Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme

Summary

Ein pH-sensitive ratiometrisch Farbstoff wird in Kombination mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und digitale Bildanalyse zur Überwachung der extrazellulären pH in der dentalen Biofilme in Echtzeit verwendet.

Abstract

Der pH-Wert in der bakteriellen Biofilmen auf den Zähnen ist von zentraler Bedeutung für die Zahnkaries, eine Krankheit mit einer hohen Prävalenz weltweit. Nährstoffe und Metaboliten sind nicht gleichmäßig in der dentalen Biofilm verteilt. Ein komplexes Zusammenspiel von Sorption und Reaktion mit organischen Stoffen im Biofilm reduziert die Diffusionswege von gelösten Stoffen und schafft Steigungen von reaktiven Molekülen, einschließlich organische Säuren, über den Biofilm. Quantitative Fluoreszenz mikroskopische Methoden, wie Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebung oder pH ratiometrischen können pH in unterschiedlichen Mikroumgebungen von dentalen Biofilmen zu visualisieren eingesetzt werden. pH ratiometrischen nutzt eine pH-abhängige Verschiebung in der Fluoreszenzemission von pH-empfindlichen Farbstoffen. Berechnung des Emissionsverhältnis bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen erlaubt die Bestimmung lokaler pH in mikroskopischen Bildern, unabhängig von der Konzentration des Farbstoffes. Im Gegensatz zu der Technik Mikroelektroden erlaubt sowohl vertikale als auch horizontale pH-Gradienten in Echtzeit-Überwachung mitaus mechanisch stören den Biofilm. Allerdings muss darauf geachtet werden genau zwischen extra- und intrazellulären Kompartimenten des Biofilms zu unterscheiden genommen werden. Hier ist die ratiometrisches Farbstoff, seminaphthorhodafluor-4F 5- (und-6) Carbonsäure (C-SNARF-4) verwendet wird , extrazellulären pH - Wert in in vivo gewachsen dentaler Biofilme unbekannter Artenzusammensetzung zu überwachen. Bei der Belichtung des Farbstoffes auf Glucose ist up-konzentriert innerhalb aller Bakterienzellen in den Biofilmen; Es ist somit sowohl als universelle bakterielle Flecken und als Marker des extrazellulären pH verwendet wird. Nach konfokalen mikroskopischen Bildaufnahme wird der Bakterienbiomasse aus allen Bildern mittels digitaler Bildanalyse-Software, entfernt, die extrazelluläre pH ausschließlich berechnen es erlaubt. pH ratiometrischen mit dem ratiometrisch Farbstoff ist gut geeignet extrazellulären pH in dünnen Biofilms von bis zu 75 & mgr; m Dicke zu untersuchen, wird jedoch auf den pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 begrenzt.

Introduction

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht im Bereich zwischen 4,5 und 7, mit der ratiometrisches Farbstoff in Kombination seminaphthorhodafluor-4F 5- (und-6) Carbonsäure (C-SNARF-4) in der dentalen Biofilm extrazellulären pH-Überwachung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie und Digitalbildanalyse. Der verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist pH-empfindlich und zeigt eine Verschiebung in der Fluoreszenzemission über den Stand der Protonierung abhängig. Die Fluoreszenzemission der protonierten Molekül - Peaks bei 580 nm und die Emission des deprotonierten Moleküls bei 640 nm ^1. Das Verhältnis der Fluoreszenzemissionsintensitäten in zwei Detektionsfenster aus den beiden Emissionsspitzen (576-608 nm und 629-661 nm) reflektiert somit pH in der flüssigen Phase, und zwar unabhängig von der Farbstoffkonzentration. Mit einem pK _a von ~ 6,4 ist der Farbstoff geeignete pH in mäßig sauren Umgebungen zu visualisieren.

PH in bakterielle Biofilme ist von zentraler Bedeutung für alle Stoffwechselprozesse.Im Falle von Zahn Biofilmen, pH in der extrazellulären Matrix ist der Schlüssel Virulenzfaktor für die Entwicklung von Zahnkaries. Verlängerte mit niedrigem pH - Wert an der Biofilm-Zahn - Schnittstelle führen zu verlangsamen Entmineralisierung des zugrunde liegenden Schmelz ^2. Aufgrund der komplexen dreidimensionalen Architektur von Biofilmen, Metaboliten, einschließlich organische Säuren, sind nicht gleichmäßig über den Biofilm verteilt. Hoch und weniger acidogene Mikroumgebungen kann ³ in enger räumlicher Nähe zu finden.

Seit Jahrzehnten vertikale pH - Gradienten in Biofilme wurden mit Hilfe von Mikroelektroden ^4-6 aufgezeichnet. Während sie eine gute räumliche Auflösung aufgrund ihrer geringen Größe Spitze bieten, sind sie nicht gut geeignet horizontalen Gradienten zu überwachen. Außerdem Einführen der Elektrode stört die mechanisch Biofilm. Quantitative Fluoreszenz mikroskopischer Techniken bieten den Vorteil der pH-Änderungen in verschiedenen Bereichen eines Biofilms Visualisierung ohne mechanische interferierennce. Verschiedene mikroskopische Sichtfelder können frei gewählt werden und immer wieder über längere Zeiträume ^1,7-9 abgebildet. Wenn jedoch mikroskopische Biofilm Bilder interpretieren, ist es wichtig, zwischen Fluoreszenz zu unterscheiden von der mikrobiellen Biomasse und Fluoreszenz aus dem extrazellulären Raum Ableitung abzuleiten. Unter sauren Bedingungen, pH innerhalb Bakterienzellen unterscheidet sich von pH in der extrazellulären Matrix, wie die Bakterien aktiv ¹⁰ Protonen über die Zellmembran auf Kosten von Adenosintriphosphat transportieren. Im Zusammenhang mit der Zahnkaries, intrazelluläre bakterielle pH-Wert hat keinen direkten Einfluss auf die zugrunde liegenden Schmelz während niedrige extrazellulären pH-Wert auf Entmineralisierung führt. Averaging pH-Wert in mikroskopischen Bildern, die sowohl bakterienfreie Zonen und Bakterien enthalten führt zu falschen Ergebnissen. Die Verwendung anderer Flecken zusammen mit dem pH-empfindlichen Farbstoff, um die bakterielle Biomasse und differenzieren zwischen extra- und intrazellulären Bereiche bringt ab zu visualisierenaus dem Risiko einer fluoreszierenden Kontamination des extrazellulären Raum und falsche Messungen ^11.

Die vorliegende Manuskript beschreibt daher die Verwendung des ratiometrisches Farbstoff in einer Doppelfunktion; sowohl als pH-Marker und als universelle bakterielle Fleck. Da der Farbstoff up konzentrierter in Bakterienzellen ist, erlaubt die Kombination von konfokalen mikroskopischen Abbildungs ​​und ein genaues digitales Bildanalyseverfahren die Bestimmung der extrazellulären pH-Wert im Bereich zwischen 4,5 und 7,0 in dünnen dental Biofilmen.

Protocol

Das experimentelle Protokoll wurde von der Ethikkommission der Aarhus County (M-20100032) überprüft und genehmigt.

1. Konfokalmikroskopische Kalibrierung des Ratiometrisch Dye

1. Für die Bildaufnahme, ein umgekehrtes konfokalen Mikroskop mit einem Inkubator, eine 63X / 1.2-numerische Apertur Wassertauchziel, eine 543 nm Laserlinie und ein META-Detektor ausgestattet verwenden.
2. Bereiten Sie HEPES-Puffer-Stammlösungen (50 mM, eingestellt auf pH 4,5 bis 8,5 in Schritten von 0,1 pH-Einheiten). Je 100 & mgr; l jeder Lösung in die Vertiefungen einer klaren Boden 96-Well-Platte für Fluoreszenzmikroskopie.
3. Tragen Sie Handschuhe aus Nitril, wenn die ratiometrisch Farbstoff Handhabung C-SNARF-4. Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung des Farbstoffs in Dimethylsulfoxid. In 5 ul der Stammlösung in jede Vertiefung mit HEPES-Puffer. Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Mikroskop.
4. Schalten Sie das Mikroskop. Öffnen Sie die Mikroskop-Software. Klicken Sie auf die folgenden Panels: Erfassung → Laser; Erwerben → Micro; Erwerben → Config; Erwerben → Scannen; Erwerben → Bühne. Warm up den Inkubator auf 37 ° C.
5. Schalten Sie den 543-nm-Laserlinie durch Klicken auf die 543-nm-Laser und dem "On" Taste in der "Laser Control" Fenster. Wählen Sie das 63X / 1.2-numerische Apertur Wassertauchziel in der "Microscope Control" Fenster.
6. Stellen Sie den META-Detektor gleichzeitig überwachen Fluoreszenz innerhalb 576- bis 608-nm (grün) und 629- bis 661 nm (rot) Intervalle ( "Configuration Control" → "ChS"). Stellen Sie die Laserleistung ( "Configuration Control" → "Anregung"). Stellen Sie die Pinhole eine optische Schichtdicke von 1,6 um ( "Scan Control" → "Pinhole") zu erhalten.
7. Erwerben Sie ein Bild jedes HEPES-Pufferlösung, 5 & mgr; m über dem Glasboden der 96-Well-Platte. Hinweis: Sobald der Fokusebene unter dem Glasboden gelegen ist, kann kein Fluoreszenzlicht zu sehenauf dem Bildschirm. Nach jedem dritten Bild, stellen Sie die Laserleistung ein Bild für Untergrundsubtraktion auf Null und nehmen.
8. Führen Sie die Kalibrierung Experiment in dreifacher Ausfertigung (1,2-1,7).
9. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität und Standardabweichung in allen roten und grünen Bilder.
   1. Berechnen des Verhältnisses R und Standardfehler des Mittelwerts, S _R, für jedes Bild entsprechend den Gleichungen (1) und (2)
      (1)
      (2)
      g, r, s und s _{g r} sind die Mittelwerte und Standardabweichungen in den jeweiligen grünen und roten Bilder. b _g, b _r, s und s _{br bg} die entsprechenden Werte für den Hintergrundbildern werden. n 2 ist die Anzahl der Bildpunkte abgebildet werden .
   2. Plotten die berechneten Verhältnisse für jeden pH - Wert aus den drei Wiederholungskalibrierungsexperimente in einem Diagramm und bauen eine angepasste Kurve aus dieser Serie von Datenpunkten (dh unter Verwendung der Software SigmaPlot 13). Machen Sie eine mathematische Funktion aus der angepassten Kurve , die Verhältnisse in pH - Werten ¹⁰ umwandeln kann.

2. Sammlung von In Situ Grown Dental Biofilm Proben

1. Wählen Freiwilligen, die Ein- und Ausschlusskriterien für die Studie relevante erfüllen. Machen Sie Alginatabdrücke ihrer oberen und unteren Zahnbogen. Machen Sie Gussmodelle aus diesen Eindrücken und Produktion eines Acryl Schiene im Unterkiefer. Gestalten Sie die Schiene mit Wangen Acryl-Flansche durch eine linguale orthodontischen Draht verbunden , dass die Freiwilligen ¹² beißen in die normale Okklusion ermöglicht.
2. Drill Rezessionen in den bukkalen Flansche der Acryl-Schiene (Abbildung 1
3. Für Biofilm Sammlung verwenden maßgeschneiderte nicht fluoreszierenden Glasplatten (4 x 4 x 1 mm ³⁾ mit einer Oberflächenrauheit von Körnung 1200 , um ¹¹ , um die Kolonisierung Muster auf natürlichen Zahnschmelz zu imitieren.
4. Sterilisieren der Glasplatten durch Autoklavieren vor der Montage. Montieren Sie die Glasplatten mit Klebewachs in den Vertiefungen in den bukkalen Flansche jeder Seite leicht auf der Oberfläche der Acryloberfläche vertieft , um den Biofilm von Scherkräften durch die Bewegung der Wangen ¹¹ ausgeübt zu schützen.
   Anmerkung: Die Zahl der Glasplatten in eine Rezession gestellt wird, kann zwischen 3 und 14, je nach dem Ziel der Studie variieren.
5. Stecken Sie das Gerät in den Mund des Freiwilligen. Weisen Sie den ehrenteer das Gerät intraoral über den Versuchszeitraum zu behalten. Weisen Sie den Freiwilligen das Gerät in einer orthodontischen Haltebehälter zu speichern, mit einem Stück feuchten Papiertuch (zu halten es feucht) bei Raumtemperatur während des Zähneputzens und Aufnahme von Nahrung und Getränken, ausgenommen Wasser. Weisen Sie den Freiwilligen nicht die Mund Acryl-Flansche mit den Glasplatten berühren beim Platzieren und das Gerät zu entfernen.
   Hinweis: Die Versuchsdauer kann je nach dem Ziel der Studie (ein Tag bis zu mehreren Wochen).
6. die Glasplatten aus dem Gerät am Ende des Versuchszeitraums sorgfältig entfernen. Entfernen Sie die Klebewachs um die Platten mit einem Messer und übertragen sie mit einer Pinzette in einen geschlossenen Behälter, der Biofilm nach oben zeigt, bis mikroskopische Analyse. Halten Sie den Behälter mit nassen Papiertuch feucht. Führen pH-Bildgebung innerhalb von wenigen Stunden nach der Biofilm-Sammlung.

3. Biofilm pH Imaging

1. BereitenSpeichel Lösung von Dithiothreitol zu gesammelten Speichel nach der Methode von de Jong et al Zugabe. ^13. Titrieren der Speichellösung auf pH 7,0 und Zugeben von Glukose zu einer Konzentration von 0,4% (wt / vol). Je 100 & mgr; l pro Biofilm für die Mikroskopie in einem Glasboden-96-Well-Platte analysiert werden. In 5 ul des ratiometrischem Farbstoff pro Vertiefung.
2. Legen Sie die 96-Well-Platte auf dem Mikroskoptisch. Schalten Sie das Mikroskop und die 543-nm-Laserlinie. Warm up den Inkubator auf 37 ° C. Verwenden Sie die gleichen Mikroskopeinstellungen wie für die Kalibrierung des Farbstoffs (siehe Schritte 1,5-1,6). Warten für 30 Minuten, bis die 96-Well-Platte Arbeitstemperatur erreicht hat.
3. Pick-up eine oder mehrere Glasplatten mit einem dünnen Satz von Pinzette und legen Sie sie in den Speichel gefüllten Brunnen, eine Platte pro Vertiefung mit den Biofilmen nach unten zeigt.
4. Erwerben Sie einzelne Bilder ( "Scan Control" → "Single") oder z-Stapel ( "Scan Control" → "Start") spanning die Tiefe der Biofilme in verschiedenen Bereichen. z-Stapel wählen die Anzahl der Scheiben zu erwerben abgebildet werden soll ( "Scan Control" → "Z Einstellungen" → "Num Slices") und markieren Sie die z-Position für die erste und die letzte Schicht in der Mikroskop-Software ( "Scan Control "→" Z Einstellungen "→" Mark First "," Mark Last ").
   Anmerkung: Z-Stapel mit einer Tiefe von bis zu 75 & mgr; m können mit gutem Kontrast zwischen extra- und intrazellulären Bereichen erworben werden.
5. Zur pH-Änderungen in einem mikroskopischen Sichtfeld im Laufe der Zeit, markieren Sie die xy-Position in der Mikroskop-Software ( "Stage und Fokussteuerung" → "Mark Pos") und nehmen Sie wiederholt Bilder zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten ( "Scan Control" → "folgen Single"). nehmen Sie regelmäßig Bilder mit der Laserleistung auf Null für Untergrundsubtraktion gesetzt.

4. Digitale Bildanalyse

1. Um export die mikroskopischen Bilder als TIF-Dateien, indem Sie die Datei Batch-Export des Mikroskop-Software ( "Macro" → "Datei-Export"). Markieren Sie die Dateien exportiert werden und speichern roten und grünen Kanal Bilder in separaten Ordnern als TIF-Dateien ( "Start-Export"). Benennen Sie die Dateien in beiden Ordnern ihnen fortlaufenden Nummern geben.
2. Importieren Sie die roten und grünen Bildserien in Software wie Daime (digitale Bildanalyse in der mikrobiellen Ökologie) ^14. Segment die grünen Kanalbilder mit individuell ausgewählten Helligkeitsschwellen (Segment → Automatische Segmentierung → Benutzerdefinierte Schwelle). Wählen, um die Helligkeitsschwellen vorsichtig (in der Regel zwischen 20 und 80), so dass alle Bakterien (heller als die extrazelluläre Matrix), nicht aber die Matrix wird als Objekte bei der Segmentierung erkannt werden. Überprüfen Sie visuell, dass die Bereiche als Objekte erkannt entsprechen gut auf die bakterielle Biomasse.
3. Übertragen Sie die Objektschicht des segmentierten green Kanalbilder mit den entsprechenden roten Kanal Bilder (Segment → Übertragung Objektschicht). Verwenden Sie den Objekt-Editor-Funktion zu verwerfen und alle Objekte in den roten und grünen Kanal Bilder zu löschen. Jetzt nur die extrazelluläre Matrix wird in der Biofilm Bilder gelassen. Exportieren Sie die verarbeiteten Bildserie als TIF-Dateien.
4. Importieren Sie die Bilderserie in ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität in den Hintergrundbildern mit dem Laser genommen ausgeschaltet (Analyse → Histogramm). Ziehen Sie den entsprechenden Hintergrund von den roten und grünen Bilder (Process → Math → subtrahieren).
5. Noch in ImageJ, teilen Sie die grüne Bilderserie (G1) mit sich selbst (Bild Rechner Prozess →). Dann multiplizieren Sie das resultierende Bild-Serie (G2) mit dem grünen Bild-Serie (G1). Dies wird eine Bildserie (G3) ergeben, wobei NaN allen Pixeln zugewiesen gehört zu den Bereichen, die als Objekte in daime erkannt wurden. Gehen Sie in ter dieselbe Weise mit der roten Bildreihe (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3).
   Hinweis: Da die bakterielle Biomasse aus den Bildern in Schritt 4.3, die Fluoreszenzintensität 0 ist in diesen Bereichen entfernt wurde. Schritt 4.5 ist notwendig, den Wert 0 bis NaN zu konvertieren, die in Schritt 4.6 für Verhältnisberechnung ermöglicht.
6. Übernehmen Sie die 'mean' Filter (Process → Filter → Mittelwert; Radius: 1 Pixel) für Detektorrauschen zu kompensieren. Teilen Sie die grüne Bild Serie durch die rote Bildserien (Prozess → Bildrechner). Dies führt zu einer Grün / Rot-Verhältnis für jeden verbleibenden Pixel in den extrazellulären Raum der Bilder. Verwenden Sie falsche Farbgebung für die grafische Darstellung der Verhältnisse in den Bildern (Bild → Lookup-Tabellen). Berechnen Sie die mittlere Verhältnis für jedes Bild (Analyse → Histogramm).
7. Konvertieren Sie die grün / rot-Verhältnisse auf pH-Werte entsprechend der Funktion unter 1.9.2 eingebaut). Hinweis: Ein Beispiel für die Kalibrierungsdaten und angepassten Kurve in Schlafer et gesehen werdenal, 2015 ^11.

Representative Results

Das vorgestellte Verfahren ermöglicht die Überwachung der extrazellulären pH-Wert fällt in unterschiedlichen Mikroumgebungen von dentalen Biofilmen im pH-Bereich von 4,5 bis 7 in real-time. Wenn die Versuchsbedingungen gewählt werden, wie oben beschrieben, beginnt pH kurz in allen Bereichen der Biofilme zu fallen nach Exposition gegenüber Glucose.

Wenn der pH in einem Biofilm abfällt, werden Bakterienzellen sichtbar innerhalb kurzer Zeit (<1 min), da die ratiometrisch Farbstoff in den Zellen (2A) upconcentrated wird. In der ersten Stunde, bevor die Säureproduktion in den Biofilm beginnt, kann kein Unterschied zwischen Hintergrund und Zellen erkennbar. Bilder in die Software daime exportiert haben mit individuell ausgewählten Helligkeitsschwellen, um eine gute Übereinstimmung zwischen der bakteriellen Biomasse in den Bildern und Objekten durch das Programm (2B) anerkannt zu erhalten segmentiert werden. Wenn segmentiert entsprezüglich entfernt Löschen von Objekten in daime alle Fluoreszenzsignale , die aus Bakterienzellen (Abbildung 2C) abzuleiten. Nachfolgende Bildverarbeitung in ImageJ ergibt Grün / Rot-Verhältnisse für die Pixel in den extrazellulären Raum der Bilder. Mit Hilfe der Eichkurve können diese Verhältnisse auf pH - Werte und visualisiert mit falschen Färbung zur grafischen Darstellung (2D) umgewandelt werden. Durchschnittliche pH - Wert kann für jedes der verarbeiteten Bilder berechnet werden, und die pH - Entwicklung über die Zeit (2E) folgen. pH-Tropfen können zwischen verschiedenen mikroskopischen Sichtfelder unterscheiden und sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten überwacht werden kann. Jedoch unter statischen Bedingungen, innerhalb dünnen Biofilmen, nur geringe vertikale pH-Gradienten beobachtet werden kann.

In einigen Fällen kann die gesamte mikroskopische Sichtfeld mit Bakterienzellen abgedeckt werden, die Berechnung der extrazellulären rendertpH unmöglich (3A). Das Problem kann durch die Wahl einer etwas anderen Fokusebene gelöst werden. Es muss darauf geachtet werden , nicht die mikroskopischen Bilder zu überbelichten, weil die bakterielle Biomasse in den Bildern dann eine größere Fläche bedeckt als in der Realität (3B). Wenn das Bild in daime Segmentieren ist es entscheidend , Helligkeitsschwellen zu wählen , die alle Bakterienzellen und, falls vorhanden, humanen Epithelzellen (3C) als Objekte erkennen. Wenn Segmentierung wird mit einem zu hohen Helligkeitsschwellen durchgeführt wird , wird die intrazelluläre Bereiche im pH - Berechnung einbezogen werden und führen zu fehlerhaften Ergebnissen (3D). Überwachung der extrazellulären pH-Werts mit dem ratiometrisch Farbstoff wird durch die Verwendung der konfokalen Mikroskopie beschränkt. Bis zu einer Eindringtiefe von 75 um, extra- und intrazelluläre Bereiche zuverlässig (Figur 3E) zu unterscheiden. Zur Messung der vertikalen pH-Gradienten in dicker Biofilmen, bleiben die Mikroelektroden erfüllthod der Wahl.

Abbildung 1:.. Acryl Splint für intraorale Biofilm - Sammlung Die Schiene mit Wangen Acryl-Flanschen verbunden durch eine linguale orthodontischen Draht ausgelegt ist , dass die Freiwilligen in den normalen Okklusion zu beißen können Sie hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Bildverarbeitung für die mikroskopische Messung der extrazellulären Biofilm pH - Wert (A) Konfokalmikroskopische Bild eines Biofilms mit dem ratiometrisches Farbstoff gefärbt, 9 min nach der Exposition auf Glukose. Die bakterielle Biomasse im Bild kann aus dem extrazellulären Hintergrund zu unterscheiden. (B) Das gleiche Bild nach der Segmentierung in daime. Das gesamte bakterielle Biomasse im mikroskopischen Sichtfeld wurde als Objekte während Segmentierungs erkannt, wie es durch die orange Linien angedeutet ist. (C) Das gleiche Bild nach dem Entfernen der bakteriellen Biomasse. Alle Fluoreszenz aus Bakterienzellen abgeleitet wurde entfernt, und nur die Fluoreszenz von der extrazellulären Matrix abgeleitet ist im Bild nach links. (D) Grafische Darstellung des extrazellulären pH in der gleichen mikroskopischen Gesichtsfeld. Grün / Rot-Verhältnisse wurden berechnet in ImageJ und falsche Färbung wurde für die grafische Darstellung von extrazellulären pH-Wert aufgetragen. Durchschnittliche extrazellulären pH-Wert = 5,86. (AD) Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. (E) Durchschnitts pH - Abfall in der gleichen mikroskopischen Sichtfeld für 15 min überwacht. Der pH-Abfall in diesem Bereich des Biofilms ist schnellste am Anfang, kurz nach der Einwirkung von Glucose. Dann bremst sie aber nicht ein Plateau innerhalb der Beobachtungszeit erreichen.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3:. Mikroskopische Messung der extrazellulären Biofilm pH - Mögliche Probleme und Fehler (A) Konfokalmikroskopische Bild eines dichten Biofilm ausgesetzt mit dem ratiometrisches Farbstoff Glukose und gefärbt. In dieser mikroskopischen Gesichtsfeld, wird das gesamte Bild mit Bakterienzellen bedeckt, und Entfernen der Bakterien nicht extrazellulären Bereiche für pH Berechnung verlassen. (B) Überbelichtet konfokalmikroskopische Bild eines Biofilms mit dem ratiometrisches Farbstoff gefärbt. Während der Bildsegmentierung überbelichtet Bilder größere Flächen als tatsächlich von Bakterien bedeckt werden als Objekte und ein Teil des extrazellulären Raum ist für die pH-Berechnung verloren erkannt. (C) bioFilm Bild mit Epithelzellen (Pfeile). Helligkeitsschwellen zur Bildsegmentierung muss gewählt werden, so dass Epithelzellen als Objekte erkannt werden und von den Bildern vor der pH-Berechnung entfernt. (D) Das gleiche Biofilm Bild wie in 1B, mit einem falschen Helligkeitsschwelle segmentiert. Teil der bakteriellen Biomasse wird nicht als Objekte erkannt und kann nicht aus dem Bild entfernt werden. Dies führt zur Aufnahme von intrazellulären Bereiche im pH-Berechnung und damit zu fehlerhaften Ergebnissen. (E) tiefe Schicht eines Biofilms mit dem ratiometrisches Farbstoff gefärbt. Das Bild wurde 90 & mgr; m aus dem Biofilm-Substrat-Schnittstelle erworben. Eine Differenzierung zwischen extra- und intrazellulären Bereichen gefährdet ist. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Mikroskopischen Überwachung von Biofilm pH bietet mehrere Vorteile, wie ^4-6 Elektrode oder Mikroelektroden - Messungen verglichen. Die mikroskopische Techniken erlauben pH-Wert mit einer hohen räumlichen Auflösung zu bestimmen und ermöglichen sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten in Biofilmen Erfassung ohne den Biofilm mechanisch zu stören. Frühere Versuche von mikroskopisch kleinen pH - Überwachung gelang es jedoch nicht , zwischen extra- und intrazellulären pH - Wert in den Biofilmen ^1,7,9 zu unterscheiden. Durch bakterielle Homöostase unterscheidet intrazellulären pH von extrazellulären pH-Wert und pH-Berechnungen nicht gültig, wenn beide intra- und extrazellulären Kompartimenten zu der aufgezeichneten Fluoreszenzemission beitragen. Die Verwendung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoff zusammen mit dem pH-empfindlichen Farbstoff bakteriellen Zellen sichtbar zu machen, ist problematisch, da selbst eine kleine Überlappung zwischen den Emissionsspektren der Farbstoffe kann die Quantifizierung von Fluoreszenzlicht beeinträchtigen. Deshalb ist die Technik, die hier vorgestelltberuht auf einem Konzentrationsgradienten des Farbstoffs ratiometrisch zwischen extra- und intrazellulären Kompartimenten des Biofilms zu identifizieren und später Bakterienzellen aus den erfassten pH Bilder entfernen.

Nach Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Bakterienzellen in Biofilmen internalisieren und auf konzentriert, um das Molekül, aber nur unter sauren Bedingungen. pH ratiometrischen mit dem Farbstoff wird daher der pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 begrenzt. Bei pH-Werten oberhalb von 7, die unprotonierte und somit geladene Farbstoff dringt nicht Bakterienzellen gut genug, um sie aus dem extrazellulären Hintergrund zu unterscheiden, und bei pH-Werten unterhalb von 4,5 die meisten der Farbstoffmoleküle sind protonierte und keine weiteren Veränderungen in der Fluoreszenzemission kann beobachtete. Die angepasste Kurve (pH vs. Verhältnis grün / rot) am steilsten ist um pH 6 und abflacht auf pH 4,5. Ein Beispiel ist in Schlafer et al., 2015 Abbildung S2. ¹¹ Derzeit ist die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs für pH ratiometrischen ist begrenzt aufÜberwachung extrazellulären pH ^1. Im Prinzip könnte der Farbstoff auch zur Überwachung intrazellulärer bakterieller pH-Änderungen verwendet werden, aber bisher wurde die Kalibrierung nicht für die intrazelluläre Anwendung durchgeführt wurde. Zusätzlich wäre es schwierig, genau zwischen den intrazellulären Fluoreszenzemission und Fluoreszenzlicht Herleiten von Farbstoffmolekülen an der Außenseite der bakteriellen Zellwand befestigt zu unterscheiden. Außerdem ist, wie Färbung mit dem ratiometrisches Farbstoff in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie verwendet wird, die Bildaufnahme in der Biofilmschichten tiefer als 75 & mgr; m von der Abdeckung Glas / Biofilm-Schnittstelle beeinträchtigt wird. Eine Verringerung Kontrast zwischen Bakterienzellen und der extrazellulären Matrix macht die Unterscheidung zwischen intra- und extrazellulären Bereichen schwierig. Der verwendete Farbstoff ratiometrischem wurde zuverlässig 15 mit Zahn Biofilm assoziierten Bakterienarten gezeigt zu visualisieren, und es färbt alle Bakterienzellen in der dentalen Biofilm in situ gezüchtet ^11. Während es wahrscheinlich ist, dass dasratiometrisch Farbstoff ist eine universelle bakterielle Flecken, hat dies noch nicht bewiesen worden, und der Fleck auf Biofilme von anderen Habitaten als der Mundhöhle getestet werden muss. Das Verfahren ermöglicht nicht technische Replikate eines bestimmten pH-Messung zu erzeugen, wie die Bildaufnahme einige Sekunden und Biofilm pH nimmt dynamisch ändert. Wiederholte Abbildung des Biofilms freien Pufferlösungen, jedoch und wiederholte Abbildung von Biofilmen in Puffer ergab stabile pH-Werte (Daten nicht gezeigt).

Alle Schritte des oben beschriebenen Verfahrens zur Bildverarbeitung müssen genau eingehalten werden. Biofilm Bilder müssen mit ausreichender Laserleistung / Gewinn erworben werden, um ausreichende Mengen an Fluoreszenzsignal in der extrazellulären Matrix zu erhalten, aber eine Überbelichtung von Bakterienzellen zu vermeiden. Wenn Bakterienzellen überbelichtet (zu hohe Laserleistung oder Verstärkung) größere Flächen als tatsächlich von Bakterien bedeckt werden als Objekte während der Bildsegmentierung und ein Teil des extrazellulären Raum erkannt wird verlorenfür pH - Berechnung (siehe 3B). Auf der anderen Seite, wenn Bilder mit sehr niedrigen Laserleistung / Gewinn erworben werden, Fluoreszenzintensität in den extrazellulären Raum für eine zuverlässige Berechnung der grün / rot Emissionsverhältnisse möglicherweise nicht ausreichend sein. Ein Bereichsanzeige Werkzeug in der Mikroskop-Software kann verwendet werden, um die Einstellungen des Mikroskops zu justieren, so dass bakterielle Zellen mit maximaler Intensität erfasst werden, jedoch ohne Überbelichtungen. Automatische Bildsegmentierungs muss für alle Biofilm Bilder gesteuert werden, um sicherzustellen, dass alle Bakterien und, falls vorhanden, sind eukaryotische Zellen als Objekte von der Software erkannt. Nach der Segmentierung sollten alle Biofilm Bilder nacheinander auf die jeweiligen Bilder unsegmented Kongruenz zwischen der bakteriellen Biomasse und den Bereich als Objekte erkannt zu ermitteln verglichen werden. Wenn größere Flächen als die von Bakterien bedeckt diejenigen erkannt werden als Objekte der Helligkeitsschwelle für eine genaue Differenzierung zu gering ist, und die Segmentierung muss mit einem hallo durchgeführt werdengher Helligkeitsschwelle. Wenn ein Teil der bakteriellen Biomasse nicht unter den Objekten, muss die Helligkeitsschwelle gesenkt werden, um eine korrekte Differenzierung zwischen extra- und intrazellulären Raum zu erhalten. Für die Analyse von großen Datenmengen hat es alle Bilder mit einer Reihe von unterschiedlichen Helligkeitsschwellen als vorteilhaft erwiesen Segment und anschließend die ideale Schwelle für jedes Bild bestimmen. Sobald eine korrekte Unterscheidung zwischen Bakterien und extrazellulären Matrix erreicht ist, werden keine weiteren Probleme bei der Bildverarbeitung zu erwarten. Es kann jedoch sein, einige Bilder mit einem sehr dichten Biofilm, in dem Bakterien das gesamte mikroskopische Sichtfeld abdecken. In diesen Bildern Offensichtlich kann extrazelluläre pH-Wert nicht bestimmt werden. In manchen Fällen kann das Problem durch Erfassung von Bildern in einer etwas anderen z-Ebene aufgelöst werden, wobei die bakterielle Biomasse nicht das gesamte Sichtfeld abdeckt.

Weitere Anwendungen von extrazellulären pH ratiometrischen könnte sein, zu studierenpH - Landschaften in anderen mikrobiellen Lebensgemeinschaften als dentaler Biofilme (dh. Pseudomonas aeruginosa Biofilme oder Strom produzierenden bakteriellen Biofilmen). Die Wirkung von verschiedenen ökologischen Parameter, wie Sauerstoffkonzentration, Kohlenhydratzufuhr oder Anwendung von elektrischem Strom auf Biofilm pH könnte bestimmt werden. Der Einfluss von Biofilm Alter, Biofilmdicke und Stoffwechselaktivität auf pH könnten, sowie die Wirkung von pH Modulationsmittel auf bakterielle Biofilme zu untersuchen. Letzteres ist besonders relevant im Zusammenhang mit Zahn Biofilmen, wobei Puffermittel einen vielversprechenden Therapieansatz dar ¹⁵ Karies zu steuern. Darüber hinaus sollten künftige Forschung darauf konzentrieren, die vorgestellte Methode unter Strömungsbedingungen Anwendung. Bis heute hat der extrazellulären pH-ratiometrischen nur verwendet worden, pH-Wert unter statischen Bedingungen zu überwachen. Konstante Versorgung mit frischem Sauerstoff angereichertes Medium ist wahrscheinlich erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklung des pH-Mikroumgebungen und zu haben,Insbesondere vertikale pH-Gradienten innerhalb dünnen Biofilmen. Die Clearance von Säuren durch Mediumstrom könnte die Einrichtung von vertikalen Gradienten auch in sehr dünnen Biofilms beitragen.

Ratiometrisch konfokale mikroskopische Bildgebung mit dem ratiometrisches Farbstoff C-SNARF-4 in Kombination mit präzisen Nachbearbeitung der aufgenommenen digitalen Bildern erlaubt Biofilm pH-Wert in der extrazellulären Matrix, in Echtzeit, im pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 und bis zu berechnen und zu visualisieren, zu eine Biofilm-Dicke von 75 & mgr; m.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/