Summary
Een pH-gevoelige ratiometrische kleurstof wordt gebruikt in combinatie met confocale laser scanning microscopie en digitale beeldanalyse extracellulaire pH in tandheelkundige biofilms in real-time te volgen.
Abstract
De pH in bacteriële biofilms op de tanden van cruciaal belang is voor tandbederf, een ziekte met een hoge prevalentie wereldwijd. Voedingsstoffen en metabolieten zijn niet gelijkmatig verdeeld in de tandheelkundige biofilms. Een complexe wisselwerking tussen sorptie van en reactie met organische stof in de biofilm vermindert de diffusiewegen van opgeloste stoffen en creëert steile hellingen van reactieve moleculen, zoals organische zuren, in de biofilm. Kwantitatieve fluorescentie microscopische methoden, zoals fluorescentie levensduur imaging of pH ratiometry, kan worden toegepast om pH visualiseren verschillende micro-omgevingen van tandheelkundige biofilms. pH ratiometry exploiteert een pH-afhankelijke verandering in de fluorescentie-emissie van pH-gevoelige kleurstoffen. Berekening van de emissiegraad bij twee verschillende golflengten maakt bepaling lokale pH in microscopische beelden, ongeacht de concentratie van de kleurstof. Anders dan de micro-elektroden techniek maakt controle zowel verticale als horizontale pH gradiënten in real-time metuit mechanisch de biofilm te verstoren. Wel moet ervoor worden gezorgd dat nauwkeurig onderscheid te maken tussen extra- en intracellulaire compartimenten van de biofilm. Hier, de ratiometrische kleurstof, seminaphthorhodafluor 4F-5- (en-6) carbonzuur (C-SNARF-4) gebruikt om extracellulaire pH in in vivo gekweekt tandheelkundige biofilms van onbekende soorten samenstelling volgen. Bij blootstelling aan de kleurstof glucose up geconcentreerd binnen alle bacteriecellen in de biofilms; het wordt dus gebruikt zowel als een universele bacteriële vlek en als marker van extracellulaire pH. Na confocale microscopische beeld overname, wordt de bacteriële biomassa verwijderd uit alle foto's met behulp van digitale beeldanalyse-software, die het mogelijk maakt om uitsluitend te berekenen extracellulaire pH. pH ratiometry de ratiometrische kleurstof goed geschikt voor extracellulaire pH in dunne biofilms tot 75 urn dikte bestuderen, maar is beperkt tot het pH gebied tussen 4,5 en 7,0.
Introduction
De hier beschreven methode maakt bewaking extracellulaire pH in tandheelkundige biofilms in het bereik tussen 4,5 en 7, met het ratiometrische kleurstof seminaphthorhodafluor 4F-5- (en-6) carbonzuur (C-SNARF-4) in combinatie met confocale laser scanning microscopie digitale beeldanalyse. De toegepaste fluorescerende kleurstof pH-gevoelig en wordt een verschuiving in de fluorescentie-emissie afhankelijk van de stand van protonering. De fluorescerende emissie van de geprotoneerde molecuul pieken bij 580 nm en de emissie van de gedeprotoneerde molecuul op 640 nm 1. De verhouding van de fluorescentie-emissie-intensiteiten in twee detectievensters omvattende twee emissiepieken (576-608 nm en 629-661 nm) geeft zo pH in de vloeistoffase, ongeacht de kleurstofconcentratie. Met een pKa van 6,4 ~ de kleurstof geschikt pH visualiseren matig zure milieus.
PH in bacteriële biofilms is van cruciaal belang voor alle metabole processen.Bij tandheelkundige biofilms pH in de extracellulaire matrix is de belangrijkste virulentiefactor voor de ontwikkeling van cariës. Langere periodes met een lage pH op de biofilm-tooth-interface leiden tot demineralisatie van de onderliggende glazuur 2 te vertragen. Vanwege de complexe driedimensionale architectuur van biofilms, metabolieten, zoals organische zuren, zijn niet gelijkmatig verdeeld over de biofilm. Sterk en minder acidogene microenvironments kan worden gevonden in de buurt ruimtelijke nabijheid 3.
Al decennia lang, werden verticaal pH gradiënten in biofilms opgenomen met behulp van micro-elektroden 4-6. Zij bieden een goede ruimtelijke resolutie door hun kleine tipgrootte, ze zijn niet goed geschikt om horizontale gradiënten te controleren. Verder inbrengen van de elektrode verstoort de biofilm mechanisch. Kwantitatieve fluorescentie microscopische technieken hebben het voordeel visualiseren pH veranderingen in verschillende gebieden van een biofilm zonder mechanische interfererenNVU. Verschillende microscopische gezichtsveld kan vrij worden gekozen en herhaaldelijk afgebeeld gedurende lange perioden 1,7-9. Echter, bij het interpreteren van microscopische beelden biofilm, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen fluorescentie die uit de microbiële biomassa en fluorescentie die uit de extracellulaire ruimte. Onder zure omstandigheden, pH binnen bacteriële cellen verschilt van de pH in de extracellulaire matrix, de bacteriën actief protonen in de celmembraan transporteren ten koste van adenosine trifosfaat 10. In het kader van cariës, heeft intracellulaire bacteriële pH niet een directe impact op de onderliggende glazuur hebben terwijl lage extracellulaire pH leidt tot demineralisatie. Gemiddeld pH in microscopische beelden die zowel bacteriën gebieden en bacteriën bevatten leidt tot foutieve resultaten. Het gebruik van andere vlekken met de pH-gevoelige kleurstof om de bacteriële biomassa te visualiseren en te differentiëren tussen extra- en intracellulaire gebieden brengt abhet risico van fluorescerende vervuiling van de extracellulaire ruimte en valse metingen 11.
De huidige manuscript beschrijft ook het gebruik van de ratiometrische kleurstof in een dubbele functie; zowel als pH marker en een universele bacteriële vlek. Aangezien de kleurstof-up geconcentreerd in bacteriële cellen, de combinatie van confocale microscopische beeldvorming en een nauwkeurige digitale beeldanalyse procedure maakt bepaling extracellulaire pH in het traject tussen 4,5 en 7,0 in dunne tandheelkundige biofilms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van Aarhus County (M-20100032) goedgekeurd.
1. Confocale Microscopische kalibratie van de Ratiometrische Dye
- Voor het verkrijgen, gebruiken een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een incubator, een 63x / 1,2-numerieke lensopening water immersie objectief, een 543 nm laser lijn en een META detector.
- Bereid HEPES buffer voorraadoplossingen (50 mM, pH 4,5-8,5 in stappen van 0,1 pH-eenheden). Pipetteer 100 ul van elke oplossing in de putjes van een heldere bodem 96-wells plaat fluorescentiemicroscopie.
- Draag nitril handschoenen bij het hanteren van de ratiometrische kleurstof C-SNARF-4. Bereid een 1 mM stock oplossing van de kleurstof in dimethylsulfoxide. Voeg 5 ul van de voorraadoplossing in elk putje met HEPES buffer. Plaats de 96-well plaat op de microscoop.
- Schakel de microscoop. Open de microscoop software. Klik op de volgende panelen: Acquire → Laser; Verwerven → MICRO; Verwerven → Config; Verwerven → Scan; Acquire → Stage. Warm de incubator tot 37 ° C.
- Schakel de 543 nm laser lijn door te klikken op de 543 nm laser en de "On" knop in het venster "Laser Control". Kies de 63x / 1.2-numerieke lensopening water immersie objectief in het venster "Microscope Control".
- Stel de META detector gelijktijdig fluorescentie monitoren binnen 576- tot 608-nm (groen) en 629- tot 661 nm (rood) intervallen ( "Configuration Control" → "ChS"). Pas het laservermogen ( "Configuration Control" → "excitatie"). Stel de pinhole tot een optische slice dikte van 1,6 micrometer opleveren ( "Scan Control" → "Pinhole").
- Verwerven van een beeld van elke HEPES bufferoplossing 5 urn boven de glazen bodem van de 96-well plaat. Opmerking: Zodra de focus vliegtuig zich onder het glazen bodem, kan geen fluorescerend licht zichtbaarop het scherm. Na elke derde afbeelding, stel de laservermogen naar nul en neem een beeld voor de achtergrond aftrekken.
- Voer de kalibratie experiment in drievoud (1,2-1,7).
- Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en standaardafwijking alle rode en groene beelden.
- Bereken de verhouding R en standaardfout van het gemiddelde, S R, voor elk beeld overeenkomstig vergelijkingen (1) en (2)
(1)
(2)
g, r, s en g en r de gemiddelden en standaarddeviaties in de respectievelijke rode en groene beelden. b g, br, s bg en br s worden de overeenkomstige waarden voor de achtergrondbeelden. n - Plot de berekende verhoudingen voor elke pH van de drie herhaalde kalibratie experimenten in een diagram en bouw een gefitte curve van deze reeks gegevenspunten (dwz met de software SigmaPlot 13). Maak een wiskundige functie van de ingebouwde curve die ratio's kan omzetten in pH-waarden 10.
- Bereken de verhouding R en standaardfout van het gemiddelde, S R, voor elk beeld overeenkomstig vergelijkingen (1) en (2)
2. Het verzamelen van In Situ Grown Dental biofilm Samples
- Selecteer vrijwilligers die voldoen aan criteria voor opname en uitsluiting relevant zijn voor het onderzoek. Maak alginaat ervaring van hun bovenste en onderste tandboog. Voeg gegoten modellen van deze indrukken en produceren een acrylaat spalk in de onderkaak. Ontwerp de spalk met buccale acryl flenzen verbonden door een linguale orthodontische draad die het mogelijk maakt de vrijwilliger te bijten in normale occlusie 12.
- Boor recessies in de buccale flenzen van de acryl splint (figuur 1
- Voor biofilm verzamelen, gebruik van niet-fluorescerende glasblokken maat (4 x 4 x 1 mm 3) met een oppervlakteruwheid grit 1200 om de kolonisatie patroon op natuurlijke glazuur 11 nabootsen.
- Steriliseren het glazen platen door autoclaveren voorafgaand aan de montage. Monteer de glasplaten met kleefwas in de verdiepingen in de buccale flenzen van elke zijde enigszins verzonken op het oppervlak van de acryl oppervlak om de biofilm uit afschuifkrachten uitgeoefend door beweging van de wangen 11 beschermen.
Opmerking: Het aantal glasplaten geplaatst in een recessie kan variëren tussen 3 en 14, afhankelijk van het doel van de studie. - Steek het apparaat in de mond van de vrijwilliger. Instrueer de vrijwilteer aan het apparaat gedurende de experimentele periode te behouden intra-oraal. Instrueer de vrijwilliger om het apparaat in een orthodontische houder container met een stuk van natte papieren tissue bewaren bij kamertemperatuur (om het vochtig te houden) tijdens het tandenpoetsen en de inname van voedsel en anders dan water drinken. Instrueer de vrijwilliger niet aan de buccale acryl flenzen met de glazen platen terwijl het plaatsen en verwijderen van het apparaat.
Opmerking: De experimentele periode kan variëren afhankelijk van het doel van het onderzoek (één dag tot enkele weken). - Verwijder voorzichtig de glazen platen van het toestel aan het einde van de experimentele periode. Verwijder de kleverige was rond de platen met een mes en overbrengen met een pincet naar een gesloten houder, waarbij de biofilm naar boven, tot microscopische analyse. Houd de container vochtig met natte papieren tissue. Voer pH beeldvorming binnen enkele uren na biofilm collectie.
3. Biofilm pH Imaging
- Klaarmakenspeeksel door toevoeging van dithiothreitol verzamelde speeksel volgens de werkwijze van de Jong et al. 13. Titreer de speeksel tot pH 7,0 en voeg glucose tot een concentratie van 0,4% (gew / vol). Pipetteer 100 ul per biofilm te analyseren in een glazen bodem 96-wells plaat microscopie. Voeg 5 ul van de ratiometrische kleurstof per putje.
- Plaats de 96-well plaat op de microscoop podium. Schakel de microscoop en de 543 nm laser lijn. Warm de incubator tot 37 ° C. Gebruik dezelfde microscoop instellingen als bij de ijking van de kleurstof (zie stap 1,5-1,6). Wacht 30 minuten, totdat de 96-well plaat op werktemperatuur is.
- Pick-up een of meer glazen platen met een slanke set van een pincet en plaats ze in het speeksel gevulde putten, één plaat per goed, met de biofilms naar beneden.
- Acquire enkele beelden ( "Scan Control" → "Single") of z-stacks ( "Scan Control" → "Start") spanning de diepte van de biofilms in verschillende gebieden. Te verwerven z-stacks kiezen voor het aantal af te beelden doorsneden ( "Scan Control" → "Z-instellingen" → "Num Slices") en markeer de z-positie voor het eerste en het laatste stukje in de microscoop software ( "Scan Controle "→" Z-instellingen "→" Mark First "," Mark Last ").
Opmerking: Z-stacks met een diepte van maximaal 75 pm kunnen worden verkregen met een goed contrast tussen de extracellulaire en intracellulaire gebieden. - Om pH veranderingen in een microscopisch gezichtsveld loop van de tijd te volgen, markeer de xy-positie van de microscoop software ( "Stage en Focus Control" → "Mark Pos") en neem herhaalde afbeeldingen in opeenvolgende keer punten ( "Scan Control" → " Single "). Regelmatig foto's te nemen met het laservermogen op nul gezet voor de achtergrond aftrekken.
4. Digitale Beeldanalyse
- om export de microscopische beelden als TIF-bestanden, gebruik het bestand batch export van de microscoop software ( "Macro" → "File Batch Export"). Markeer de bestanden te exporteren en op te slaan rode en groene kanaal beelden in aparte mappen als TIF-bestanden ( "Start Batch Export"). De naam van de bestanden in beide mappen waardoor ze opeenvolgende nummers.
- Importeer de rode en groene imago series in software zoals daime (digitale beeldanalyse in microbiële ecologie) 14. Het segment van de groene kanaal beelden met individueel gekozen lichtsterktedrempels (Segment → Automatische segmentatie → Custom drempel). Kies de lichtsterktedrempels voorzichtig (meestal tussen 20 en 80), zodat alle bacteriën (helderder dan de extracellulaire matrix), maar niet de matrix wordt als objecten tijdens segmentatie herkend. Controleer visueel dat de gebieden die als objecten komen goed overeen met de bacteriële biomassa.
- Breng het object laag van de gesegmenteerde green kanaal beelden naar de bijbehorende rode kanaal beelden (Segment → Transfer object layer). Gebruik de editor functie object te verwerpen en verwijder alle objecten in de rode en groene kanaal. Nu alleen de extracellulaire matrix nog in de biofilm beelden. Exporteer de bewerkte afbeelding serie als TIF-bestanden.
- Importeer de afbeelding serie in ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit op de achtergrond beelden die met de laser uitgeschakeld (Analyseer → Histogram). Trek de juiste achtergrond van de rode en groene beelden (Process → Math → Aftrekken).
- Nog in ImageJ, verdeel de groene imago series (G1) op zichzelf (Process → Afbeelding calculator). vermenigvuldig dan het resulterende beeld-serie (G2) met de groene imago-serie (G1). Dit zal een reeks beelden (G3), waarin NaN wordt toegewezen aan alle pixels die behoren tot gebieden die als objecten in Daime werden erkend opleveren. Ga op thij op dezelfde manier met de rode afbeelding serie (R1 / R1 = R2, R2 x R1 = R3).
Opmerking: Als de bacteriële biomassa van de beelden in stap 4.3 werd verwijderd, de fluorescentie-intensiteit 0 in deze gebieden. Stap 4,5 is noodzakelijk om de waarde 0 te zetten in NaN, die zorgt voor verhouding omzetting in stap 4,6. - Breng de 'Mean' filter (Process → Filters → Mean; straal: 1 pixel) om te compenseren voor detector ruis. Verdeel het groene imago serie door de rode afbeelding serie (Proces → Image calculator). Dit resulteert in een groene / rode verhouding voor elke resterende pixel in de extracellulaire ruimte van de beelden. Gebruik false lint voor grafische weergave van de verhoudingen in de afbeeldingen (Image → opzoektabellen). Bereken de gemiddelde verhouding voor elk beeld (Analyseer → Histogram).
- Zetten de groen / rode verhoudingen pH waarde volgens de functie onder 1.9.2 gemonteerd). Opmerking: Een voorbeeld van kalibratiegegevens en gepaste curve kan worden gezien in Schlafer etal, 2015 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De onderhavige methode voor het bewaken extracellulaire pH druppels in verschillende micro-omgevingen van tandheelkundige biofilms in het pH traject 4,5-7 in real-time. Als de experimentele omstandigheden worden gekozen zoals hierboven beschreven, pH begint te dalen op alle gebieden van de biofilms kort na blootstelling aan glucose.
Bij pH in een biofilm druppels, bacteriële cellen zichtbaar binnen korte tijd (<1 min), de ratiometrische upconcentrated kleurstof in de cellen (Figuur 2A). In het allereerste begin, voordat de zuurproductie in de biofilm begint, geen verschil te zien tussen de achtergrond en cellen. Beelden uitgevoerd in de software daime moet segmentatie zelfgekozen lichtsterktedrempels om een goede overeenstemming tussen de bacteriële biomassa in de beelden en objecten die door het programma (figuur 2B) te verkrijgen. Als gesegmenteerd approprilijk, verwijdering van objecten in Daime verwijdert alle fluorescerende signalen die afkomstig zijn van bacteriële cellen (figuur 2C). Latere beeldverwerking in ImageJ resulteert in groen / rood ratio's voor pixels in de extracellulaire ruimte van de beelden. Met behulp van de ijklijn, kunnen deze coëfficiënten omgezet in pH-waarden en gevisualiseerd met valse lint voor grafische weergave (figuur 2D). Gemiddelde pH kan worden berekend voor elk van de bewerkte afbeeldingen en de pH ontwikkeling te volgen in de tijd (Figuur 2E). pH druppels kunnen verschillen tussen verschillende microscopische gezichtsvelden, en zowel horizontale als verticale pH gradiënten kunnen worden gecontroleerd. Echter, onder statische omstandigheden, in dunne biofilms, slechts een kleine verticale pH gradiënten kunnen worden waargenomen.
In sommige gevallen kan het gehele microscopische gezichtsveld bedekt met bacteriële cellen die berekend extracellulaire maaktpH mogelijk (Figuur 3A). Het probleem kan worden opgelost door te kiezen voor een iets andere focus vliegtuig. Let erop dat de microscopische beelden niet overbelicht, omdat de bacteriële biomassa in de beelden dan een groter gebied beslaat dan in werkelijkheid (figuur 3B). Wanneer het segmenteren van het beeld in Daime is het cruciaal om lichtsterktedrempels dat alle bacteriële cellen herkennen en, indien aanwezig, de menselijke epitheelcellen (figuur 3C) als objecten te kiezen. Als segmentatie met te hoge lichtsterktedrempels plaatsvindt, zal intracellulaire gebieden worden opgenomen in de berekening pH en leiden tot foutieve resultaten (Figuur 3D). Monitoring van extracellulaire pH met de ratiometrische kleurstof wordt beperkt door het gebruik van confocale microscopie. Tot een penetratiediepte van 75 urn, kan extra- en intracellulaire gebieden betrouwbaar worden onderscheiden (figuur 3E). Om verticale pH gradiënten in dikkere biofilms te meten, micro-elektroden blijven ontmoettehod keuze.
Figuur 1:.. Acryl Splint voor Intraorale Biofilm Collectie De spalk is ontworpen met buccale acryl flenzen verbonden door een linguale orthodontische draad die het mogelijk maakt de vrijwilliger te bijten in normale occlusie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Beeldverwerking voor microscopische meting van extracellulaire pH Biofilm (A) Confocale microscopische afbeelding van een biofilm gekleurd met de kleurstof ratiometrische, 9 min na blootstelling aan glucose. De bacteriële biomassa in het beeld kan worden onderscheiden van de extracellulaire achtergrond. (B) Het zelfde beeld na segmentatie in Daime. De gehele bacteriële biomassa in de microscopische gezichtsveld is erkend als objecten tijdens segmentatie, zoals aangegeven door de oranje lijnen. (C) dezelfde afbeelding na verwijdering van de bacteriële biomassa. Alle fluorescentie afkomstig uit bacteriële cellen is verwijderd en slechts fluorescentie die uit de extracellulaire matrix nog in de afbeelding. (D) Grafische weergave van extracellulaire pH in dezelfde microscopische gezichtsveld. Groen / rood ratio's zijn berekend in ImageJ, en valse kleuring werd toegepast voor de grafische weergave van de extracellulaire pH. Gemiddelde extracellulaire pH = 5,86. (AD) Schaal bars = 20 pm. (E) gemiddelde pH-daling in dezelfde microscopische gezichtsveld, gecontroleerd op 15 min. De pH vallen in het gebied van de biofilm is snelste in het begin kort na blootstelling aan glucose. Dan vertraagt, maar niet een plateau binnen de observatietijd te bereiken.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Microscopische meting van extracellulaire Biofilm pH - Mogelijke problemen en fouten (A) confocale microscopische beeld van een dichte biofilm blootgesteld aan glucose en gekleurd met de ratiometrische kleurstof. In dit microscopische gezichtsveld, wordt het gehele beeld bedekt met bacteriële cellen en verwijdering van de bacteriën geen reactie extracellulaire gebieden pH berekening. (B) Overbelicht confocale microscopische beeld van een biofilm gekleurd met de ratiometrische kleurstof. Tijdens beeldsegmentatie van overbelichte beelden grotere gebieden dan eigenlijk onder bacteriën worden als objecten en een deel van de extracellulaire ruimte verloren pH berekening. (C) BIOFilm afbeelding met epitheliale cellen (pijlen). Lichtsterktedrempels voor beeldsegmentatie worden gekozen, dat epitheelcellen als objecten worden herkend en verwijderd van de beelden voorafgaand aan pH berekening. (D) Het beeld dezelfde biofilm zoals in figuur 1B, gesegmenteerd met een verkeerde lichtsterktedrempel. Een deel van de bacteriële biomassa wordt niet herkend als objecten, en niet uit het beeld verwijderd. Dit leidt tot opname van intracellulaire gebieden van de pH berekening en dus foutieve resultaten. (E) diepe laag van een biofilm gekleurd met de kleurstof ratiometrische. Het beeld werd overgenomen 90 micrometer uit de biofilm-substraat interface. Differentiatie tussen extra- en intracellulaire gebieden in het gedrang komt. Schaal bars = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microscopisch onderzoek van biofilm pH verschaft verscheidene voordelen in vergelijking met micro-elektrode of elektrode metingen 4-6. Microscopische technieken toestaan pH met een hoge ruimtelijke resolutie vast en laat vastleggen zowel horizontale als verticale pH gradiënten in biofilms zonder biofilm mechanisch verstoren. Eerdere pogingen microscopisch pH-meting echter niet differentiëren tussen extracellulaire en intracellulaire pH in de biofilms 1,7,9. Door bacteriële homeostase, intracellulaire pH afwijkt van extracellulaire pH en pH berekeningen niet geldig als zowel intra- als extracellulaire compartimenten bijdragen tot de geregistreerde fluorescente emissie. Het gebruik van een tweede fluorescerende kleurstof, samen met de pH-gevoelige kleurstof bacteriële cellen zichtbaar is problematisch, omdat zelfs een kleine overlap tussen de emissiespectra van de kleurstoffen de kwantificering van fluorescerend licht kunnen compromitteren. Daarom hier gepresenteerde techniekgebaseerd op een concentratiegradiënt van het ratiometrische kleurstof tussen extra- en intracellulaire compartimenten van de biofilm om bacteriële cellen te identificeren en later uit de verkregen pH beelden.
Na kleuring met de fluorescerende kleurstof, bacteriële cellen in biofilms internaliseren en up-concentraat het molecuul, maar alleen onder zure omstandigheden. pH ratiometry met de kleurstof wordt dus beperkt tot de pH-waarde tussen 4,5 en 7,0. Bij pH-waarden boven 7, heeft de geprotoneerde en dus geladen kleurstof niet door bacteriële cellen goed genoeg om ze te onderscheiden van de extracellulaire achtergrond en bij pH waarden onder 4,5 de meeste kleurstofmoleculen geprotoneerd en geen verdere veranderingen in de fluorescentie-emissie kan zijn waargenomen. De ingebouwde curve (pH vs. Ratio groen / rood) is steilste rond pH 6 en vlakker uit de richting van pH 4,5. Een voorbeeld wordt getoond in Schlafer et al., 2015, Figuur S2. 11 Momenteel is het gebruik van de fluorescente kleurstof voor pH ratiometry beperkt totbewaking extracellulaire pH 1. In principe kan de kleurstof worden gebruikt voor intracellulaire bacteriële pH-veranderingen te volgen, maar tot nu toe, is kalibratie niet uitgevoerd voor intracellulaire toepassing. Bovendien, zou het moeilijk zijn om nauwkeurig te onderscheiden tussen intracellulaire fluorescente emissie en fluorescentieverlichting voortvloeiend uit kleurstofmoleculen aan de buitenkant van de bacteriële celwand. Zoals kleuring met ratiometrische kleurstof wordt gebruikt in combinatie met confocale microscopie, beeldacquisitie biofilm lagen dieper dan 75 urn van de dekglas / biofilm interface aangetast. Afnemend contrast tussen bacteriële cellen en extracellulaire matrix maakt het onderscheid tussen intra- en extracellulaire gebieden moeilijk. De toegepaste ratiometrische kleurstof bleek betrouwbaar te visualiseren 15 bacteriële species geassocieerd met tandheelkundige biofilm, en allemaal vlekken bacteriecellen in tandheelkundige biofilms gekweekt in situ 11. Hoewel het waarschijnlijk is dat deratiometrische kleurstof een universele bacteriële vlek, dit is nog niet bewezen en de vlek moet worden getest op biofilms uit andere habitats dan de mondholte. De methode niet toe om technische replica van een bepaald pH-meting, produceren beeldacquisitie duurt enige seconden en biofilm pH verandert dynamisch. Repeterend afbeelden van biofilm-vrije bufferoplossingen, echter, en repeterend afbeelden van biofilms in buffer leverde stabiele pH-waarden (data niet getoond).
Alle stappen van de hierboven beschreven procedure voor beeldverwerking nauwkeurig worden gevolgd. Biofilm beelden worden verkregen met voldoende laservermogen / gain adequate fluorescent signaal in de extracellulaire matrix te verkrijgen, maar overbelichting van bacteriële cellen moet worden vermeden. Als bacteriecellen worden overbelicht (te hoog laservermogen of toename) grotere gebieden dan eigenlijk onder bacteriën worden als objecten tijdens beeldsegmentatie en een deel van de extracellulaire ruimte verlorenpH berekenen (zie figuur 3B). Aan de andere kant, als de beelden werden met zeer lage laservermogen / gain, fluorescentie-intensiteit in de extracellulaire ruimte niet volstaan betrouwbare berekening van groen / rood emissieverhoudingen zijn. Een bereik indicator instrument in de microscoop software kunnen worden gebruikt om de microscoop instellingen, zodat bacteriecellen worden vastgelegd met maximale intensiteit, maar zonder overbelichting. Geautomatiseerde beeldsegmentatie worden gecontroleerd voor biofilm afbeeldingen te zorgen dat alle bacteriën en, indien aanwezig, eukaryotische cellen worden herkend als objecten door de software. Na segmentatie moeten alle biofilm beelden vergeleken worden een voor een naar de respectieve gesegmenteerde beelden congruentie bepalen tussen de bacteriële biomassa en de waarde die als objecten area. Als grotere gebieden dan die waarop bacteriën worden erkend als objecten de helderheid drempel is te laag voor een nauwkeurige differentiatie en segmentatie moeten worden uitgevoerd met een higher lichtsterktedrempel. Als een deel van de bacteriële biomassa is niet onder de voorwerpen, moet de helderheid drempel worden verlaagd tot een juist onderscheid tussen extracellulaire en intracellulaire ruimte opleveren. Voor de analyse van grote datasets is het voordelig gebleken segment alle afbeeldingen met een rij van verschillende lichtsterktedrempels en vervolgens het ideale drempel voor elk beeld te bepalen. Zodra een correcte onderscheid tussen bacteriën en extracellulaire matrix wordt bereikt, geen verdere problemen tijdens beeldverwerking te verwachten. Er kunnen echter een aantal beelden met een zeer dichte biofilm, waarbij bacteriën de gehele microscopische gezichtsveld. In deze beelden, natuurlijk, extracellulaire pH kan worden bepaald. In sommige gevallen kan het probleem worden opgelost door het ophalen van afbeeldingen in een iets andere z-vlak, waarbij de bacteriële biomassa het gehele gezichtsveld niet dekt.
Verdere toepassingen van extracellulaire pH ratiometry misschien studerenpH landschappen in andere microbiële gemeenschappen dan tandheelkundige biofilms (bijv. Pseudomonas aeruginosa biofilms of stroom-producerende bacteriën biofilms). Het effect van verschillende ecologische parameters, zoals zuurstofconcentratie, koolhydraattoevoer of toepassing van elektrische stroom op biofilm pH kan worden bepaald. De invloed van biofilm leeftijd biofilm dikte en metabolische activiteit van de pH kunnen worden onderzocht, evenals het effect van pH modulerende middelen op bacteriële biofilms. Dit laatste is vooral relevant in de context van tandheelkundige biofilms, waarin buffermiddelen een veelbelovende therapeutische benadering van tandcariës 15 regelen. Bovendien moet toekomstig onderzoek gericht op het toepassen van de gepresenteerde methode onder stroom omstandigheden. Tot op heden extracellulaire pH ratiometry is alleen gebruikt om de pH onder statische voorwaarden wordt voldaan. Constante toevoer van vers zuurstofrijk medium is waarschijnlijk een aanzienlijke invloed op de ontwikkeling van de pH micro-omgevingen en hebben, inVooral verticale pH gradiënten binnen dunne biofilms. De klaring van zuren door medium stroom zou kunnen bijdragen aan de totstandkoming van verticale gradiënten zelfs in zeer dunne biofilms.
Ratiometrische confocale microscopische beeldvorming met de ratiometrische kleurstof C-SNARF-4 in combinatie met nauwkeurige nabewerking van de verkregen digitale beelden toelaat berekenen en visualiseren biofilm pH in de extracellulaire matrix, in real time, in het pH gebied tussen 4,5 en 7,0 en tot een biofilm dikte van 75 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag bedanken Javier E. Garcia en Lene Grønkjær voor technische bijstand en Merete K. Raarup voor vruchtbare discussies. Dit werk werd gefinancierd door Aarhus University Research Foundation en de Simon Spies Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B.
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
