Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH ​​i Dental Biofilm

Summary

Et pH-følsomt fargestoff ratiometrisk brukes i kombinasjon med konfokal laser-skanning mikroskopi og digital bildeanalyse for å overvåke ekstracellulære pH i tann biofilmer i sanntid.

Abstract

PH i bakterie biofilmer på tennene er av sentral betydning for tannråte, en sykdom med høy globale utbredelsen. Næringsstoffer og metabolitter blir ikke fordelt jevnt i dental biofilm. Et komplekst samspill av sorpsjon til og omsetning med organisk materiale i biofilm reduserer diffusjon banene for oppløste stoffer og skaper bratte stigninger av reaktive molekyler, inkludert organiske syrer, på tvers av biofilm. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske metoder, for eksempel fluorescens levetid avbildning eller pH ratiometry, kan brukes til å visualisere pH i ulike microenvironments tann biofilm. pH ratiometry utnytter en pH-avhengig skift i fluorescensemisjonen fra pH-følsomme fargestoffer. Beregning av emisjonsforholdet ved to forskjellige bølgelengder gjør det mulig å bestemme lokal pH i mikroskopiske bilder, uavhengig av konsentrasjonen av fargestoffet. I motsetning til mikroelektroder teknikken tillater overvåking både vertikale og horisontale pH-gradienter i sanntid medut mekanisk forstyrre biofilm. Imidlertid må man sørge for å skille nøyaktig mellom ekstra- og intracellulære kamre i biofilmen. Her er den ratiometrisk fargestoff, seminaphthorhodafluor-4F 5- (og 6-) karboksylsyre (C-snarf-4) anvendes for å overvåke ekstracellulære pH i in vivo-dyrket tann biofilm med ukjent artssammensetning. Ved eksponering til glukose fargestoffet er opp-konsentrert på innsiden av alle bakteriecellene i biofilmer; Det benyttes således både som en universell bakterie flekk og som en markør av ekstracellulært pH. Etter confocal mikroskopisk bilde oppkjøpet, er bakteriell biomasse fjernes fra alle bildene ved hjelp av digital bildeanalyse programvare, som tillater å utelukkende beregne ekstracellulære pH. pH ratiometry med den ratiometrisk fargestoffet er godt egnet for å studere ekstracellulære pH i tynne biofilm på opp til 75 um tykkelse, men er begrenset til det pH-område mellom 4,5 og 7,0.

Introduction

Den metode som er beskrevet her gjør det mulig å overvåke ekstracellulære pH i tann biofilmer i området mellom 4.5 og 7, ved hjelp av ratiometrisk fargestoff seminaphthorhodafluor-4F 5- (og 6-) karboksylsyre (C-snarf-4) i kombinasjon med konfokal laser-skanning mikroskopi og digital bildeanalyse. Den næringsdrivende fluorescerende fargestoff er pH-følsomt og viser et skifte i sin fluorescensemisjon avhengig av tilstanden av protonering. Fluorescensemisjonen fra de protonerte molekyl topper ved 580 nm, og emisjonen av den deprotonerte molekylet ved 640 nm ^1. Forholdet mellom fluorescens-emisjonsintensitet i to deteksjons vinduer omfattende de to utslipps toppene (576-608 nm og 629-661 nm) reflekterer således pH-verdien i den flytende fase, uavhengig av fargestoff konsentrasjon. Med en _pKa på ~ 6,4 fargestoffet er egnet til å visualisere pH i moderat sure miljøer.

PH i bakterielle biofilmer er av sentral betydning for alle metabolske prosesser.I tilfelle av tann biofilmer, pH i den ekstracellulære matriks er nøkkelen virulens faktor for utviklingen av karies. Lengre perioder med lav pH i biofilm-tann grensesnitt føre til treg demineralisering av den underliggende emalje ^to. På grunn av den komplekse tredimensjonale arkitektur av biofilm, metabolitter, innbefattende organiske syrer, ikke er jevnt fordelt på tvers av biofilm. Høyt og mindre acidogenic microenvironments kan finnes i umiddelbar romlig nærhet ^tre.

I flere tiår ble vertikale pH-gradienter i biofilmer spilt inn med hjelp av mikroelektroder ^4-6. Mens de tilbyr en god romlig oppløsning på grunn av sin lille spissen størrelse, de er ikke godt egnet til å overvåke horisontale gradienter. Videre, innføring av elektroden forstyrrer biofilmen mekanisk. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske teknikker tilbyr fordelen av å visualisere pH-endringer i ulike områder av en biofilm uten mekanisk forstyrreNCE. Ulike mikroskopiske synsfelt kan velges fritt og avbildes gjentatte ganger over lengre perioder ^1,7-9. Imidlertid, når man tolker mikroskopiske biofilm-bilder, er det viktig å skille mellom fluorescens som stammer fra mikrobiell biomasse og fluorescens som stammer fra det ekstracellulære rom. I sure betingelser, pH innenfor bakteriecellene er forskjellig fra pH-verdien i den ekstracellulære matriks, som bakterier aktivt transporterer protoner gjennom cellemembranen på bekostning av adenosintrifosfat ^10. I sammenheng med karies, betyr intracellulær bakterie pH ikke har en direkte innvirkning på de underliggende emalje mens lav ekstracellulære pH fører til demineralisering. Gjennomsnitt pH i mikroskopiske bilder som inneholder både bakteriefrie områder og bakterier fører til feilaktige resultater. Bruken av andre flekker sammen med den pH-følsomt fargestoff for å visualisere bakteriell biomasse og skille mellom ekstra- og intracellulære områder bringer abut risikoen for fluorescerende forurensning av det ekstracellulære rom og falske målinger ^11.

Den foreliggende manuskriptet beskriver således bruken av den ratiometrisk fargestoff i en dobbeltfunksjon; både som en pH-markør og som en universell bakterie flekk. Som fargestoff er opp-konsentrert i bakterieceller, er kombinasjonen av konfokal mikroskopisk avbildning og en nøyaktig digital bildeanalyse fremgangsmåte tillater bestemmelse av ekstracellulære pH i området mellom 4,5 og 7,0 i tynne tann biofilmer.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen ble gjennomgått og godkjent av etikkomiteen av Århus amt (M-20100032).

1. Confocal Mikroskopisk Kalibrering av Proporsjonellekspansjon Dye

1. For bildeoverføring, kan du bruke en omvendt confocal mikroskop utstyrt med en inkubator, et 63X / 1.2-numerisk aperture vann nedsenking objektiv, en 543 nm laser linje og en META-detektor.
2. Forbered HEPES buffer stamløsninger (50 mM, innstilt til pH 4,5 til 8,5 i trinn på 0,1 pH-enheter). Pipetter 100 ul av hver oppløsning inn i brønnene til en klar bunnet 96-brønns plate for fluoriserende mikroskopi.
3. Bruke nitrilhansker ved håndtering av proporsjonal fargestoff C-snarf-4. Tilbered en 1 mM stamløsning av fargestoffet i dimetylsulfoksyd. Tilsett 5 ul av stamløsningen til hver brønn med HEPES-buffer. Plasser 96-brønn plate på mikroskopet.
4. Slå på mikroskopet. Åpne mikroskop programvare. Klikk følgende paneler: Innhente → Laser; Acquire → Micro; Acquire → Config Acquire → Scan; Acquire → Stage. Varm opp inkubatoren til 37 ° C.
5. Slå på 543 nm laser linje ved å klikke på 543 nm laser og "On" -knappen i "Laser Control" vinduet. Velg 63X / 1.2-numerisk aperture vann nedsenking objektiv i "mikroskop Control" vinduet.
6. Sett META detektoren å samtidig overvåke fluorescens innenfor 576- til 608-nm (grønn) og 629- til 661 nm (rød) intervaller ( "Configuration Kontroll" → "CHS"). Juster lasereffekten ( "Configuration Control" → "Eksitasjon"). Sett pinhole å gi en optisk skive tykkelse på 1,6 mikrometer ( "Scan Control" → "Pinhole").
7. Erverve et bilde av hver HEPES bufferløsning, 5 um over glass bunnen av 96-brønns plate. Merk: Når fokusplanet ligger under glassbunn, kan ingen fluorescerende lys seespå skjermen. Etter hvert tredje bilde, sette laseren makt til null og ta et bilde for bakgrunnen subtraksjon.
8. Utfør kalibreringen eksperiment i tre eksemplarer (01.02 til 01.07).
9. Bestem gjennomsnittlig fluorescerende intensitet og standardavvik i alle røde og grønne bilder.
   1. Beregne forholdet R og standard feil av gjennomsnittet, S _R, for hvert bilde i henhold til ligningene (1) og (2)
      (1)
      (2)
      g, r, s og s _{g r} er gjennomsnittet og standardavvik i de respektive grønne og røde bilder. b _g, b _R, S _bg og s _br blir de tilsvarende verdier for bakgrunnsbildene. n 2 er antall piksler fotografert.
   2. Plott de beregnede forholdstall for hver pH-verdi fra de tre replikere kalibrerings eksperimenter i et diagram og konstruere en montert kurve fra denne serien av datapunkter (dvs. ved hjelp av programvaren Sigmaplot 13). Lag en matematisk funksjon fra montert kurve som kan konvertere forholdstall til pH-verdier ^10.

2. Innsamling av In Situ Grown Dental Biofilm Samples

1. Velg frivillige som oppfyller inklusjons- og eksklusjonskriterier som er relevante for studiet. Gjør alginat inntrykk av deres øvre og nedre dental bue. Gjør støpte modeller fra disse inntrykkene og produsere en akryl splint i underkjeven. Design splint med kinn akryl flenser forbundet med en språklig ortodontiske wire som gjør at frivillig til å bite i normal okklusjon ^12.
2. Bor resesjoner i munn flenser akryl skinne (Figur 1
3. For biofilm samling, bruker skreddersydde ikke-fluorescerende glassplater (4 x 4 x 1 mm ³⁾ med en overflateruhet på grus 1200 for å etterligne kolonisering mønster på naturlig emalje ^11.
4. Sterilglassplater ved autoklave før montering. Montere glassplater med klebrig voks i fordypningene i den buccale flens på hver side litt forsenkede til overflaten av akryl overflate for å beskytte den biofilm fra skjærkrefter som utøves ved bevegelse av kinnene ^11.
   Merk: Antallet av glassplater som er plassert i en nedgang, kan variere mellom 3 og 14, avhengig av formålet med undersøkelsen.
5. Sett apparatet i munningen av frivillige. Instruere frivillighetsteer å holde apparatet intra-oral gjennom hele forsøksperioden. Be frivillig til å oppbevare apparatet i en kjeveortopedisk retainer beholder med et stykke vått papir vev (for å holde det fuktig) ved romtemperatur under tannpuss og inntak av mat og drikke annet enn vann. Be frivillig å ikke berøre munn akryl flenser med glassplater mens plassere og fjerne apparatet.
   Merk: Den eksperimentelle perioden kan variere avhengig av formålet med undersøkelsen (en dag til flere uker).
6. Fjern forsiktig glassplater fra apparatet ved slutten av den eksperimentelle perioden. Ta av klistre voks rundt platene med en kniv og overføre dem med en pinsett til en lukket beholder, biofilm vendt oppover, inntil mikroskopisk analyse. Oppbevar beholderen fuktig med vått papir vev. Utfør pH avbildning innen få timer etter biofilm samling.

3. Biofilm pH Imaging

1. Forberedespytt-løsning ved å tilsette ditiotreitol til samlet spytt i henhold til fremgangsmåten ifølge de Jong et al., ^13. Titrer spytt løsningen til pH 7,0 og tilsett glukose til en konsentrasjon på 0,4% (vekt / volum). Pipetter 100 ul pr biofilm som skal analyseres inn i en glass-bunnet 96-brønns plate for mikroskopi. Tilsett 5 mL av proporsjonal fargestoff per brønn.
2. Plasser 96-brønn plate på mikroskopet scenen. Slå på mikroskopet og 543 nm laser linje. Varm opp inkubatoren til 37 ° C. Bruk de samme mikroskop innstillingene som for kalibreringen av fargestoff (se trinn 1,5-1,6). Vent i 30 minutter, inntil 96-brønns plate har nådd driftstemperatur.
3. Plukk opp en eller flere glassplater med en slank sett av pinsett og legg dem i spytt fylte brønner, en skive per brønn, med biofilm vendt nedover.
4. Erverve enkeltbilder ( "Scan Control" → "single") eller z-stabler ( "Scan Control" → "Start") spanning dybden av biofilm i ulike områder. Å tilegne z-stabler velge antall skiver som skal avbildes ( "Scan Kontroll" → "Z Innstillinger" → "Num Slices") og merk z-posisjonen for det første og det siste stykket i mikroskop programvare ( "Scan Kontroll "→" Z Innstillinger "→" Mark First "," Mark Siste ").
   Merk: Z-stabler med en dybde på opptil 75 mikrometer kan bli kjøpt med god kontrast mellom ekstracellulære og intracellulære områder.
5. Å følge pH-endringer i en mikroskopisk synsfelt over tid, merker xy-posisjon i mikroskop programvare ( "Trinn og fokuskontroll" → "Mark Pos") og ta gjentatte bilder på rad tidspunkter ( "Scan Control" → " Enkelt"). Jevnlig ta bilder med lasereffekt satt til null for bakgrunnen subtraksjon.

4. Digital Image Analysis

1. til export den mikroskopiske bilder som TIF-filer, bruker filen batch eksport av mikroskopet programvare ( "makro" → "Fil Batch Export"). Marker filene som skal eksporteres og lagre røde og grønne kanalen bildene i egne mapper som TIF-filer ( «Start Batch Export"). Gi nytt navn til filer i begge mapper gir dem sekvensielle tall.
2. Importer den røde og grønne bildeserie inn programvare som Daime (digital bildeanalyse i mikrobiell økologi) ^14. Segment den grønne kanalen bilder med selvvalgt lysstyrker (Segment → Automatisk segmentering → Custom terskel). Velg lysstyrke terskler med forsiktighet (vanligvis mellom 20 og 80), slik at alle bakterier (lysere enn den ekstracellulære matrise), men ikke matrisen vil bli anerkjent som objekter under segmentering. Kontroller visuelt at områdene anerkjent som objekter svarer godt til bakteriell biomasse.
3. Overfør den gjenstand laget av den segment gReen kanal bilder til de tilsvarende røde kanalen bilder (Segment → Transfer objekt lag). Bruk objektet redaktør funksjonen for å avvise og slette alle objekter i de røde og grønne kanalen bilder. Nå bare den ekstracellulære matriks er igjen i biofilm-bildene. Eksportere behandlet bildeserie som TIF-filer.
4. Importer bildeserier inn ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij, v.1.47). Bestem gjennomsnittlig fluorescens intensitet i bakgrunnsbildene er tatt med laseren slått av (Analyze → Histogram). Trekk riktig bakgrunn fra de røde og grønne bilder (Process → Math → Trekk).
5. Fortsatt i ImageJ, dele den grønne bildeserien (G1) av seg selv (Process → Bilde kalkulator). Deretter multiplisere den resulterende bildeserie (G2) med den grønne bildeserien (G1). Dette vil gi en bildeserie (G3), hvor NaN er tilordnet alle piksler som tilhører områder som ble anerkjent som objekter i Daime. Fortsett på than samme måte med den røde bildeserien (R1 / R1 = R2, R2 x R1 = R3).
   Merk: Når den bakterielle biomasse ble fjernet fra bildene som i trinn 4.3, den fluorescerende intensitet er 0 i disse områdene. Trinn 4.5 er nødvendig for å omdanne verdien 0 til NaN, som gjør det mulig for forholdet beregningen i trinn 4,6.
6. Påfør "Mean" filter (Prosess → Filter → Mean, radius: 1 pixel) for å kompensere for detektoren støy. Del den grønne bildeserien av den røde bildeserien (Process → Bilde kalkulator). Dette resulterer i en grønn / rød-forholdet for hver resterende piksel i det ekstracellulære rom av bildene. Bruk falsk farge for grafisk fremstilling av forholdene i bildene (Bilde → oppslagstabeller). Beregn gjennomsnittlig forhold mellom hvert bilde (Analyze → Histogram).
7. Konverter den grønne / røde forhold til pH-verdier i henhold til funksjonen montert under 1.9.2). Merk: Et eksempel på kalibreringsdata og montert kurve kan sees i et Schlaferal, 2015 ^11.

Representative Results

Den presenterte metoden tillater overvåking ekstracellulære pH synker i forskjellige microenvironments tann biofilm i pH-området fra 4,5 til 7 i sanntid. Dersom forsøksbetingelsene er valgt som beskrevet ovenfor, pH begynner å slippe i alle områder av biofilmer kort tid etter eksponering til glukose.

Når pH i en biofilm dråper, bakterieceller blir synlige i løpet av kort tid (<1 min), som den ratiometrisk fargestoff er upconcentrated i celler (figur 2A). I begynnelsen, før syreproduksjon i biofilm starter, ingen forskjell kan sees mellom bakgrunn og celler. Bilder eksportert inn i programvaren Daime må være segmentert med individuelt valgte terskler lysstyrke for å oppnå et godt samsvar mellom den bakterielle biomasse i bildene og gjenstandene som anerkjent av programmet (figur 2B). Hvis segmentert hensiktsmesbart, sletting av objekter i Daime fjerner alle fluorescerende signaler som stammer fra bakterieceller (Figur 2C). Etterfølgende bildebehandling i ImageJ resulterer i grønn / rød forholdstall for piksler i det ekstracellulære rom av bildene. Ved hjelp av kalibreringskurven, kan disse forholdene omdannes til pH-verdier og visualisert med falsk fargestoffer for grafisk representasjon (figur 2D). Gjennomsnittlig pH kan beregnes for hver av de behandlede bilder, og pH-utviklingen kan følges over tid (figur 2E). pH-dråper kan variere mellom ulike mikroskopiske synsfelt, og både horisontale og vertikale pH-gradienter kan overvåkes. Imidlertid, under statiske betingelser, i løpet av tynne biofilmer, bare mindre fall pH-gradienter kan observeres.

I noen tilfeller kan hele mikroskopisk synsfeltet være dekket med bakterieceller som gjør beregning av ekstracellulærpH umulig (figur 3A). Problemet kan løses ved å velge en litt annen fokus planet. Hensyn må tas for ikke å overeksponere de mikroskopiske bilder, fordi bakteriell biomasse i bildene så dekker et større område enn i virkeligheten (figur 3B). Når segmentere bildet i Daime er det avgjørende å velge lysstyrke terskler som gjenkjenner alle bakterieceller og, hvis tilstede, menneskelige epitelceller (figur 3C) som objekter. Ved oppdeling er utført med for høy lysstyrke terskler, blir intracellulære områder bli inkludert i beregningen av pH-verdien og føre til feilaktige resultater (figur 3D). Overvåking av ekstracellulær pH ​​med den ratiometrisk fargestoff er begrenset ved bruk av konfokal mikroskopi. Opp til en penetrasjon dybde på 75 mikrometer, kan ekstra og intracellulære områder skilles pålitelig (figur 3E). For å måle vertikale pH-gradienter i tykkere biofilm, mikroelektroder forblir oppfylthod av valget.

Figur 1:.. Akryl Splint for Intraoral Biofilm Collection Skinnen er designet med kinn akryl flenser forbundet med en språklig ortodontiske wire som gjør at frivillig til å bite i normal okklusjon Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2:. Bildebehandling for Mikroskopisk Måling av ekstracellulær Biofilm pH (A) Confocal mikroskopisk bilde av en biofilm farget med ratiometrisk fargestoff, 9 min etter eksponering til glukose. Den bakterielle biomasse i bildet kan skjelnes fra det ekstracellulære bakgrunn. (B) Det samme bildet etter segmentering i Daime. Hele bakterielle biomasse i mikroskopiske synsfeltet har blitt anerkjent som objekter i løpet av segmentering, som antydet med de oransje linjer. (C) Den samme bilde etter fjerning av bakterielle biomasse. All fluorescens som stammer fra bakteriecellene er blitt fjernet, og bare fluorescens som stammer fra den ekstracellulære matriks er igjen i bildet. (D) Grafisk fremstilling av ekstracellulære pH-verdi i det samme mikroskopisk synsfelt. Grønn / rød forholdstall er beregnet i ImageJ, og falsk farge ble brukt for grafisk representasjon av ekstracellulære pH. Gjennomsnittlig ekstracellulære pH = 5,86. (AD) Scale barer = 20 mikrometer. (E) Gjennomsnittlig pH-fall i den samme mikroskopisk synsfelt, overvåket i 15 min. PH-fall i dette området av biofilm er raskest i begynnelsen, kort tid etter eksponering for glukose. Da bremser det ned, men ikke når et platå i observasjonstid.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3:. Mikroskopisk Måling av ekstracellulær Biofilm pH - Potensielle problemer og feil (A) Confocal mikroskopisk bilde av en tett biofilm utsatt til glukose og farget med ratiometrisk fargestoff. I denne mikroskopiske synsfelt, blir hele bildet er dekket med bakterieceller, og fjerning av bakterier vil ikke forlate ekstracellulære områder for pH-beregningen. (B) Overeksponert confocal mikroskopisk bilde av en biofilm farget med ratiometrisk fargestoff. Under bildet segmentering av overeksponerte bilder større områder enn faktisk omfattes av bakterier er anerkjent som objekter og en del av det ekstracellulære rom er tapt for pH beregning. (C) Biofilm bilde med epitelceller (piler). Lysstyrke terskler for bildesegmentering må velges, slik at epitelceller er anerkjent som objekter og fjernet fra bildene før pH beregning. (D) Den samme biofilm bilde som i figur 1B, segmentert med en feil terskel lysstyrke. En del av bakteriell biomasse er ikke anerkjent som objekter og kan ikke fjernes fra bildet. Dette fører til innlemmelse av intracellulære områder i beregningen av pH-verdien og dermed feilaktige resultater. (E) Deep lag av en biofilm farget med ratiometrisk fargestoff. Bildet ble kjøpt 90 mikrometer fra biofilm-grunnen grensesnitt. Differensiering mellom ekstra og intracellulære områder er kompromittert. Skala barer = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Mikroskopisk overvåking av biofilm pH gir flere fordeler, sammenlignet med elektroden eller microelectrode målinger ^4-6. Mikroskopiske teknikker som tillater å bestemme pH-verdien med en høy romlig oppløsning og tillater å fange både horisontale og vertikale pH-gradienter i biofilmer uten å forstyrre biofilmen mekanisk. Tidligere forsøk av mikroskopiske pH-måling er imidlertid ikke klart å skille mellom ekstracellulær og intracellulær pH i biofilmer ^1,7,9. På grunn av bakteriell homeostase, intracellulær pH ​​avviker fra ekstracellulære pH, og pH-beregninger kan ikke være gyldig dersom begge intra- og ekstracellulære avdelinger bidrar til den registrerte fluorescensemisjon. Bruken av et andre fluorescerende fargestoff sammen med den pH-følsomme fargestoff for å visualisere bakterieceller er problematisk, ettersom til og med en liten overlapping mellom emisjonsspektra av fargestoffer som kan kompromittere kvantifisering av fluorescerende lys. Derfor teknikken som presenteres heravhengig av en konsentrasjonsgradient av proporsjonal fargestoff mellom ekstra og intracellulære av biofilm å identifisere og senere fjerne bakterieceller fra de oppkjøpte pH-bilder.

Ved farging med det fluorescerende fargestoff, bakterieceller i biofilmer internalisere og konsentrere opp-molekylet, men bare i sure betingelser. pH ratiometry med fargestoff er derfor begrenset til pH-området mellom 4,5 og 7,0. Ved pH-verdier over 7, gjør unprotonated og således ladet fargestoff ikke trenge inn i bakteriecellene godt nok til å skille dem fra det ekstracellulære bakgrunn, og ved pH-verdier under 4,5 mesteparten av fargestoffmolekylene er protonert og ingen ytterligere endringer i fluorescens-emisjon kan bli observert. Den utstyrt kurven (pH vs. Ratio grønn / rød) er brattest rundt pH 6 og flater ut mot pH 4,5. Et eksempel er vist i Schlafer et al., 2015, Figur S2. ¹¹ I dag er bruk av det fluorescerende fargestoff for pH ratiometry er begrenset tilovervåking ekstracellulære pH ^1. I prinsippet kan fargestoffet også brukes til å overvåke intracellulære bakterielle pH-endringer, men så langt har kalibrering ikke blitt utført for intracellulær bruk. I tillegg vil det være vanskelig å skille nøyaktig mellom intracellulær fluorescens-emisjon og fluorescerende lys som skriver seg fra fargestoffmolekyler festet til utsiden av den bakterielle celleveggen. Videre, ettersom farging med den ratiometrisk fargestoff brukes i kombinasjon med konfokalt mikroskop, bilde-innhentings i biofilm lag dypere enn 75 um fra dekkglasset / biofilm-grensesnittet er kompromittert. Reduserer kontrasten mellom bakterieceller og ekstracellulære matrise gjengir differensiering mellom intra- og ekstracellulære områder vanskelig. Ratiometrisk det anvendte fargestoff er blitt vist å på en pålitelig måte å visualisere 15 bakteriearter som er forbundet med tann biofilm, og det flekker bakterieceller i tann biofilmer dyrket in situ ^11. Selv om det er sannsynlig at denproporsjonal fargestoff er en universell bakteriell flekken, dette har ennå ikke blitt bevist, og flekken må testes på biofilm fra andre naturtyper enn munnhulen. Metoden tillater ikke å produsere tekniske replikater av en gitt pH-måling, som bilde oppkjøpet tar noen sekunder og biofilm pH endres dynamisk. Gjentatt avbildning av biofilm-fri bufferløsninger, imidlertid, og gjentatt avbildning av biofilm i buffer ga stabile pH-verdier (data ikke vist).

Alle trinn av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for bildebehandling må følges nøyaktig. Biofilm-bilder må anskaffes med tilstrekkelig lasereffekt / gevinst for å oppnå tilstrekkelig nivå av fluorescerende signal i den ekstracellulære matriks, men overeksponering av bakterieceller bør unngås. Hvis bakterieceller blir overeksponert (for høy laser makt eller gevinst) større områder enn faktisk omfattes av bakterier er anerkjent som objekter under bildesegmentering og en del av det ekstracellulære rom er taptfor pH-beregning (se figur 3B). På den annen side, hvis bildene er anskaffet med svært lav laser makt / gevinst, fluorescerende intensitet i det ekstracellulære rom kan ikke være tilstrekkelig for pålitelig beregning av grønn / rød utslippsforhold. Mange forskjellige indikator verktøy i mikroskop programvaren kan bli brukt til å justere mikroskop innstillingene, slik at bakterieceller er tatt med maksimal intensitet, men uten overeksponering. Automatisert bildesegmentering må kontrolleres for alle biofilm bilder for å sikre at alle bakterier og, hvis de finnes, er eukaryote celler anerkjent som objekter ved programvaren. Etter segmentering, bør alle biofilm bildene sammenlignes en etter en til de respektive unsegmented bildene for å fastslå samsvar mellom bakteriell biomasse og området anerkjent som objekter. Dersom større områder enn de som er omfattet av bakterier er anerkjent som objekter lysstyrke er for lavt for en nøyaktig differensiering og segmentering må utføres med en higher lysstyrke. Hvis deler av bakteriell biomasse er ikke blant gjenstandene, må lysstyrken senkes for å gi en riktig differensiering mellom ekstracellulære og intracellulære plass. For analyse av store datasett har det vist seg fordelaktig å segment alle bildene med en rad av forskjellige lysstyrker og deretter å bestemme den ideelle terskelen for hvert bilde. Når en korrekt skille mellom bakterier og ekstracellulær matriks oppnås ingen ytterligere problemer kan forventes i løpet av bildebehandling. Det kan imidlertid være noen bilder med en svært tett biofilm, hvor bakterier dekke hele mikroskopiske synsfelt. I disse bildene, selvsagt, ekstracellulære pH kan ikke bestemmes. I enkelte tilfeller kan problemet løses ved å skaffe bilder i en litt annen z-planet, hvor den bakterielle biomassen ikke dekker hele synsfeltet.

Ytterligere anvendelser av ekstracellulære pH ratiometry kan være å studerepH-landskap i andre mikrobielle samfunn enn dental biofilm (ie. Pseudomonas aeruginosa biofilm eller strømproduserende bakterie biofilm). Effekten av forskjellige økologiske parametere, slik som oksygeninnhold, karbohydrat tilførsel eller anvendelse av elektrisk strøm på biofilm pH-verdi kan bestemmes. Påvirkningen av biofilm alder, biofilm tykkelse og metabolsk aktivitet på pH kan bli undersøkt, så vel som effekten av pH-modulerende midler for bakterielle biofilmer. Sistnevnte er spesielt relevant i forbindelse med tann biofilm, hvor buffere representerer en lovende terapeutisk tilnærming til å kontrollere karies ^15. Videre bør fremtidig forskning fokusere på å anvende presenteres metoden under strømningsforhold. Til dags dato ekstracellulære pH ratiometry har bare blitt brukt til å overvåke pH-verdien under statiske betingelser. Konstant tilførsel av frisk oksygenrikt medium er sannsynlig å ha en betydelig innvirkning på utviklingen av pH microenvironments og iSpesielt vertikale pH-gradienter innenfor tynne biofilmer. Clearance av syrer ved mediestrømmen kan bidra til etablering av vertikale gradienter, selv i meget tynne biofilmer.

Proporsjonal confocal mikroskopisk bildebehandling med ratiometrisk fargestoff C-snarf-4 i kombinasjon med presis postprosessering av de oppkjøpte digitale bilder tillatelser til å beregne og visualisere biofilm pH i den ekstracellulære matrise, i sanntid, i pH-området mellom 4,5 og 7,0 og opp til en biofilm tykkelse på 75 um.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/