Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

चिकित्सकीय biofilms में कोशिकी पीएच की ratiometric इमेजिंग

Published: March 9, 2016 doi: 10.3791/53622
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dentistry, Aarhus University

Summary

एक पीएच के प्रति संवेदनशील ratiometric डाई वास्तविक समय में दंत biofilms में बाह्य पीएच की निगरानी के लिए confocal माइक्रोस्कोपी लेजर स्कैनिंग और डिजिटल छवि विश्लेषण के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है।

Abstract

दांतों पर बैक्टीरियल biofilms में पीएच दंत क्षय, एक उच्च दुनिया भर में प्रसार के साथ एक रोग के लिए केंद्रीय महत्व का है। पोषक तत्वों और चयापचयों दंत biofilms में समान रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं। biofilm में कार्बनिक पदार्थ के साथ करने के लिए sorption और प्रतिक्रिया का एक जटिल परस्पर क्रिया विलेय के प्रसार रास्तों कम कर देता है और प्रतिक्रियाशील अणुओं की खड़ी ढ़ाल, कार्बनिक अम्ल सहित बनाता है, biofilm भर में। ऐसे प्रतिदीप्ति जीवन समय इमेजिंग या पीएच ratiometry के रूप में मात्रात्मक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म तरीकों, दंत biofilms के विभिन्न microenvironments में पीएच कल्पना करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। पीएच ratiometry पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों का फ्लोरोसेंट उत्सर्जन में एक पीएच निर्भर पारी का लाभ उठाते। दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन अनुपात की गणना सूक्ष्म छवियों में स्थानीय पीएच का निर्धारण करने की अनुमति देता है, डाई की एकाग्रता की परवाह किए बगैर। तकनीक Microelectrodes करने के साथ वास्तविक समय में दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ढ़ाल निगरानी की अनुमति देता विपरीतबाहर यंत्रवत् biofilm परेशान। हालाँकि, ध्यान biofilm के अतिरिक्त और intracellular डिब्बों के बीच अंतर करने के लिए सही ढंग से लिया जाना चाहिए। इधर, ratiometric डाई, seminaphthorhodafluor-4F 5 (और -6) कार्बोक्जिलिक एसिड (सी-Snarf-4) अज्ञात प्रजाति रचना के vivo उगाया दंत biofilms में बाह्य पीएच की निगरानी के लिए कार्यरत है। डाई ग्लूकोज के लिए जोखिम पर अप-केंद्रित biofilms में सभी बैक्टीरियल कोशिकाओं के अंदर है; इस प्रकार यह एक सार्वभौमिक बैक्टीरियल दाग के रूप में और बाह्य पीएच की एक मार्कर के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जाता है। confocal सूक्ष्म छवि अधिग्रहण के बाद, बैक्टीरियल बायोमास सभी डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो विशेष रूप से बाह्य पीएच की गणना करने के लिए परमिट का उपयोग कर चित्रों से निकाल दिया जाता है। ratiometric डाई के साथ पीएच ratiometry 75 माइक्रोन मोटाई की पतली biofilms में बाह्य पीएच अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, लेकिन 4.5 और 7.0 के बीच पीएच रेंज तक सीमित है।

Introduction

विधि यहाँ वर्णित 4.5 और 7 के बीच सीमा में दंत biofilms में बाह्य पीएच की निगरानी, ​​ratiometric डाई seminaphthorhodafluor-4F 5 (और -6) कार्बोक्जिलिक एसिड (सी-Snarf -4) confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में उपयोग की अनुमति देता है और डिजिटल छवि विश्लेषण। नियोजित फ्लोरोसेंट रंजक पीएच के प्रति संवेदनशील है और protonation की स्थिति पर निर्भर करता है अपने फ्लोरोसेंट उत्सर्जन में बदलाव को दिखाता है। 580 एनएम पर protonated अणु चोटियों के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन, और 640 एनएम 1 पर deprotonated अणु का उत्सर्जन। दो खिड़कियां पता लगाने में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन तीव्रता के अनुपात से दो उत्सर्जन चोटियों शामिल (576-608 एनएम और 629-661 एनएम) इस प्रकार तरल चरण में पीएच को दर्शाता है, डाई एकाग्रता की परवाह किए बगैर। ~ 6.4 की एक पी एक साथ डाई मामूली अम्लीय वातावरण में पीएच कल्पना करने के लिए उपयुक्त है।

बैक्टीरियल biofilms में पीएच सभी चयापचय प्रक्रियाओं के लिए केंद्रीय महत्व का है।दंत biofilms के मामले में, बाह्य मैट्रिक्स में पीएच दंत क्षय के विकास के लिए महत्वपूर्ण विषैलापन कारक है। Biofilm से दांत इंटरफेस नेतृत्व में कम पीएच के साथ विस्तारित अवधि के अंतर्निहित तामचीनी 2 की विखनिजीकरण धीमा करने के लिए। biofilms, चयापचयों, कार्बनिक अम्ल के जटिल सहित तीन आयामी वास्तुकला के कारण, समान रूप से biofilm भर में वितरित नहीं कर रहे हैं। उच्च और कम अम्लजन microenvironments करीब स्थानिक निकटता 3 में पाया जा सकता है।

दशकों के लिए, biofilms में खड़ी पीएच ढ़ाल microelectrodes 4-6 की मदद से दर्ज किए गए। जबकि वे अपने छोटे टिप आकार की वजह से एक अच्छा स्थानिक संकल्प प्रस्तुत करते हैं, वे क्षैतिज ढ़ाल की निगरानी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि यंत्रवत् biofilm आ रही है। मात्रात्मक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म तकनीक के बिना यांत्रिक हस्तक्षेप एक biofilm के विभिन्न क्षेत्रों में पीएच परिवर्तन visualizing के लाभ की पेशकशnce। देखने के विभिन्न क्षेत्रों सूक्ष्म स्वतंत्र रूप से चयनित और लंबी अवधि के 1,7-9 बार बार imaged किया जा सकता है। हालांकि, जब सूक्ष्म biofilm छवियों की व्याख्या, यह महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति माइक्रोबियल बायोमास और प्रतिदीप्ति बाह्य अंतरिक्ष से पाने से पाने के बीच भेद करने के लिए है। अम्लीय परिस्थितियों में, बैक्टीरियल कोशिकाओं के अंदर पीएच के रूप में बैक्टीरिया सक्रिय रूप से adenosine triphosphate 10 की कीमत पर अपने कोशिका झिल्ली भर में प्रोटॉन परिवहन, बाह्य मैट्रिक्स में पीएच से अलग है। दंत क्षय के संदर्भ में, intracellular बैक्टीरियल पीएच अंतर्निहित तामचीनी पर सीधा प्रभाव पड़ता है, जबकि कम कोशिकी पीएच विखनिजीकरण की ओर जाता है नहीं है। सूक्ष्म छवियों है कि दोनों बैक्टीरिया से मुक्त क्षेत्रों और बैक्टीरिया होते में पीएच औसत गलत परिणाम होता है। आदेश बैक्टीरियल बायोमास कल्पना और अतिरिक्त और intracellular क्षेत्रों के बीच अंतर करने के लिए में पीएच के प्रति संवेदनशील डाई के साथ-साथ अन्य दाग का उपयोग एबी लाता हैझूठी माप 11 बाह्य अंतरिक्ष के फ्लोरोसेंट संदूषण का जोखिम और बाहर।

वर्तमान पांडुलिपि इसलिए एक डबल समारोह में ratiometric डाई के उपयोग का वर्णन; दोनों एक पीएच मार्कर के रूप में और एक सार्वभौमिक बैक्टीरियल दाग के रूप में। के रूप में डाई बैक्टीरियल कोशिकाओं में केंद्रित है, confocal सूक्ष्म इमेजिंग के संयोजन और एक सटीक डिजिटल छवि विश्लेषण प्रक्रिया पतली दंत biofilms में 4.5 और 7.0 के बीच सीमा में बाह्य पीएच का निर्धारण करने की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा की और आरहूस काउंटी की आचार समिति (एम-20,100,032) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. Confocal सूक्ष्म ratiometric डाई की कैलिब्रेशन

  1. छवि अधिग्रहण के लिए, एक मशीन से लैस एक औंधा confocal खुर्दबीन, एक 63X / 1.2 एपर्चर-न्यूमेरिक पानी विसर्जन उद्देश्य, एक 543 एनएम लेजर लाइन और एक मेटा डिटेक्टर का उपयोग करें।
  2. HEPES बफर स्टॉक समाधान (50 मिमी, 0.1 पीएच इकाइयों के चरणों में पीएच 4.5-8.5 करने के लिए समायोजित) तैयार करें। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में प्रत्येक समाधान के 100 μl पिपेट।
  3. nitrile दस्ताने पहनने के लिए जब ratiometric डाई सी Snarf -4 से निपटने। डाइमिथाइल sulfoxide में डाई की एक 1 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। अच्छी तरह से HEPES बफर के साथ प्रत्येक के लिए शेयर समाधान के 5 μl जोड़ें। माइक्रोस्कोप पर 96 अच्छी तरह से थाली रखें।
  4. माइक्रोस्कोप चालू करें। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें। निम्नलिखित पैनल पर क्लिक करें: मोल → लेजर; मोल → एमICRO; → विन्यास मोल; → स्कैन मोल; → स्टेज मोल। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर गर्म।
  5. 543 एनएम लेजर और "लेजर नियंत्रण" विंडो में बटन "पर" पर क्लिक करके 543 एनएम लेजर लाइन चालू करें। "माइक्रोस्कोप नियंत्रण" विंडो में 63X / 1.2 एपर्चर-न्यूमेरिक पानी विसर्जन उद्देश्य चुनें।
  6. मेटा डिटेक्टर एक साथ करने के लिए 576- 608 एनएम (हरा) और 629- 661 एनएम (लाल) अंतराल ( "विन्यास नियंत्रण" → "सीएचएस") के भीतर प्रतिदीप्ति की निगरानी के लिए सेट करें। लेजर शक्ति ( "विन्यास नियंत्रण" → "उत्तेजना") समायोजित करें। (→ "पिनहोल" "स्कैन नियंत्रण") 1.6 माइक्रोन की एक ऑप्टिकल टुकड़ा मोटाई उपज के लिए पिनहोल सेट करें।
  7. प्रत्येक HEPES बफर समाधान, 96 अच्छी तरह से थाली के गिलास नीचे से ऊपर 5 माइक्रोन की एक छवि मोल। नोट: जैसे ही फोकस विमान गिलास नीचे नीचे स्थित है, कोई प्रकाश फ्लोरोसेंट देखा जा सकता हैस्क्रीन पर। हर तीसरे छवि के बाद, शून्य और पृष्ठभूमि घटाव के लिए एक छवि लेने के लिए लेजर शक्ति निर्धारित किया है।
  8. तीन प्रतियों में अंशांकन प्रयोग (1.2-1.7) प्रदर्शन करना।
  9. औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता और सभी लाल और हरे रंग की छवियों में मानक विचलन का निर्धारण करते हैं।
    1. समीकरणों के अनुसार, अनुपात आर और मतलब की मानक त्रुटि, एस आर की गणना प्रत्येक छवि के लिए (1) और (2)
      (1) Equation1
      (2) Equation2
      जी, आर, एस जी और एस आर औसत और संबंधित हरे और लाल छवियों में मानक विचलन। बी जी, बी आर, एस बीजी और एस बीआर रहे हैं पृष्ठभूमि छवियों के लिए इसी मान रहे हैं। n 2 imaged पिक्सल की संख्या है।
    2. एक चित्र में तीन को दोहराने अंशांकन प्रयोगों से प्रत्येक पीएच मान के लिए गणना के अनुपात में प्लॉट और डेटा बिंदुओं की इस श्रृंखला से एक फिट की अवस्था का निर्माण (यानी सॉफ्टवेयर SigmaPlot 13 ​​का उपयोग)। फिट वक्र है कि पीएच मान 10 में अनुपात में परिवर्तित कर सकते हैं से एक गणितीय समारोह बनाओ।

2. सीटू ग्रोन चिकित्सकीय Biofilm नमूनों के संग्रह

  1. स्वयंसेवकों है कि अध्ययन के लिए प्रासंगिक शामिल किए जाने और अपवर्जन मानदंड को पूरा का चयन करें। उनके ऊपरी और निचले दंत चाप के alginate छापों बनाओ। डाली मॉडल इन छापों से बनाने और निचले जबड़े में एक एक्रिलिक पट्टी का निर्माण। मुख एक्रिलिक एक बहुभाषी orthodontic तार कि स्वयंसेवक सामान्य रोड़ा 12 में काटने के लिए अनुमति देता से जुड़े flanges साथ पट्टी डिजाइन।
  2. एक्रिलिक पट्टी के मुख flanges में ड्रिल मंदियों (चित्रा 1
  3. Biofilm संग्रह के लिए, क्रम में प्राकृतिक तामचीनी 11 पर बसाना पैटर्न की नकल करने में धैर्य 1,200 के एक सतह खुरदरापन के साथ कस्टम बनाया गैर फ्लोरोसेंट कांच स्लैब (4 x 4 x 1 मिमी 3) का उपयोग करें।
  4. बढ़ते से पहले autoclaving द्वारा कांच स्लैब जीवाणुरहित। आदेश गाल 11 के आंदोलन से लगाए गए कतरनी बलों से biofilm की रक्षा के लिए प्रत्येक पक्ष के मुख flanges थोड़ा एक्रिलिक सतह से सतह को recessed में गड्ढों में चिपचिपा मोम के साथ कांच स्लैब माउंट।
    नोट: मंदी के दौर में रखा कांच स्लैब की संख्या अध्ययन का उद्देश्य के आधार पर 3 और 14 के बीच भिन्न हो सकते हैं।
  5. स्वयंसेवक के मुंह में उपकरण डालें। volun को हिदायतTeer प्रयोगात्मक अवधि के दौरान उपकरण बनाए रखने के लिए इंट्रा-मौखिक रूप से। स्वयंसेवक गीला कागज ऊतक का एक टुकड़ा के साथ एक orthodontic अनुचर कंटेनर में उपकरण की दुकान के लिए हिदायत दांत ब्रश करने और भोजन और पानी के अलावा अन्य पेय पदार्थों के सेवन के दौरान कमरे के तापमान पर (नम रखने के लिए यह)। स्वयंसेवक को हिदायत कांच स्लैब के साथ मुख एक्रिलिक flanges छू नहीं है, जबकि रखने और हटाने के उपकरण।
    नोट: प्रयोगात्मक अध्ययन अवधि (एक दिन कई हफ्तों के लिए) के उद्देश्य के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  6. ध्यान से प्रयोगात्मक अवधि के अंत में उपकरण से कांच स्लैब हटा दें। एक चाकू के साथ स्लैब के आसपास चिपचिपा मोम निकालें और एक बंद कंटेनर, biofilm ऊपर की ओर का सामना करना पड़ करने के लिए चिमटी की एक जोड़ी के साथ उन्हें स्थानांतरण, सूक्ष्म विश्लेषण तक। कंटेनर गीला कागज ऊतक के साथ नम रखें। biofilm संग्रह के बाद कुछ ही घंटों के भीतर पीएच इमेजिंग प्रदर्शन।

3. Biofilm पीएच इमेजिंग

  1. तैयार करना। डी जोंग एट अल 13 की विधि के अनुसार एकत्र करने के लिए लार dithiothreitol जोड़कर लार समाधान। पीएच 7.0 करने के लिए लार समाधान titrate और 0.4% (wt / खंड) की एकाग्रता के लिए ग्लूकोज को जोड़ने। पिपेट biofilm प्रति 100 μl माइक्रोस्कोपी के लिए एक गिलास नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में विश्लेषण किया जा सके। अच्छी तरह से प्रति ratiometric डाई के 5 μl जोड़ें।
  2. खुर्दबीन मंच पर 96 अच्छी तरह से थाली रखें। माइक्रोस्कोप और 543 एनएम लेजर लाइन चालू करें। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर गर्म। डाई की जांच के लिए के रूप में ही माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें (कदम 1.5-1.6 देखें)। 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक 96 अच्छी तरह से थाली काम कर रहे तापमान तक पहुँच गया है।
  3. एक या एक से अधिक कांच स्लैब चिमटी की एक पतली सेट के साथ अच्छी तरह से प्रति एक स्लैब, नीचे का सामना करना पड़ biofilms साथ उठाओ और उन्हें लार से भरे कुओं में जगह है।
  4. एकल छवियों ( "स्कैन नियंत्रण" → "एकल") या जेड के ढेर मोल ( "स्कैन नियंत्रण" → "प्रारंभ") spanniविभिन्न क्षेत्रों में biofilms की गहराई एनजी। जेड के ढेर चुनें स्लाइस की संख्या imaged किया जा करने के लिए ( "स्कैन नियंत्रण" → "Z सेटिंग" → "अंक स्लाइस") प्राप्त करने के लिए और ( "स्कैन नियंत्रण पहली और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में पिछले टुकड़ा के लिए जेड स्थिति निशान "→" Z सेटिंग "→" मार्क सबसे पहले "," मार्क अंतिम ")।
    नोट: अप करने के लिए 75 माइक्रोन बाह्य और intracellular क्षेत्रों के बीच अच्छा विपरीत के साथ प्राप्त किया जा सकता गहराई के साथ जेड के ढेर।
  5. देखने का एक सूक्ष्म क्षेत्र में समय के साथ परिवर्तन का पालन करने में पीएच, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर ( "स्टेज और फोकस नियंत्रण" → "मार्क स्थिति") में XY-स्थिति के निशान और लगातार समय बिंदुओं पर दोहराया चित्र लेने ( "स्कैन नियंत्रण" → " एक")। नियमित रूप से लेजर शक्ति पृष्ठभूमि घटाव के लिए शून्य करने के लिए सेट के साथ छवियों को ले।

4. डिजिटल छवि विश्लेषण

  1. एक्सपो के लिएRT TIF फाइल के रूप में सूक्ष्म छवियों, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर ( "मैक्रो" → "फाइल बैच निर्यात") की फ़ाइल बैच निर्यात का उपयोग करें। मार्क निर्यात किया जा करने के लिए फ़ाइलों और TIF-फाइल के रूप में अलग फ़ोल्डर में लाल और हरे रंग चैनल छवियों को बचाने के ( "बैच प्रारंभ निर्यात")। उन्हें अनुक्रमिक संख्या देने के लिए दोनों फ़ोल्डर में फ़ाइलों का नाम बदलें।
  2. ऐसे Daime (माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में डिजिटल छवि विश्लेषण) 14 के रूप में सॉफ्टवेयर में लाल और हरे रंग की छवि श्रृंखला आयात करें। खंड व्यक्तिगत रूप से चुना चमक थ्रेसहोल्ड (खंड → स्वचालित विभाजन → कस्टम सीमा) के साथ ग्रीन चैनल छवियों। , देखभाल (आमतौर पर 20 और 80 के बीच) के साथ चमक थ्रेसहोल्ड चुनें ताकि सभी बैक्टीरिया (बाह्य मैट्रिक्स की तुलना में उज्जवल), लेकिन नहीं मैट्रिक्स विभाजन के दौरान वस्तुओं के रूप में मान्यता प्राप्त हो जाएगा। नेत्रहीन सत्यापित करें कि क्षेत्रों वस्तुओं के रूप में मान्यता प्राप्त बैक्टीरियल बायोमास के लिए अच्छी तरह से अनुरूप हैं।
  3. खंडों जी की वस्तु परत स्थानांतरणइसी लाल चैनल छवियों रीन चैनल छवियों (खंड → स्थानांतरण वस्तु परत)। लाल और हरे रंग चैनल छवियों में सभी वस्तुओं को अस्वीकार और नष्ट करने के लिए ऑब्जेक्ट संपादक समारोह का प्रयोग करें। अब केवल बाह्य मैट्रिक्स biofilm छवियों में छोड़ दिया है। TIF फ़ाइलों के रूप में संसाधित छवि श्रृंखला निर्यात करें।
  4. (; V.1.47 http://rsb.info.nih.gov/ij) ImageJ में छवि श्रृंखला आयात करें। निर्धारित बनाने के लिए लेजर के साथ लिया पृष्ठभूमि छवियों में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता बंद कर दिया (→ हिस्टोग्राम विश्लेषण)। लाल और हरे रंग की छवियों से उपयुक्त पृष्ठभूमि (प्रक्रिया → मठ → घटाना) घटाएँ।
  5. फिर भी ImageJ में, जो अपने आप (प्रक्रिया → छवि कैलकुलेटर) द्वारा हरी छवि श्रृंखला (G1) विभाजित। फिर हरे छवि श्रृंखला (G1) के साथ जिसके परिणामस्वरूप छवि श्रृंखला (G2) गुणा। यह एक छवि श्रृंखला (जी 3), जहां NaN क्षेत्रों है कि Daime में वस्तुओं के रूप में मान्यता प्राप्त कर रहे थे करने के लिए संबंधित सभी पिक्सल को सौंपा है निकलेगा। टी में आगे बढ़ेंवह लाल छवि श्रृंखला के साथ एक ही रास्ता (आर 1 / R1 = R2, आर 2 एक्स आर 1 = R3)।
    नोट: के रूप में बैक्टीरियल बायोमास 4.3 चरण में छवियों से हटा दिया गया था, फ्लोरोसेंट तीव्रता इन क्षेत्रों में 0 है। 4.5 कदम नेन, जो 4.6 कदम में अनुपात की गणना के लिए अनुमति देता है के लिए मान 0 परिवर्तित करने के लिए आवश्यक है।
  6. डिटेक्टर शोर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए:; 'मतलब' फिल्टर (1 पिक्सेल त्रिज्या प्रक्रिया → फिल्टर → माध्य) को लागू करें। लाल छवि श्रृंखला (प्रक्रिया → छवि कैलकुलेटर) द्वारा हरी छवि श्रृंखला फूट डालो। इस चित्र के बाह्य अंतरिक्ष में हर शेष पिक्सेल के लिए एक हरी / लाल अनुपात में परिणाम है। छवियों में अनुपात की ग्राफिक प्रतिनिधित्व (छवि → देखने सारणी) के लिए झूठी रंग का प्रयोग करें। प्रत्येक छवि के लिए मतलब अनुपात की गणना (→ हिस्टोग्राम विश्लेषण)।
  7. समारोह 1.9.2 के तहत फिट) के अनुसार पीएच मान कन्वर्ट करने के लिए हरी / लाल अनुपात। नोट: अंशांकन डेटा और फिट की अवस्था के लिए एक उदाहरण Schlafer एट में देखा जा सकता हैअल 2015 11।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रस्तुत विधि निगरानी बाह्य पीएच वास्तविक समय में 4.5-7 पीएच रेंज में दंत biofilms के विभिन्न microenvironments में चला जाता है की अनुमति देता है। जैसा कि ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों चुना जाता है, तो पीएच शीघ्र ही ग्लूकोज में प्रदर्शन के बाद biofilms के सभी क्षेत्रों में ड्रॉप करने के लिए शुरू होता है।

जब एक biofilm में पीएच आ जाता है, बैक्टीरियल कोशिकाओं, कम समय (<1 मिनट) के भीतर दिखाई देने लगते हैं के रूप में ratiometric डाई कोशिकाओं (2A चित्रा) में upconcentrated है। बहुत शुरुआत में, biofilm शुरू में एसिड के उत्पादन से पहले, कोई फर्क नहीं पृष्ठभूमि और कोशिकाओं के बीच देखा जा सकता है। सॉफ्टवेयर Daime में निर्यात छवियाँ आदेश छवियों में बैक्टीरियल बायोमास और वस्तुओं कार्यक्रम (चित्रा 2 बी) द्वारा मान्यता प्राप्त के बीच एक अच्छा अनुरूपता प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत रूप से चुना चमक थ्रेसहोल्ड के साथ खंडित किया जाना है। अगर appropri खंडोंately, Daime में वस्तुओं का विलोपन सभी फ्लोरोसेंट संकेत है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं (चित्रा -2) से प्राप्त हटा। ImageJ में बाद में छवि प्रसंस्करण छवियों के बाह्य अंतरिक्ष में पिक्सल के लिए हरी / लाल अनुपात में परिणाम है। अंशांकन वक्र की मदद से, ये अनुपात पीएच मान को बदल दिया और ग्राफिक प्रतिनिधित्व (चित्रा 2 डी) के लिए झूठी रंग के साथ देखे जा सकते हैं। औसत पीएच संसाधित छवियों में से प्रत्येक के लिए गणना की जा सकती है, और पीएच विकास के समय (चित्रा 2 ई) पर पीछा किया जा सकता। पीएच बूँदें देखने के विभिन्न सूक्ष्म खेतों के बीच भिन्न हो सकती है, और दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ढ़ाल पर नजर रखी जा सकती है। हालांकि, स्थिर शर्तों के तहत, पतली biofilms भीतर, केवल मामूली खड़ी पीएच ढ़ाल मनाया जा सकता है।

कुछ उदाहरणों में, देखने के पूरे सूक्ष्म क्षेत्र है जो बाह्य की गणना renders बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ कवर किया जा सकता हैपीएच असंभव (चित्रा 3 ए)। समस्या एक से थोड़ा अलग ध्यान विमान का चयन करके हल किया जा सकता है। केयर, सूक्ष्म छवियों overexpose नहीं लिया जाना चाहिए क्योंकि छवियों में बैक्टीरियल बायोमास तो वास्तविकता (चित्रा 3 बी) में से एक बड़ा क्षेत्र शामिल हैं। जब Daime में छवि segmenting यह चमक थ्रेसहोल्ड कि सभी बैक्टीरियल कोशिकाओं को समझते हैं और, अगर वर्तमान, मानव उपकला कोशिकाओं (चित्रा 3 सी) के रूप में वस्तुओं का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभाजन बहुत अधिक चमक थ्रेसहोल्ड के साथ किया जाता है, तो intracellular क्षेत्रों पीएच गणना में शामिल किया जाएगा और गलत परिणाम (चित्रा 3 डी) के लिए सीसा। ratiometric डाई के साथ बाह्य पीएच की निगरानी confocal माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के द्वारा सीमित है। 75 माइक्रोन की एक प्रवेश गहराई तक, अतिरिक्त और intracellular क्षेत्रों मज़बूती (चित्रा 3E) प्रतिष्ठित किया जा सकता है। मोटा biofilms में खड़ी पीएच ढ़ाल मापने के लिए, microelectrodes मुलाकात रहनेपसंद के विभागाध्यक्ष।

आकृति 1
चित्रा 1:।। Intraoral Biofilm संग्रह के लिए एक्रिलिक कमठी पट्टी मुख एक्रिलिक एक बहुभाषी orthodontic तार कि स्वयंसेवक सामान्य रोड़ा में काटने के लिए अनुमति देता से जुड़े flanges साथ बनाया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। कोशिकी Biofilm पीएच की सूक्ष्म मापन के लिए इमेज प्रोसेसिंग (ए) एक biofilm ratiometric डाई के साथ दाग के confocal सूक्ष्म छवि, 9 मिनट के बाद जोखिम ग्लूकोज में। छवि में बैक्टीरियल बायोमास बाह्य पृष्ठभूमि से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (बी) Daime में विभाजन के बाद एक ही छवि। देखने के सूक्ष्म जीवाणु पूरे क्षेत्र में बायोमास के रूप में नारंगी लाइनों द्वारा संकेत दिया है, विभाजन के दौरान वस्तुओं के रूप में पहचाना गया है। (सी) बैक्टीरियल बायोमास को हटाने के बाद ही छवि। बैक्टीरियल कोशिकाओं से पाने सभी प्रतिदीप्ति हटा दिया गया है, और केवल बाह्य मैट्रिक्स से पाने प्रतिदीप्ति छवि में छोड़ दिया है। (डी) देखने का एक ही सूक्ष्म क्षेत्र में बाह्य पीएच की ग्राफिक प्रतिनिधित्व। हरी / लाल अनुपातों ImageJ में गणना की गई है, और झूठे रंग बाह्य पीएच के ग्राफिक प्रतिनिधित्व के लिए लागू किया गया था। औसत कोशिकी पीएच = 5.86। (ई) 20 माइक्रोन स्केल सलाखों =। (ई) देखने का एक ही सूक्ष्म क्षेत्र में औसत पीएच ड्रॉप, 15 मिनट के लिए नजर रखी। biofilm के इस क्षेत्र में पीएच बूंद शुरुआत में तेज है, शीघ्र ही ग्लूकोज से संपर्क के बाद। फिर इसे नीचे धीमा कर देती है, लेकिन प्रेक्षण के समय के भीतर एक पठार तक पहुँच नहीं है।https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। कोशिकी Biofilm पीएच की सूक्ष्म मापन - संभावित समस्याओं और गलतियाँ (ए) एक घने ग्लूकोज से अवगत कराया और ratiometric डाई के साथ दाग बायोफिल्म के confocal सूक्ष्म छवि। देखने के इस सूक्ष्म क्षेत्र में, पूरी छवि बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ कवर किया जाता है, और बैक्टीरिया को हटाने की पीएच गणना के लिए बाह्य क्षेत्रों को छोड़ नहीं होगा। (बी) overexposed एक biofilm ratiometric डाई के साथ दाग के confocal सूक्ष्म छवि। overexposed छवियों की छवि विभाजन के दौरान वास्तव में से बड़ा क्षेत्रों बैक्टीरिया द्वारा कवर वस्तुओं के रूप में पहचाने जाते हैं और बाह्य अंतरिक्ष का हिस्सा पीएच गणना के लिए खो दिया है। (सी) Biofउपकला कोशिकाओं (तीर) के साथ इल्म छवि। छवि विभाजन के लिए चमक थ्रेसहोल्ड, चुना जाना चाहिए ताकि उपकला कोशिकाओं वस्तुओं के रूप में मान्यता प्राप्त है और छवियों से पूर्व पीएच गणना करने के लिए हटा रहे हैं। (डी) चित्रा 1 बी के रूप में ही biofilm छवि, एक गलत चमक सीमा के साथ खंडों। बैक्टीरियल बायोमास के भाग वस्तुओं के रूप में मान्यता प्राप्त नहीं है और छवि से हटाया नहीं जा सकता। यह पीएच गणना में intracellular क्षेत्रों के शामिल किए जाने और फलस्वरूप गलत परिणाम होता है। (ई) एक biofilm ratiometric डाई के साथ दाग की गहरी परत। छवि की biofilm से बुनियाद इंटरफ़ेस से 90 माइक्रोन अधिग्रहण कर लिया था। अतिरिक्त और intracellular क्षेत्रों के बीच भेदभाव समझौता किया है। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इलेक्ट्रोड या microelectrode माप 4-6 की तुलना में biofilm पीएच की सूक्ष्म निगरानी, ​​कई लाभ प्रदान करता है। सूक्ष्म तकनीक एक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ पीएच का निर्धारण और यंत्रवत् biofilm परेशान बिना biofilms में दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ढ़ाल पर कब्जा करने की अनुमति के लिए अनुमति। सूक्ष्म पीएच निगरानी के पिछले प्रयास, तथापि, biofilms 1,7,9 में बाह्य और intracellular पीएच के बीच अंतर करने में विफल रहा है। बैक्टीरियल homeostasis के कारण, intracellular पीएच कोशिकी पीएच से अलग है, और पीएच गणना मान्य नहीं हो सकता है अगर दोनों अंतर और बाह्य डिब्बों दर्ज की फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के लिए योगदान करते हैं। पीएच संवेदनशील डाई के साथ-साथ एक दूसरे फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग बैक्टीरियल कोशिकाओं कल्पना करने के लिए समस्याग्रस्त है, के बाद भी रंगों के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच एक छोटे से ओवरलैप फ्लोरोसेंट प्रकाश की मात्रा का ठहराव समझौता हो सकता है। इसलिए तकनीक यहाँ प्रस्तुतbiofilm का अधिग्रहण पीएच छवियों से बैक्टीरियल कोशिकाओं की पहचान करने और बाद में दूर करने के अतिरिक्त और intracellular डिब्बों के बीच ratiometric डाई की एक एकाग्रता ढाल पर निर्भर करता है।

फ्लोरोसेंट रंजक साथ धुंधला करने पर, biofilms में बैक्टीरियल कोशिकाओं internalize और अणु ऊपर ध्यान केंद्रित है, लेकिन केवल अम्लीय परिस्थितियों में। डाई के साथ पीएच ratiometry इसलिए 4.5 और 7.0 के बीच पीएच रेंज तक सीमित है। 7 ऊपर पीएच मान में unprotonated है और इस तरह का आरोप लगाया डाई बैक्टीरियल कोशिकाओं में अच्छी तरह से उन्हें बाह्य पृष्ठभूमि से अलग करने के लिए पर्याप्त घुसना नहीं है, और नीचे 4.5 पीएच मान पर डाई अणु के सबसे protonated कर रहे हैं और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन में आगे कोई परिवर्तन हो सकता है मनाया। फिट वक्र (पीएच बनाम अनुपात हरी / लाल) 6 पीएच के आसपास तेज है और पीएच 4.5 की ओर दुबला बना देती है। एक उदाहरण वर्तमान में Schlafer एट अल।, 2015, चित्रा S2 में दिखाया गया है। 11 पीएच ratiometry के लिए फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करने के लिए सीमित हैबाह्य पीएच 1 की निगरानी। सिद्धांत रूप में, डाई भी intracellular बैक्टीरियल पीएच परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अब तक, अंशांकन intracellular उपयोग के लिए प्रदर्शन नहीं किया गया है। इसके अतिरिक्त, यह intracellular फ्लोरोसेंट उत्सर्जन और डाई बैक्टीरिया कोशिका दीवार के बाहर से जुड़ी अणुओं से फ्लोरोसेंट रोशनी पाने के बीच सही अंतर करना मुश्किल हो जाएगा। इसके अलावा, के रूप में ratiometric डाई के साथ धुंधला confocal माइक्रोस्कोपी, biofilm परतों में छवि अधिग्रहण के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाता है कांच कवर / biofilm इंटरफ़ेस से गहरी की तुलना में 75 माइक्रोन समझौता किया है। बैक्टीरियल कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स के बीच घटाना विपरीत अंतर और बाह्य क्षेत्रों मुश्किल के बीच भेदभाव प्रदान करता है। नियोजित ratiometric डाई मज़बूती से 15 बैक्टीरियल दंत biofilm के साथ जुड़े प्रजातियों कल्पना करने के लिए दिखाया गया है, और यह दंत biofilms सीटू 11 में उगाया में सभी बैक्टीरियल कोशिकाओं दाग। हालांकि यह संभावना है कि हैratiometric डाई, एक सार्वभौमिक बैक्टीरियल दाग है यह अभी तक साबित नहीं किया गया है और दाग मौखिक गुहा के अलावा अन्य निवास से biofilms पर परीक्षण किया जाना चाहिए। विधि एक दिया पीएच माप की तकनीकी प्रतिकृति, उत्पादन करने के लिए अनुमति नहीं देता है के रूप में छवि अधिग्रहण कुछ सेकंड लेता है और biofilm पीएच गतिशील बदलता है। biofilm मुक्त बफर समाधान हालांकि, के बार-बार इमेजिंग, और बफर में biofilms के दोहराया इमेजिंग झुकेंगे स्थिर पीएच मान (डेटा) नहीं दिखाया।

इमेज प्रोसेसिंग के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया के सभी चरणों का सही ढंग से पालन किया जाना चाहिए। Biofilm छवियों पर्याप्त लेजर शक्ति / लाभ के साथ प्राप्त कर लिया जाना चाहिए बाह्य मैट्रिक्स में फ्लोरोसेंट संकेत के पर्याप्त स्तर प्राप्त करने के लिए, लेकिन बैक्टीरियल कोशिकाओं के overexposure से बचा जाना चाहिए। बैक्टीरियल कोशिकाओं (बहुत उच्च शक्ति लेजर या लाभ) overexposed रहे हैं, वास्तव में से बड़ा क्षेत्रों बैक्टीरिया द्वारा कवर के रूप में छवि विभाजन और बाह्य अंतरिक्ष के भाग के दौरान वस्तुओं खो दिया है मान्यता प्राप्त कर रहे हैंपीएच गणना के लिए (देखें चित्र 3 बी)। दूसरी ओर, चित्र बहुत कम लेजर शक्ति / लाभ के साथ प्राप्त कर रहे हैं, बाह्य अंतरिक्ष में फ्लोरोसेंट तीव्रता नहीं हरी / लाल उत्सर्जन अनुपात की गणना के लिए पर्याप्त विश्वसनीय हो सकता है। माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में एक रेंज संकेतक उपकरण इतना है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं अधिकतम तीव्रता के साथ कब्जा कर रहे हैं, लेकिन overexposure के बिना, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्वचालित छवि विभाजन विश्वास दिलाता हूं कि सभी बैक्टीरियल और, अगर मौजूद है, कोशिकाओं सॉफ्टवेयर द्वारा वस्तुओं के रूप में पहचाने जाते हैं सब biofilm छवियों के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। विभाजन के बाद, सभी biofilm छवियों बैक्टीरियल बायोमास और क्षेत्र की वस्तुओं के रूप में मान्यता के बीच अनुरूपता पता लगाने के लिए संबंधित अनुभाग-रहित छवियों के लिए एक के बाद एक तुलना की जानी चाहिए। के रूप में वस्तुओं बैक्टीरिया द्वारा कवर की तुलना में उन बड़े क्षेत्रों में पहचाने जाते हैं तो चमक दहलीज एक सटीक भेदभाव के लिए बहुत कम है, और विभाजन एक उच्च के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिएgher चमक दहलीज। तो बैक्टीरियल बायोमास का हिस्सा वस्तुओं के बीच नहीं है, चमक दहलीज बाह्य और intracellular अंतरिक्ष के बीच एक सही भेदभाव उपज के लिए कम किया जाना चाहिए। बड़े डेटासेट के विश्लेषण के लिए यह अलग चमक थ्रेसहोल्ड की एक पंक्ति के साथ सभी छवियों को खंड के लिए फायदेमंद साबित हो गया है और बाद में प्रत्येक छवि के लिए आदर्श सीमा निर्धारित करने के लिए। एक बार बैक्टीरिया और बाह्य मैट्रिक्स के बीच एक सही गौरव हासिल की है, आगे कोई समस्या नहीं इमेज प्रोसेसिंग के दौरान उम्मीद की जा रही हैं। वहाँ है, तथापि, एक बहुत ही घने biofilm, जहां बैक्टीरिया देखने के पूरे क्षेत्र को कवर के साथ कुछ सूक्ष्म छवियों हो सकता है। इन चित्रों में, जाहिर है, बाह्य पीएच निर्धारित नहीं किया जा सकता है। कुछ मामलों में समस्या एक अलग z विमान, जहां बैक्टीरियल बायोमास देखने के पूरे क्षेत्र को कवर नहीं करता है में छवियों को प्राप्त करके हल किया जा सकता है।

बाह्य पीएच ratiometry के आगे अनुप्रयोगों अध्ययन करने के लिए हो सकता हैदंत biofilms (यानी। Pseudomonas aeruginosa biofilms या वर्तमान उत्पादन बैक्टीरियल biofilms) के अलावा अन्य माइक्रोबियल समुदायों में पीएच परिदृश्य। ऐसे ऑक्सीजन एकाग्रता, कार्बोहाइड्रेट की आपूर्ति या biofilm पीएच पर विद्युत प्रवाह के आवेदन के रूप में विभिन्न पारिस्थितिक मापदंडों के प्रभाव से निर्धारित किया जा सकता है। biofilm उम्र, biofilm मोटाई और पीएच पर चयापचय गतिविधि के प्रभाव की जांच की जा सकती है, साथ ही जीवाणु biofilms पर पीएच नियमन एजेंटों के प्रभाव। उत्तरार्द्ध दंत biofilms, जहां बफरिंग एजेंटों दंत क्षय 15 को नियंत्रित करने के लिए एक आशाजनक चिकित्सकीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करने के संदर्भ में विशेष रूप से प्रासंगिक है। इसके अलावा, भविष्य के अनुसंधान के प्रवाह शर्तों के तहत प्रस्तुत विधि लागू करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। तिथि करने के लिए बाह्य पीएच ratiometry केवल स्थिर शर्तों के तहत पीएच की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है। ताजा ऑक्सीजन माध्यम की निरंतर आपूर्ति, पीएच microenvironments और के विकास पर काफी प्रभाव पड़ता है करने के लिए की संभावना हैपतली biofilms के भीतर विशेष रूप से, खड़ी पीएच ढ़ाल। मध्यम प्रवाह से एसिड की निकासी बहुत पतली biofilms में भी खड़ी ढ़ाल की स्थापना के लिए योगदान हो सकता है।

ratiometric डाई सी Snarf -4 का अधिग्रहण डिजिटल छवियों परमिट की सटीक postprocessing के साथ संयोजन में साथ ratiometric confocal इमेजिंग सूक्ष्म गणना और 4.5 और 7.0 के बीच और अप करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स में biofilm पीएच कल्पना, वास्तविक समय में, पीएच रेंज में करने के लिए 75 माइक्रोन की एक biofilm मोटाई।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए जेवियर ई गार्सिया और तकनीकी सहायता के लिए Lene ग्रोनजर और Merete लालकृष्ण Raarup को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम आरहूस विश्वविद्यालय रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया और साइमन जासूस फाउंडेशन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective Zeiss N/A
XL Incubator PeCON N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
HEPES Life Technologies 11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate Fisher Scientific 07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit) Menzel N/A
Alginate impression material GC Corporation N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs Axis Dental LS-906
Orthodontic retainer containers Spark Medical Equipment Co., Ltd SK-WDTC01
Sticky wax Dentsply N/A
Chewing paraffin wax  Ivoclar Vivadent AG N/A
Dithiothreitol Sigma Aldrich D0632 Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters Sigma Aldrich CLS431220; CLS431219 
daime University of Vienna, Austria http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ NIH, Bethesda, Maryland, USA http://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
  2. Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
  3. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
  4. von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  5. Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
  6. Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
  7. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  8. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  9. Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
  10. Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
  11. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  12. Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
  13. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
  14. Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
  15. Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 109 biofilm confocal माइक्रोस्कोपी दंत क्षय बाह्य पीएच पीएच ratiometry ratiometric डाई
चिकित्सकीय biofilms में कोशिकी पीएच की ratiometric इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric… More

Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J. Vis. Exp. (109), e53622, doi:10.3791/53622 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter