Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

Summary

Un colorante raziometrico pH-sensibile è utilizzato in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale per monitorare pH extracellulare in biofilm dentali in tempo reale.

Abstract

Il pH di biofilm batterici sui denti è di importanza centrale per la carie dentale, una malattia con un'alta prevalenza in tutto il mondo. Nutrienti e metaboliti non sono distribuite in modo uniforme in biofilm dentali. Un complesso gioco di assorbimento da e per la reazione con la materia organica nel biofilm riduce i percorsi di diffusione di soluti e crea pendenze di molecole reattive, tra cui gli acidi organici, in tutto il biofilm. Metodi microscopici fluorescenti quantitativi, come l'imaging tempo di vita di fluorescenza o pH ratiometry, possono essere impiegati per visualizzare pH in diversi microambienti di biofilm dentali. pH ratiometry sfrutta una variazione del pH-dipendente nella emissione fluorescente di coloranti sensibili al pH. Calcolo del rapporto emissione a due diverse lunghezze d'onda permette di determinare pH locale in immagini microscopiche, indipendentemente dalla concentrazione del colorante. Contrariamente a microelettrodi tecnica permette il monitoraggio entrambi gradienti di pH verticali ed orizzontali in tempo reale condisturbare meccanicamente il biofilm. Tuttavia, la cura deve essere presa per distinguere con precisione tra i compartimenti extra-intracellulari e del biofilm. Qui, il colorante raziometrica, seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) è impiegato per monitorare pH extracellulare in in vivo biofilm dentali coltivate di composizione delle specie sconosciuta. Al momento l'esposizione al glucosio il colorante è up-concentrato all'interno di tutte le cellule batteriche nei biofilm; è quindi usato sia come una macchia batterica universale e come indicatore di pH extracellulare. Dopo l'acquisizione di immagini al microscopio confocale, la biomassa batterica viene rimosso da tutte le immagini utilizzando il software di analisi di immagine digitale, che permette di calcolare esclusivamente pH extracellulare. pH ratiometry con il colorante raziometrico è particolarmente adatto per studiare pH extracellulare in biofilm sottili fino a 75 micron di spessore, ma è limitato al campo di pH tra 4,5 e 7,0.

Introduction

Il metodo qui descritto permette di monitorare pH extracellulare in biofilm dentali nell'intervallo tra 4,5 e 7, utilizzando il colorante raziometrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale. Il colorante fluorescente impiegata è sensibile al pH e visualizza un cambiamento nella sua emissione fluorescente a seconda dello stato di protonazione. L'emissione fluorescente dei picchi molecola protonata a 580 nm, e l'emissione della molecola deprotonata a 640 nm ^1. Il rapporto tra le intensità di emissione fluorescente in due finestre di rilevazione comprendente i due picchi di emissione (576 - 608 nm ei 629 - 661 nm) riflette quindi pH nella fase liquida, indipendentemente dalla concentrazione di colorante. Con un pK _a di ~ 6,4 colorante è adatto per visualizzare pH in ambienti moderatamente acide.

PH in biofilm batterici è di fondamentale importanza per tutti i processi metabolici.Nel caso di biofilm dentali, pH nella matrice extracellulare è il fattore di virulenza chiave per lo sviluppo della carie dentaria. Lunghi periodi con un basso pH al comando di interfaccia biofilm-dente per rallentare la demineralizzazione dello smalto di fondo ^2. A causa della complessa architettura tridimensionale di biofilm, metaboliti, tra cui gli acidi organici, non sono distribuiti uniformemente in tutto il biofilm. Altamente e meno microambienti acidogeni possono essere trovati in prossimità spaziale ^3.

Per decenni, i gradienti di pH verticali in biofilm sono stati registrati con l'aiuto di microelettrodi ^4-6. Mentre offrono una buona risoluzione spaziale a causa della loro dimensione piccola punta, non sono particolarmente adatti per monitorare i gradienti orizzontali. Inoltre, l'inserimento dell'elettrodo disturba il biofilm meccanicamente. tecniche microscopiche a fluorescenza quantitative offrono il vantaggio di visualizzare variazioni di pH nei diversi settori di un biofilm, senza interferire meccanicance. Diversi campi microscopici di vista possono essere scelti liberamente e ripreso più volte per periodi prolungati ^1,7-9. Tuttavia, quando si interpretano immagini microscopiche biofilm, è importante distinguere tra la fluorescenza derivante dalla biomassa microbica e fluorescenza derivante dallo spazio extracellulare. In condizioni acide, pH all'interno delle cellule batteriche è diverso da pH nella matrice extracellulare, come i batteri trasportano attivamente protoni attraverso la membrana cellulare a scapito di adenosina trifosfato ^10. Nel contesto della carie dentale, pH batterica intracellulare non ha un impatto diretto sullo smalto sottostanti, mentre bassi valori di pH extracellulare porta alla demineralizzazione. Una media di pH nelle immagini microscopiche che contengono entrambe le aree prive di batteri e batteri porta a risultati errati. L'uso di altre macchie insieme con il colorante sensibile al pH per visualizzare la biomassa batterica e differenziare tra le aree extra ed intracellulari porta abil rischio di contaminazione fluorescente dello spazio extracellulare e false misurazioni ^11.

La presente manoscritto descrive pertanto l'uso del colorante raziometrica in una duplice funzione; sia come marcatore pH e come una macchia batterica universale. Poiché il colorante è up-concentrato in cellule batteriche, la combinazione di confocale immagini microscopiche e un'accurata procedura di analisi di immagine digitale consente la determinazione del pH extracellulare nel campo tra 4,5 e 7,0 in biofilm dentali sottili.

Protocol

Il protocollo sperimentale è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico di Aarhus County (M-20.100.032).

1. confocale microscopica calibrazione del Raziometrico Dye

1. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio invertito confocale equipaggiato con un incubatore, un obiettivo ad immersione dell'acqua apertura 63X / 1.2-numerica, una linea laser 543 nm e un rivelatore META.
2. Preparare tampone HEPES soluzioni madre (50 mm, portata a pH 4.5-8.5 in passi di unità 0,1 pH). Dispensare 100 ml di ogni soluzione nei pozzetti di una chiara-bottom piastra a 96 pozzetti per la microscopia a fluorescenza.
3. Indossare guanti di nitrile quando si maneggia il colorante raziometrica C-SNARF-4. Preparare una 1 mM soluzione madre del colorante in dimetilsolfossido. Aggiungere 5 ml di soluzione madre di ogni pozzetto con tampone HEPES. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul microscopio.
4. Accendere il microscopio. Aprire il software microscopio. Clicca i seguenti pannelli: Acquisire → Laser; Acquisire → MICRO; Acquisire → Config; Acquisire → Scan; Acquisire → Stage. Riscaldare l'incubatore a 37 ° C.
5. Accendere la linea laser 543 nm cliccando sul laser a 543 nm e il tasto "On" nella finestra "Controllo Laser". Scegliere l'obiettivo di immersione in acqua apertura 63X / 1.2-numerico nella finestra "Microscope Control".
6. Impostare il rilevatore META di monitorare simultaneamente la fluorescenza all'interno 576- a 608 nm (verde) e 629- a 661 nm intervalli di (RED) ( "Controllo Configurazione" → "ChS"). Regolare la potenza del laser ( "Controllo Configurazione" → "eccitazione"). Impostare il foro stenopeico per produrre uno spessore fetta ottica di 1,6 micron ( "Scan Control" → "Pinhole").
7. Acquisire un'immagine di ogni soluzione tampone HEPES, 5 micron sopra il fondo di vetro della piastra a 96 pozzetti. Nota: Appena il piano focale è situato sotto il fondo di vetro, nessuna luce fluorescente può essere vistosullo schermo. Dopo ogni terza immagine, impostare la potenza del laser a zero e prendere una immagine di sfondo sottrazione.
8. Eseguire l'esperimento di calibrazione in triplice copia (1,2-1,7).
9. Determinare l'intensità della fluorescenza media e deviazione standard in tutte le immagini rosse e verdi.
   1. Calcolare il rapporto R ed errore standard della media, S _R, per ogni immagine in base alle equazioni (1) e (2)
      (1)
      (2)
      g, r, s _g e s _r sono le medie e le deviazioni standard nei rispettivi immagini verde e rosso. b _g, b _R, S _bg e s _br sono i valori corrispondenti per le immagini di sfondo. n 2 è il numero di pixel imaged.
   2. Tracciare i rapporti calcolati per ciascun valore di pH dei tre esperimenti di calibrazione replica in un diagramma e costruire una curva montato da questa serie di punti dati (vale a dire utilizzando il software SigmaPlot 13). Fare una funzione matematica dalla curva montato in grado di convertire i rapporti in valori di pH ^10.

2. Raccolta di In Situ Grown dentale biofilm Campioni

1. Selezionare volontari che soddisfano i criteri di inclusione ed esclusione rilevanti per lo studio. Fare impressioni alginato di loro arcata dentaria superiore e inferiore. Fare modelli del cast da queste impressioni e produzione di una stecca acrilico nella mandibola. Progettare la stecca con flange acrilici buccali collegati da un filo ortodontico linguale che permette al volontario di mordere normale occlusione ^12.
2. Recessioni Drill nelle flange buccali della stecca acrilico (Figura 1
3. Per la raccolta biofilm, lastre su misura non fluorescenti di vetro (4 x 4 x 1 mm ³⁾ con una rugosità superficiale di graniglia 1200 al fine di imitare il modello di colonizzazione su smalto naturale ^11.
4. Sterilizzare le lastre di vetro in autoclave prima del montaggio. Montare le lastre di vetro con cera collante nelle depressioni nelle flange buccali di ciascun lato leggermente incassati alla superficie della superficie acrilica per proteggere il biofilm da forze di taglio esercitate dal movimento delle guance ^11.
   Nota: Il numero di lastre di vetro disposte in recessione può variare tra 3 e 14, a seconda dello scopo dello studio.
5. Inserire l'apparecchio in bocca del volontario. Istruire il VolunTeer di mantenere l'apparecchio intra-orale per tutto il periodo sperimentale. Istruire il volontario per immagazzinare l'apparecchio in un contenitore fermo ortodontico con un pezzo di tessuto carta bagnata (per mantenerlo umido) a temperatura ambiente durante lo spazzolamento dei denti e l'assunzione di cibo e bevande diverse dall'acqua. Istruire il volontario a non toccare le flange acrilici buccali con le lastre di vetro durante l'inserimento e la rimozione dell'apparecchio.
   Nota: Il periodo sperimentale può variare a seconda dello scopo dello studio (un giorno a diverse settimane).
6. Rimuovere accuratamente le lastre di vetro dalla macchina al termine del periodo sperimentale. Rimuovere la cera adesiva intorno le lastre con un coltello e trasferirli con un paio di pinzette per un contenitore chiuso, il biofilm rivolta verso l'alto, fino all'analisi microscopica. Tenere il contenitore umido con fazzoletto di carta bagnata. Eseguire l'imaging pH entro poche ore dalla raccolta biofilm.

3. biofilm pH Imaging

1. Prepararesoluzione salivare aggiungendo ditiotreitolo alla saliva raccolta secondo il metodo di de Jong et al. ^13. Titolare la soluzione salivare a pH 7.0 e aggiungere il glucosio ad una concentrazione di 0,4% (peso / volume). Dispensare 100 microlitri per biofilm da analizzare in un 96-pozzetti con fondo di vetro per la microscopia. Aggiungere 5 ml di tintura raziometrico per pozzetto.
2. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul palco microscopio. Accendere il microscopio e la linea laser 543 nm. Riscaldare l'incubatore a 37 ° C. Utilizzare le stesse impostazioni microscopio come per la calibrazione del colorante (vedere i passaggi 1,5-1,6). Attendere per 30 minuti, fino a quando la piastra a 96 pozzetti ha raggiunto la temperatura di lavoro.
3. Pick up una o più lastre di vetro con un insieme sottile di pinzette e metterli nei pozzetti saliva pieno, una lastra per pozzetto, con i biofilm rivolti verso il basso.
4. Acquisire le immagini singole ( "Scan Control" → "single") o Z-stack ( "Scan Control" → "Start") spanning la profondità dei biofilm in diversi settori. Per acquisire z-stacks scegliere il numero di fette di essere ripreso ( "Scan Control" → "Impostazioni Z" → "Num fette") e segnare la posizione z per la prima e l'ultima fetta nel software del microscopio ( "Scan Control "→" Impostazioni Z "→" Mark First "," Mark last ").
   Nota: Z-stack con una profondità massima di 75 micron possono essere acquisite con un buon contrasto tra le aree extracellulari e intracellulari.
5. Per seguire variazioni di pH in un campo di vista microscopico nel corso del tempo, marcare la xy posizione nel software del microscopio ( "stage e di controllo messa a fuoco" → "Mark Pos") e prendere immagini ripetute in momenti successivi ( "Scan Control" → " Singolo"). Regolarmente prendere le immagini con la potenza del laser impostato a zero per sottrazione del fondo.

4. Analisi Digital Image

1. per export le immagini microscopiche come file TIF, usano l'esportazione di file batch del software microscopio ( "Macro" → "Batch File Export"). Selezionare i file da esportare e salvare le immagini del canale rosso e verde in cartelle separate come TIF-files ( "Start Batch Export"). Rinominare i file in entrambe le cartelle dando loro numeri sequenziali.
2. Importare la serie di immagini rosso e verde in software come Daime (analisi di immagine digitale in ecologia microbica) ^14. Segmento le immagini del canale verde con soglie scelti individualmente luminosità (segmento → → segmentazione automatica di soglia personalizzate). Scegliere le soglie di luminosità con cura (tipicamente tra 20 e 80), in modo che tutti i batteri (più luminosa della matrice extracellulare), ma non la matrice saranno riconosciuti come oggetti durante la segmentazione. Verificare visivamente che le aree riconosciute come oggetti corrispondono bene alla biomassa batterica.
3. Trasferire il livello di oggetto del g segmentatoimmagini reen canale alle immagini dei canali rosso corrispondenti (segmento → Trasferimento strato oggetto). Utilizzare la funzione Editor oggetti di rifiutare e cancellare tutti gli oggetti nelle immagini del canale rosso e verde. Ora solo la matrice extracellulare è lasciato nelle immagini biofilm. Esportare la serie immagine elaborata sotto forma di file TIF.
4. Importare la serie di immagini in ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinare l'intensità media di fluorescenza nelle immagini di sfondo scattate con il laser spento (Analisi → Istogramma). Sottrarre il fondo adeguato dalle immagini rosso e verde (processo → Math → Sottrai).
5. Ancora in ImageJ, dividere la serie di immagini verde (G1) da solo (processo → Immagine calcolatrice). Quindi moltiplicare la serie immagine risultante (G2) con la serie di immagini verde (G1). Questo produrrà una serie di immagini (G3), dove NaN viene assegnato a tutti i pixel che appartengono a zone che sono state riconosciute come oggetti in Daime. Procedere in tlui stesso modo con la serie rosso immagine (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3).
   Nota: Poiché la biomassa batterica è stato rimosso dalle immagini nel passaggio 4.3, l'intensità fluorescente è 0 in queste aree. Fase 4.5 è necessario convertire il valore 0 per NaN, che permette di calcolo del rapporto nel passo 4.6.
6. Applicare il filtro 'Mean' (processo → → Filtri Media; raggio: 1 pixel) per compensare il rumore del rivelatore. Dividere la serie immagine verde dalla serie di immagini rosso (processo → Immagine calcolatrice). Ciò si traduce in un rapporto verde / rosso per ogni pixel rimanente nello spazio extracellulare delle immagini. Utilizzare falsa colorazione per la rappresentazione grafica dei rapporti nelle immagini (Tabelle Immagine → Lookup). Calcolare il rapporto medio per ogni immagine (Analisi → Istogramma).
7. Convertire i rapporti di verde / rosso a valori di pH in base alla funzione montato sotto 1.9.2). Nota: Un esempio per dati di calibrazione e la curva a muro può essere visto in Schlafer etal 2015 ^11.

Representative Results

Il metodo presentato consente pH extracellulare monitoraggio scende in differenti microambienti di biofilm dentali nel range di pH da 4,5 a 7 in tempo reale. Se le condizioni sperimentali sono scelti come descritto sopra, pH inizia a cadere in tutte le aree del biofilm poco dopo l'esposizione al glucosio.

Quando il pH in un biofilm gocce, cellule batteriche diventano visibili entro breve tempo (<1 min), come il colorante è raziometrica upconcentrated in cellule (Figura 2A). In fin dall'inizio, prima che la produzione di acido nelle partenze biofilm, nessuna differenza può essere visto tra sfondo e le cellule. Immagini esportati nel Daime software devono essere segmentato con soglie di luminosità scelti individualmente per ottenere una buona congruenza tra la biomassa batterica nelle immagini e quelli riconosciuti dal programma (Figura 2B). Se segmentato approtamente, la cancellazione di oggetti in Daime rimuove tutti i segnali fluorescenti che derivano da cellule batteriche (Figura 2C). Successiva elaborazione delle immagini in ImageJ provoca verdi rapporti / rosso per pixel nello spazio extracellulare delle immagini. Con l'aiuto della curva di taratura, questi rapporti possono essere convertiti in valori di pH e visualizzate con falsa colorazione per la rappresentazione grafica (Figura 2D). PH medio può essere calcolato per ciascuna delle immagini elaborate, e lo sviluppo pH può essere seguita nel tempo (figura 2E). gocce di pH possono variare tra i diversi settori di vista microscopico, ed entrambi i gradienti di pH orizzontali e verticali possono essere monitorati. Tuttavia, in condizioni statiche, all'interno di biofilm sottili, solo piccole gradienti di pH verticali possono essere osservati.

In alcuni casi, l'intero campo di vista microscopico potrebbe essere coperto con cellule batteriche che rende calcolo extracellularepH impossibile (Figura 3A). Il problema potrebbe essere risolto selezionando un piano focale leggermente diverso. Bisogna fare attenzione a non sovraesporre le immagini microscopiche, in quanto la biomassa batterica nelle immagini poi si estende su una superficie più ampia che nella realtà (Figura 3B). Quando segmentare l'immagine in Daime è fondamentale scegliere soglie di luminosità che riconoscono tutte le cellule batteriche e, se presenti, le cellule epiteliali umane (Figura 3C) come oggetti. Se la segmentazione è effettuata con soglie troppo alta luminosità, aree intracellulari saranno inclusi nel calcolo del pH e portano a risultati erronei (Figura 3D). Il monitoraggio del pH extracellulare con il colorante raziometrico è limitato dall'uso di microscopia confocale. Fino a una profondità di penetrazione di 75 micron, aree extra ed intracellulari possono distinguere in modo affidabile (Figura 3E). Per misurare i gradienti di pH verticali in biofilm più spessi, microelettrodi rimangono soddisfattehod di scelta.

Figura 1:.. Stecca acrilico per intraorale biofilm Collection La stecca è stato progettato con flange acrilici buccali collegati da un filo ortodontico linguale che permette al volontario di mordere in occlusione normale prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Elaborazione di immagini per microscopico Misurazione del extracellulare biofilm pH (A) confocale immagine al microscopio di un biofilm macchiato con il colorante raziometrico, 9 min dopo l'esposizione al glucosio. La biomassa batterica nell'immagine può essere distinto dallo sfondo extracellulare. (B) La stessa immagine dopo la segmentazione in Daime. L'intera biomassa batterica nel campo di vista microscopico è stato riconosciuto come oggetti durante la segmentazione, come indicato dalle linee arancioni. (C) La stessa immagine dopo la rimozione della biomassa batterica. Tutti fluorescenza derivante da cellule batteriche è stato rimosso, e solo la fluorescenza derivante dalla matrice extracellulare viene lasciato nell'immagine. (D) Rappresentazione grafica del pH extracellulare nello stesso campo di vista microscopico. rapporti di verde / rosso sono stati calcolati in ImageJ, e falsa colorazione è stata applicata per la rappresentazione grafica del pH extracellulare. Media pH extracellulare = 5.86. (AD) Scala bar = 20 micron. (E) goccia media pH nello stesso campo di vista microscopico, monitorati per 15 min. La caduta di pH in questa zona del biofilm è più veloce all'inizio, poco dopo l'esposizione al glucosio. Poi rallenta ma non raggiunge un plateau entro il tempo di osservazione.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Misura microscopica di extracellulare biofilm pH - potenziali problemi e gli errori (A) confocale immagine al microscopio di un biofilm denso esposti al glucosio e colorati con il colorante raziometrico. In questo campo di vista microscopico, l'intera immagine è coperto con cellule batteriche, e la rimozione dei batteri non lasciare zone extracellulari di calcolo pH. (B) Sovraesposta confocale immagine al microscopio di un biofilm macchiato con il colorante raziometrico. Durante la segmentazione di immagini di immagini sovraesposte aree più grandi che in realtà coperti da batteri vengono riconosciuti come oggetti e parte dello spazio extracellulare è perso per il calcolo del pH. (C) BIOFimmagine ilm con cellule epiteliali (frecce). soglie di luminosità per la segmentazione di immagini devono essere scelti, in modo che le cellule epiteliali sono riconosciuti come oggetti e rimossi dalle immagini prima del calcolo pH. (D) L'immagine stessa biofilm come in Figura 1B, segmentato con una soglia di luminosità errata. Parte della biomassa batterica non viene riconosciuto come oggetti e non può essere rimosso dall'immagine. Questo porta ad inclusione delle zone intracellulari nel calcolo del pH e risultati di conseguenza errati. (E) strato profondo di un biofilm macchiato con il colorante raziometrico. L'immagine è stata acquisita il 90 micron dall'interfaccia biofilm-substrato. La differenziazione tra le aree extra-intracellulari e viene compromessa. Barre di scala = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Monitoraggio microscopico di pH biofilm fornisce diversi vantaggi, rispetto ad elettrodo o microelettrodi misurazioni ^4-6. tecniche microscopiche permettono di determinare il pH con una risoluzione spaziale elevata e consentire catturare gradienti di pH orizzontali e verticali in biofilm senza disturbare il biofilm meccanicamente. I precedenti tentativi di monitoraggio del pH microscopico, tuttavia, non sono riusciti a distinguere tra il pH extracellulare e intracellulare nei biofilm ^1,7,9. A causa di omeostasi batterica, pH intracellulare differisce dal pH extracellulare, e calcoli di pH non può essere valido se entrambi compartimenti intra ed extracellulari contribuiscono alla emissione fluorescente registrata. L'uso di un secondo colorante fluorescente insieme con il colorante sensibile pH a visualizzare le cellule batteriche è problematico, in quanto anche una piccola sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei coloranti potrebbe compromettere la quantificazione di luce fluorescente. Pertanto, la tecnica qui presentatasi basa su un gradiente di concentrazione del colorante raziometrico tra i compartimenti extra- ed intracellulari del biofilm di identificare e successivamente rimuovere le cellule batteriche dalle immagini acquisite pH.

Dopo colorazione con il colorante fluorescente, cellule batteriche in biofilm internalizzare ed aggiornata concentrano la molecola, ma solo in condizioni acide. pH ratiometry con il colorante è quindi limitato al campo di pH compreso tra 4,5 e 7,0. A valori di pH superiori a 7, il colorante senza protoni, e quindi caricata non penetra cellule batteriche abbastanza bene per distinguerle dallo sfondo extracellulare, ea valori di pH inferiori a 4,5 la maggior parte delle molecole di colorante sono protonata e ulteriori cambiamenti nella emissione fluorescente può essere osservato. La curva montato (pH vs. rapporto verde / rosso) è più ripida intorno pH 6 e si appiattisce verso pH 4.5. Un esempio è mostrato in Schlafer et al., 2015, Figura S2. ¹¹ Attualmente l'uso del colorante fluorescente per pH ratiometry è limitato amonitoraggio del pH extracellulare ^1. In linea di principio, il colorante potrebbe anche essere utilizzato per monitorare intracellulari variazioni di pH batteriche, ma finora, la calibrazione non è stata eseguita per uso intracellulare. Inoltre, sarebbe difficile distinguere accuratamente fra emissione fluorescente intracellulare e luce fluorescente derivanti da molecole di colorante attaccato all'esterno della parete cellulare batterica. Inoltre, come colorazione con il colorante raziometrico è usato in combinazione con la microscopia confocale, acquisizione di immagini in strati biofilm più profondo di 75 micron dall'interfaccia vetro di copertura / biofilm è compromessa. Diminuendo il contrasto tra le cellule batteriche e matrice extracellulare rende la differenziazione tra intra ed extracellulari aree difficili. Il colorante impiegato raziometrico ha dimostrato di visualizzare in modo affidabile 15 specie batteriche associate a biofilm dentale, e macchie tutte le cellule batteriche in biofilm dentali coltivate in situ ^11. Mentre è probabile che ildye raziometrico è una macchia batterica universale, questo non è ancora stata provata e la macchia deve essere testato su biofilm da altri habitat rispetto alla cavità orale. Il metodo non consente di produrre replicati tecnici di una data misura di pH, come acquisizione dell'immagine richiede alcuni secondi e pH biofilm cambia dinamicamente. l'imaging ripetuta di soluzioni tampone senza biofilm, tuttavia, e ripetuto l'imaging di biofilm nel buffer hanno prodotto valori di pH stabili (dati non riportati).

Tutte le fasi del procedimento sopra descritto per l'elaborazione delle immagini devono essere seguite accuratamente. immagini biofilm devono essere acquisite con il laser sufficiente potere / guadagno per ottenere adeguati livelli di segnale fluorescente nella matrice extracellulare, ma la sovraesposizione delle cellule batteriche devono essere evitati. Se le cellule batteriche sono sovraesposte (potenza del laser troppo elevata o guadagno) aree più grandi che in realtà coperti da batteri vengono riconosciuti come oggetti durante la segmentazione di immagine e parte dello spazio extracellulare è persoper il calcolo del pH (vedere Figura 3B). D'altra parte, se le immagini sono acquisite a bassissima potenza del laser / guadagno, l'intensità fluorescente dello spazio extracellulare potrebbe non essere sufficiente per il calcolo dei coefficienti affidabile emissione verde / rosso. Uno strumento indicatore Gamma nel software del microscopio può essere utilizzato per regolare le impostazioni microscopio, in modo che le cellule batteriche vengono catturati con intensità massima, ma senza sovraesposizione. segmentazione di immagini automatica deve essere controllato per tutte le immagini biofilm per assicurare che tutti batterica e, se presenti, le cellule eucariotiche sono riconosciuti come oggetti nel software. Dopo la segmentazione, tutte le immagini biofilm dovrebbero essere confrontati uno per uno per le rispettive immagini non segmentati per accertare congruenza tra la biomassa batterica e l'area riconosciuta come oggetti. Se le aree più grandi di quelle coperte da batteri vengono riconosciuti come oggetti della soglia di luminosità è troppo basso per una differenziazione accurata, e la segmentazione deve essere eseguita con un sistema hisoglia di luminosità gher. Se una parte della biomassa batterica non è tra gli oggetti, la soglia di luminosità deve essere abbassata per ottenere una corretta differenziazione tra spazio extracellulare e intracellulare. Per l'analisi di grandi insiemi di dati si è dimostrato vantaggioso segmento tutte le immagini con una fila di diverse soglie di luminosità e determinare poi la soglia ideale per ciascuna immagine. Una volta che una corretta distinzione tra batteri e matrice extracellulare viene raggiunto, ulteriori problemi si prevedono durante l'elaborazione dell'immagine. Possono tuttavia essere alcune immagini con un biofilm molto denso, in cui i batteri coprono l'intero campo di vista microscopico. In queste immagini, ovviamente, pH extracellulare non può essere determinato. In alcuni casi il problema può essere risolto con l'acquisizione di immagini in un leggermente diverso piano z, dove la biomassa batterica non copre l'intero campo visivo.

Ulteriori applicazioni di extracellulare ratiometry pH potrebbe essere quello di studiarepaesaggi di pH in altre comunità microbiche di biofilm dentali (es. biofilm Pseudomonas aeruginosa o biofilm batterici corrente-producono). L'effetto di diversi parametri ecologici, come la concentrazione di ossigeno, fornitura carboidrati o applicazione di corrente elettrica su pH biofilm potrebbe essere determinata. L'influenza dell'età biofilm, spessore biofilm e l'attività metabolica sul pH può essere studiata, così come l'effetto di agenti pH modulare su biofilm batterici. Quest'ultimo è particolarmente rilevante nel contesto dei biofilm dentali, dove agenti tampone rappresentano un approccio terapeutico promettente per controllare la carie dentale ^15. Inoltre, la ricerca futura dovrebbe concentrarsi su come applicare il metodo presentato in condizioni di flusso. Fino ad oggi il pH extracellulare ratiometry è stato utilizzato solo per il monitoraggio del pH in condizioni statiche. fornitura costante di mezzo fresco ossigenato può avere un notevole impatto sullo sviluppo di microambienti pH e, inparticolari, sfumature di pH verticali all'interno di biofilm sottili. La clearance di acidi per mezzo di flusso potrebbe contribuire alla creazione di gradienti verticali anche in biofilm molto sottili.

Raziometrico immagini microscopiche confocale con il colorante raziometrico C-SNARF-4 in combinazione con precisione postprocessing delle immagini acquisite permessi digitali per calcolare e visualizzare pH biofilm nella matrice extracellulare, in tempo reale, nel range di pH tra 4,5 e 7,0 e fino a spessore biofilm di 75 micron.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/