter og kan ikke fjernes fra billedet. Dette fører til optagelse af intracellulære områder i beregningen pH og følgelig fejlagtige resultater. (E) Deep lag af en biofilm farvet med ratiometrisk farvestof. Billedet blev købt 90 um fra biofilmen-substrat interface. Differentiering mellem ekstra- og intracellulære områder er kompromitteret. Scale barer = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mikroskopiske overvågning af biofilm pH tilvejebringer adskillige fordele i sammenligning med elektrodematerialer eller mikroelektrode målinger ^4-6. Mikroskopiske teknikker tillader at bestemme pH med en høj rumlig opløsning og tillade opfange både horisontale og vertikale pH-gradienter i biofilm uden at forstyrre biofilmen mekanisk. Tidligere forsøg på mikroskopisk pH overvågning, imidlertid ikke skelne mellem ekstracellulær og intracellulær pH i biofilm ^1,7,9. På grund af bakteriel homeostase, intracellulær pH ​​afviger fra ekstracellulær pH, og pH-beregninger kan ikke være gyldig, hvis både intra- og ekstracellulære rum bidrager til den registrerede fluorescens-emission. Anvendelsen af ​​en anden fluorescerende farvestof sammen med pH-følsomt farvestof til at visualisere bakterieceller er problematisk, eftersom selv en lille overlap mellem emissionsspektret af farvestofferne kan bringe kvantificering af fluorescerende lys. Derfor den teknik, der præsenteres herafhængig af en koncentrationsgradient af ratiometrisk farvestof mellem ekstra- og intracellulære rum i biofilmen for at identificere og senere fjerne bakterieceller fra de erhvervede pH billeder.

Efter farvning med den fluorescerende farvestof, bakterieceller i biofilm internaliserer og op-koncentreres molekylet, men kun i sure betingelser. pH ratiometry med farvestoffet er derfor begrænset til pH-intervallet mellem 4,5 og 7,0. Ved pH-værdier over 7, går den uprotonerede og således ladet farvestof ikke trænge bakterieceller godt nok til at skelne dem fra den ekstracellulære baggrund, og ved pH-værdier under 4,5 fleste af farvestofmolekyler er protonerede og ingen yderligere ændringer i fluorescensemissionen kan være observeret. Den tilpassede kurve (pH vs. Ratio grøn / rød) er stejleste omkring pH 6 og flader ud mod pH 4,5. Et eksempel er vist i Schlafer et al., 2015 Figur S2. ¹¹ På nuværende anvendelse af det fluorescerende farvestof for pH ratiometry er begrænset tilovervågning ekstracellulære pH ^1. I princippet kan farvestoffet også anvendes til at overvåge intracellulære bakterielle pH-ændringer, men hidtil har kalibrering ikke udført til intracellulær anvendelse. Derudover ville det være vanskeligt at skelne klart mellem intracellulær fluorescensemission og fluorescerende lys, der fremgår af farvestofmolekyler fastgjort til ydersiden af ​​den bakterielle cellevæg. Som farvning med ratiometrisk farvestof anvendes i kombination med konfokal mikroskopi, billedoptagelse i biofilm lag dybere end 75 um fra dækglasset / biofilm-grænsefladen er kompromitteret. Faldende kontrast mellem bakterieceller og ekstracellulære matrix gør differentieringen mellem intra- og ekstracellulære områder vanskelig. Den anvendte ratiometriske farvestof har vist sig at pålideligt visualisere 15 bakteriearter er forbundet med dental biofilm, og det pletter alle bakterieceller i dental biofilm dyrket in situ ^11. Selv om det er sandsynligt, at denratiometrisk farvestof er en universel bakteriel plet, dette er endnu ikke blevet bevist, og pletten skal testes på biofilm fra andre naturtyper end mundhulen. Metoden tillader ikke til fremstilling af tekniske gentagelser af en given pH-måling, som billede erhvervelse tager nogle sekunder, og biofilm pH ændrer sig dynamisk. Gentagen billeddannelse af biofilm-fri bufferopløsninger, dog, og gentagne billeder af biofilm i buffer gav stabile pH-værdier (data ikke vist).

Alle trin af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til billedbehandling skal følges nøjagtigt. Biofilm billeder skal erhverves med tilstrækkelig lasereffekt / gevinst på passende niveauer af fluorescerende signal i den ekstracellulære matrix, men overeksponering af bakterieceller bør undgås. Hvis bakterieceller er overeksponerede (for høj lasereffekt eller gevinst) større områder end faktisk omfattet af bakterier indregnes som objekter under billedet segmentering og en del af det ekstracellulære rum er tabttil pH-beregning (se figur 3B). På den anden side, hvis billederne er erhvervet med meget lav lasereffekt / gevinst, fluorescerende intensitet i det ekstracellulære rum måske ikke være tilstrækkelig til pålidelig beregning af grønne / røde emission nøgletal. En Range Indikator værktøj i mikroskopet software kan bruges til at justere indstillingerne mikroskop, således at bakterielle celler indfanges med maksimal intensitet, men uden overeksponering. Automatiseret billede segmentering skal kontrolleres for alle biofilm billeder for at sikre, at al bakteriel og, hvis til stede, er eukaryote celler er anerkendt som objekter med software. Efter segmentering bør alle biofilm billeder sammenlignes én efter én til de respektive unsegmented billeder til konstatere kongruens mellem den bakterielle biomasse og området anerkendt som objekter. Hvis større områder end dem, der er omfattet af bakterier er anerkendt som objekter tærsklen lysstyrke er for lav for en nøjagtig differentiering og segmentering skal udføres med en higher lysstyrke tærskel. Hvis en del af den bakterielle biomasse ikke er blandt de objekter, skal tærsklen lysstyrke sænkes for at give en korrekt differentiering mellem ekstracellulært og intracellulære rum. Til analysen af ​​store datasæt har det vist sig fordelagtigt at segmentere alle billeder med en række forskellige tærskler lysstyrke og efterfølgende bestemme den ideelle grænse for hvert billede. Når en korrekt sondring mellem bakterier og ekstracellulære matrix er opnået, ingen yderligere problemer kan forventes under billedbehandling. Der kan imidlertid være nogle billeder med en meget tæt biofilm, hvor bakterier dække hele mikroskopisk synsfelt. I disse billeder, naturligvis, ekstracellulære pH kan ikke bestemmes. I nogle tilfælde kan problemet løses ved at erhverve billeder i en lidt anden z-planet, hvor den bakterielle biomasse ikke dækker hele synsfeltet.

Yderligere anvendelser af ekstracellulær pH ​​ratiometry kunne være at studerepH-landskaber i andre mikrobielle samfund end dental biofilm (dvs.. Pseudomonas aeruginosa biofilm eller aktuelle-producerende bakterielle biofilm). Virkningen af ​​forskellige økologiske parametre, såsom oxygen koncentration, kulhydrat levering eller anvendelse af elektrisk strøm på biofilm pH kan bestemmes. Indflydelsen af ​​biofilm alder, biofilm tykkelse og metabolisk aktivitet af pH kan undersøges, samt virkningen af ​​pH modulerende midler på bakterielle biofilm. Sidstnævnte er særlig relevant i forbindelse med dental biofilm, hvor puffermidler repræsenterer en lovende terapeutisk tilgang til kontrol caries ^15. Desuden vil fremtidig forskning fokusere på at anvende den præsenterede metode under strømningsforhold. Til dato ekstracellulære pH ratiometry kun har været anvendt til at overvåge pH under statiske betingelser. Konstant forsyning af frisk iltet medium vil sandsynligvis have en betydelig indvirkning på udviklingen af ​​pH mikromiljøer og isærlige, lodrette pH-gradienter i tynde biofilm. Clearance af syrer ved medium flow kan bidrage til etablering af lodrette gradienter selv i meget tynde biofilm.

Ratiometrisk konfokal mikroskopisk billeddannelse med ratiometrisk farvestof C-snarf-4 i kombination med præcis efterbehandling af de overtagne digitale billeder tilladelser til at beregne og visualisere biofilm pH i den ekstracellulære matrix, i realtid, i pH-intervallet mellem 4,5 og 7,0 og op til en biofilm tykkelse på 75 um.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/