Summary
Um corante raciométrica sensível ao pH é utilizado em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital para monitorar o pH extracelular em biofilmes dentários em tempo real.
Abstract
O pH em biofilmes bacterianas nos dentes é de importância central para a cárie dentária, uma doença com alta prevalência em todo o mundo. Nutrientes e metabólitos não são distribuídas uniformemente em biofilmes dentais. Uma interacção complexa de sorção de reacção e com a matéria orgânica no biofilme reduz os caminhos de difusão de solutos e cria gradientes íngremes de moléculas reactivas, incluindo os ácidos orgânicos, entre os biofilme. métodos microscópicos fluorescentes quantitativos, tais como a imagiologia de tempo de vida de fluorescência ou ratiometry pH, pode ser utilizado para visualizar o pH em diferentes microambientes de biofilmes dentais. pH ratiometry explora um deslocamento dependente do pH na emissão de fluorescência de corantes sensíveis ao pH. O cálculo da razão de emissão em dois comprimentos de onda diferentes permite a determinação do pH local em imagens microscópicas, independentemente da concentração do corante. Contrariamente ao microeléctrodos a técnica permite monitorar ambos os gradientes de pH verticais e horizontais em tempo real commecanicamente perturbar o biofilme. No entanto, é preciso ter cuidado para diferenciar com precisão entre os compartimentos extra e intracelulares do biofilme. Aqui, o corante raciométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) é empregue para monitorizar o pH extracelular in vivo em biofilmes dentais cultivadas espécies de composição desconhecida. Após a exposição a glicose do corante é up-concentrada dentro de todas as células bacterianas nos biofilmes; É, assim, usado tanto como uma mancha universal de bactérias e como um marcador do pH extracelular. Após a aquisição da imagem microscópica confocal, a biomassa bacteriana é removida de todas as fotos usando o software de análise de imagem digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH com o corante proporcional está bem adequado para o estudo do pH extracelular em biofilmes finos de até 75 um de espessura, mas está limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0.
Introduction
O método descrito aqui permite a monitorização do pH extracelular em biofilmes dentais na gama entre 4,5 e 7, utilizando o corante raciométrica seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4), em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital. O corante fluorescente empregue é sensível ao pH e exibe uma mudança na sua emissão fluorescente, dependendo do estado de protonação. A emissão fluorescente dos picos de moléculas protonadas a 580 nm, e a emissão da molécula desprotonado em 640 nm 1. A razão entre as intensidades de emissão fluorescente em duas janelas de detecção que compreende os dois picos de emissão (576-608 nm e 629-661 nm) reflecte, portanto, o pH na fase líquida, independentemente da concentração de corante. Com um valor de pKa de 6,4 ~ o corante é adequado para visualização em ambientes de pH moderadamente ácidas.
PH no biofilme bacteriano é de importância central para todos os processos metabólicos.No caso de biofilmes dentais, o pH na matriz extracelular é o factor de virulência chave para o desenvolvimento de cárie dentária. Longos períodos com pH baixo na liderança interface de biofilme-tooth para retardar a desmineralização do esmalte subjacente 2. Devido à arquitectura tridimensional complexa de biofilmes, metabolitos, incluindo os ácidos orgânicos, não são uniformemente distribuídos através do biofilme. Altamente e menos microambientes acidogênicas pode ser encontrada em estreita proximidade espacial 3.
Durante décadas, os gradientes de pH verticais em biofilmes foram gravadas com a ajuda de microeletrodos 4-6. Enquanto eles oferecem uma boa resolução espacial devido ao seu tamanho pequeno ponta, eles não são adequados para monitorar gradientes horizontais. Além disso, a inserção do eléctrodo perturba o biofilme mecanicamente. técnicas microscópicas fluorescentes quantitativos oferecem a vantagem de visualizar mudanças de pH em diferentes áreas de um biofilme sem interferir mecânicance. Diferentes campos de vista microscópico pode ser escolhido livremente e fotografada várias vezes ao longo de períodos prolongados 1,7-9. No entanto, ao interpretar imagens microscópicas de biofilme, é importante fazer a distinção entre a fluorescência derivada da biomassa microbiana e a fluorescência resultante a partir do espaço extracelular. Em condições acídicas, o pH no interior das células bacterianas é diferente do pH na matriz extracelular, como as bactérias transportar activamente protões através sua membrana celular à custa de adenosina trifosfato 10. No contexto da cárie dentária, pH bacteriana intracelular não tem um impacto direto sobre o esmalte subjacentes enquanto baixo pH extracelular leva a desmineralização. Média de pH em imagens microscópicas que contêm ambas as áreas e bactérias livres de bactérias leva a resultados errados. A utilização de outras manchas, juntamente com o corante sensível ao pH, a fim de visualizar a biomassa bacteriana e diferenciar entre as áreas extra e intracelulares traz abo risco de contaminação de fluorescência do espaço extracelular e erros de medição 11.
Por conseguinte, o presente manuscrito descreve a utilização do corante raciométrica numa função dupla; tanto como um marcador de pH e como uma mancha universal de bactérias. Como o corante é-se concentrado em células bacterianas, a combinação de imagem microscópica confocal e um processo de análise de imagem digital preciso permite determinar o pH extracelular no intervalo entre 4,5 e 7,0 em biofilmes finos dentários.
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Protocol
O protocolo experimental foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Aarhus County (M-20100032).
1. confocal microscópica Calibração do Ratiometric Dye
- Para aquisição de imagem, use um microscópio invertido confocal equipado com uma incubadora, uma objectiva de imersão em água abertura 63X / 1.2-numérico, uma linha de laser 543 nm e um detector de META.
- Preparar tampão HEPES soluções de reserva (50 mM, ajustado a pH 4,5-8,5 em passos de 0,1 unidades de pH). Pipetar 100 l de cada solução nas cavidades de uma placa de 96 poços de fundo claro, por microscopia de fluorescência.
- Usar luvas de borracha nitrílica ao manusear o corante ratiometric C-SNARF-4. Prepara-se uma solução de estoque 1 mM do corante em sulfóxido de dimetilo. Adicionar 5 uL da solução stock a cada poço com tampão HEPES. Colocar a placa de 96 poços sobre o microscópio.
- Ligue o microscópio. Abra o software microscópio. Clique nos seguintes painéis: Adquirir → Laser; Adquirir → MICRO; Adquirir → Config; Adquirir → Digitalização; Adquirir → Stage. Aquece-se a incubadora a 37 ° C.
- Ligue a linha de laser 543 nm, clicando sobre o laser 543 nm e o botão "On" na janela "Controle Laser". Escolha a objetiva de imersão 63X / 1.2-numérico água abertura na janela "Controle Microscópio".
- Defina o detector META para monitorar simultaneamente a fluorescência dentro de 576- a 608 nm (verde) e 629- a 661 nm intervalos (vermelho) ( "Controle de Configuração" → "ChS"). Ajustar a potência do laser ( "Controle de Configuração" → "Excitação"). Defina o pinhole para produzir uma espessura de corte óptico de 1,6 mm ( "Control Scan" → "Pinhole").
- Adquirir uma imagem de cada solução tampão de HEPES, 5 mm acima do fundo de vidro da placa de 96 poços. Nota: Assim que o plano de focagem está situado por baixo do fundo de vidro, sem luz fluorescente pode ser vistona tela. Depois de cada terceira imagem, defina a potência do laser para zero e ter uma imagem para a subtração de fundo.
- Realizar o experimento de calibração em triplicado (1,2-1,7).
- Determinar a intensidade de fluorescência média e desvio padrão, em todas as imagens vermelhas e verdes.
- Calcula-se a relação R e erro padrão da média, S R, para cada imagem de acordo com as equações (1) e (2)
(1)
(2)
g, r, s g e s r são as médias e desvios-padrão nas respectivas imagens verde e vermelho. b g, b r, s bg e s l são os valores correspondentes para as imagens de fundo. n - Traçar as razões calculadas para cada valor de pH a partir de três experiências de calibração replicar num diagrama e construir uma curva ajustada a partir desta série de pontos de dados (ou seja, utilizando o software SigmaPlot 13). Fazer uma função matemática da curva ajustada, que pode converter proporções em valores de pH 10.
- Calcula-se a relação R e erro padrão da média, S R, para cada imagem de acordo com as equações (1) e (2)
2. Recolha de In Situ Grown amostras Dental biofilme
- Selecione voluntários que preenchem os critérios de inclusão e exclusão relevantes para o estudo. Faça impressões de alginato de sua arcada dentária superior e inferior. Faça modelos de gesso de estas impressões e fabricar um splint de acrílico no maxilar inferior. Projetar a tala com flanges de acrílico bucais ligados por um fio ortodôntico lingual que permite que o voluntário a morder oclusão normal 12.
- Recessões broca nos flanges vestibular do splint de acrílico (Figura 1
- Para a recolha de biofilme, utilizar placas feitos por medida não fluorescentes de vidro (4 x 4 x 1 mm3), com uma rugosidade da superfície de granalha de 1200, a fim de imitar o padrão de colonização em esmalte natural, 11.
- Esterilizar os pavimentos de vidro por autoclavagem antes da montagem. Montar as placas de vidro com cera pegajoso nas depressões nos flanges bucais de cada lado ligeiramente recuadas para a superfície da superfície de acrílico de modo a proteger o biofilme de forças de cisalhamento exercidas pelo movimento dos mordentes 11.
Nota: O número de placas de vidro colocadas numa recessão pode variar entre 3 e 14, dependendo do objectivo do estudo. - Insira o aparelho na boca do voluntário. Instrua o Volunteer para reter o dispositivo intra-oralmente durante todo o período experimental. Instruir o voluntário para guardar o aparelho em um recipiente retentor ortodôntico com um pedaço de lenço de papel molhado (para mantê-lo húmido) à temperatura ambiente durante a escovação dos dentes e da ingestão de alimentos e outros do que a água bebidas. Instrua o voluntário para não tocar nos flanges acrílico bucais com as placas de vidro enquanto colocar e retirar o aparelho.
Nota: O período experimental podem variar dependendo do objectivo do estudo (um dia a várias semanas). - Cuidadosamente remover as placas de vidro a partir do aparelho no final do período experimental. Remover a cera pegajoso em torno das placas, com uma faca e transferi-los com um par de pinças para um recipiente fechado, o biofilme voltada para cima, até que a análise microscópica. Mantenha o recipiente úmido com lenço de papel molhado. Realizar imagem pH dentro de poucas horas após a coleta do biofilme.
3. biofilme pH de imagem
- Prepararsalivar solução por adição de ditiotreitol à saliva recolhida de acordo com o método de De Jong et ai. 13. Titula-se a solução para pH 7,0 salivar e adicionar glucose a uma concentração de 0,4% (peso / vol). Pipetar 100 ul por biofilmes ser analisadas numa placa de 96 poços com fundo de vidro para microscopia. Adicionam-se 5 ul de corante raciométrica por poço.
- Colocar a placa de 96 poços na platina do microscópio. Ligue o microscópio e a linha de laser 543 nm. Aquece-se a incubadora a 37 ° C. Use as mesmas configurações microscópio como para a calibração do corante (veja as etapas 1,5-1,6). Esperar durante 30 min, até que a placa de 96 poços atingiu a temperatura de trabalho.
- Pegar uma ou mais placas de vidro com um conjunto magro de pinças e colocá-los nos poços cheios de saliva, uma laje por poço, com os biofilmes viradas para baixo.
- Adquirir imagens individuais ( "Control Scan" → "single") ou Z-stacks ( "Control Scan" → "Start") spanning a profundidade dos biofilmes em diferentes áreas. Para adquirir z-stacks escolher o número de fatias a ser trabalhada ( "Scan Control" → "Definições Z" → "Num fatias") e marque o z-position para a primeira e a última fatia no software microscópio ( "Controle de Digitalização "→" Configurações Z "→" Mark First ";" Mark Last ").
Nota: Z-pilhas com uma profundidade de até 75 fim pode ser adquirido com um bom contraste entre as áreas extracelulares e intracelulares. - Para acompanhar as mudanças de pH em um campo de vista microscópico ao longo do tempo, marcar o xy-posição no microscópio software ( "Stage e Controle Focus" → "Mark Pos") e tomar imagens repetidas em momentos consecutivos ( "Control Scan" → " Solteiro"). tomar regularmente imagens com a potência do laser fixada em zero por subtração de fundo.
4. Análise de Imagem Digital
- para export as imagens microscópicas como arquivos TIF, use o lote exportação do arquivo do software microscópio ( "Macro" → "Batch File Export"). Marque os arquivos a serem exportados e salvar imagens dos canais vermelho e verde em pastas separadas como TIF-arquivos ( "Start Batch Export"). Renomear os arquivos em ambas as pastas, dando-lhes números sequenciais.
- Importar a série de imagens vermelho e verde em um software como o daime (análise de imagem digital em ecologia microbiana) 14. Segmento as imagens dos canais verdes com limiares escolhidos individualmente brilho (segmento → segmentação → limiar automático personalizado). Escolha os limiares de brilho com cuidado (tipicamente entre 20 e 80), de modo a que todas as bactérias (mais brilhante do que a matriz extracelular), mas não a matriz será reconhecido como objectos durante segmentação. Verificar visualmente se as regiões reconhecidas como objectos correspondem bem ao biomassa bacteriana.
- Transferir a camada de objeto do g segmentadaimagens reen canal para o canal vermelho imagens correspondentes (segmento → camada objecto de transferência). Use a função de editor de objetos para rejeitar e excluir todos os objetos nas imagens dos canais vermelho e verde. Agora, apenas a matriz extracelular é deixado nas imagens de biofilme. Exportar a série de imagens processadas como arquivos TIF.
- Importar a série de imagem em ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij; v.1.47). Determinar a intensidade média de fluorescência nas imagens de fundo tomadas com o laser desligado (Analisar → Histograma). Subtrair o fundo adequado a partir das imagens vermelhas e verdes (Processo → Math → Subtrair).
- Ainda em ImageJ, divida a série de imagens verde (G1) por si só (Processo → calculadora de Imagem). Em seguida, multiplique a série imagem resultante (G2) com a série de imagens verde (G1). Isto irá produzir uma série de imagens (G3), onde NaN é atribuído a todos os pixels pertencentes a áreas que foram reconhecidos como objetos em daime. Proceda tele mesmo modo com a série de imagens vermelho (R1 / R1 = R2; R2 x R1 = R3).
Observação: Como a biomassa bacteriana foi removido a partir das imagens no passo 4.3, a intensidade fluorescente é 0 nestas áreas. Etapa 4.5 é necessário para converter o valor de 0 a NaN, o que permite o cálculo proporção no passo 4.6. - Aplique o filtro 'média' (Processo → Filtros → Média; raio: 1 pixel) para compensar o ruído detector. Divida a série de imagens verde pela série imagem vermelha (Processo → calculadora de Imagem). Isto resulta numa proporção verde / vermelho para todos os pixels restantes no espaço extracelular das imagens. Use falsa coloração para representação gráfica das proporções nas imagens (Tabelas Imagem → Lookup). Calcular a relação média para cada imagem (Analisar → Histograma).
- Converter os rácios de verde / vermelho para valores de pH de acordo com a função instalado sob 1.9.2). Nota: Um exemplo para dados de calibração e curva ajustada pode ser visto na Schlafer etal, 2015 11.
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Representative Results
O método apresentado permite a monitorização extracelular pH cai em diferentes microambientes de biofilmes dentais na gama de pH de 4,5 a 7, em tempo real. Se as condições experimentais são escolhidas como descrito acima, o pH começa a cair em todas as áreas dos biofilmes logo após a exposição à glicose.
Quando o pH em um biofilme gotas, as células bacterianas se tornam visíveis dentro de pouco tempo (<1 min), como o corante é raciométrica upconcentrated nas células (Figura 2A). No início, antes que a produção de ácido no biofilme começa, nenhuma diferença pode ser visto entre o fundo eo células. Imagens exportados para o daime software tem que ser segmentado, com limiares escolhidos individualmente de brilho, a fim de obter uma boa congruência entre a biomassa bacteriana nas imagens e os objectos reconhecidos pelo programa (Figura 2B). Se segmentado aprotamente, eliminação de objectos em Daime remove todos os sinais de fluorescência que derivam a partir de células bacterianas (Figura 2C). processamento de imagem subsequente no ImageJ resulta em índices de verde / vermelho para pixels no espaço extracelular das imagens. Com a ajuda da curva de calibração, estas relações podem ser convertidos para os valores de pH e visualizados com coloração por falsa representação gráfica (Figura 2D). A média do pH pode ser calculado para cada uma das imagens processados, e o desenvolvimento do pH pode ser seguido ao longo do tempo (Figura 2E). gotas de pH podem diferir entre diferentes campos de vista microscópico, e ambos os gradientes de pH horizontal e vertical pode ser monitorizada. No entanto, sob condições estáticas, dentro de biofilmes finos, apenas pequenos gradientes de pH verticais pode ser observada.
Em alguns casos, todo o campo de vista microscópico pode ser coberta com células bacterianas que torna o cálculo de extracelularpH impossível (Figura 3A). O problema pode ser resolvido através da escolha de um plano de foco um pouco diferente. Deve ser tomado cuidado para não sobreexpor as imagens microscópicas, porque a biomassa bacteriana nas imagens, em seguida, cobre uma área maior do que, na realidade, (Figura 3B). Quando a segmentação da imagem em Daime é crucial para escolher limiares de brilho que reconheçam todas as células bacterianas e, se, células epiteliais humanas presentes (Figura 3C) como objectos. Se segmentação é realizada com limiares muito alto brilho, áreas intracelulares serão incluídos no cálculo de pH e levar a resultados errados (Figura 3D). Monitorização do pH extracelular com o corante proporcional está limitada pela utilização de microscopia confocal. Até uma profundidade de penetração de 75 mm, as áreas extra e intracelulares podem ser distinguidos de forma fiável (Figura 3E). Para medir gradientes de pH verticais em biofilmes mais espessos, microeléctrodos permanece o conheceuhod de escolha.
Figura 1:.. Acrílico Tala para Intraoral biofilme Colecção A tala é projetada com flanges de acrílico bucais ligados por um fio ortodôntico lingual que permite que o voluntário a morder oclusão normal Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Processamento de Imagem para microscópica Medição da Extracelular biofilme pH (A) imagem microscópica confocal de um biofilme corado com o corante ratiometric, 9 min após a exposição à glicose. A biomassa bacteriana em que a imagem pode ser distinguida a partir do fundo extracelular. (B) A mesma imagem após a segmentação no daime. A biomassa bacteriana inteiro no campo de microscópico de vista tem sido reconhecida como objectos durante segmentação, como indicado pelas linhas de laranja. (C) A mesma imagem após a remoção da biomassa bacteriana. Todos fluorescência derivar a partir de células bacterianas foi removido, e apenas a fluorescência resultante a partir da matriz extracelular é deixada na imagem. (D) a representação gráfica de pH extracelular no mesmo campo de vista microscópico. rácios de verde / vermelho foram calculados em ImageJ, e falsa coloração foi aplicado para a representação gráfica de pH extracelular. pH extracelular Média = 5,86. (AD) Escala = 20 um barras. (E) queda média do pH no mesmo campo de vista microscópico, monitorizados durante 15 min. A descida brusca de pH nesta área do biofilme é mais rápido no começo, logo após a exposição à glicose. Em seguida, ele fica mais lento, mas não atingir um patamar dentro do período de observação.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Medição microscópica do Extracelular biofilme pH - possíveis problemas e erros (A) Confocal imagem microscópica de um biofilme densa expostos a glicose e corados com o corante ratiometric. Neste campo de vista microscópico, toda a imagem é coberta por células bacterianas, e a remoção das bactérias não vai deixar áreas extracelulares para o cálculo do pH. (B) Overexposed imagem microscópica confocal de um biofilme corado com o corante ratiometric. Durante a segmentação de imagens de imagens com exposição a áreas maiores do que efectivamente coberta por bactérias são reconhecidos como objectos e parte do espaço extracelular é perdido para o cálculo do pH. (C) BIOFimagem ILM com células epiteliais (setas). limiares de brilho para a segmentação da imagem tem de ser escolhida, de modo que as células epiteliais são reconhecidos como objectos e removidos a partir das imagens antes de cálculo de pH. (D) A mesma imagem biofilme como na Figura 1B, segmentado, com um nível de luminosidade errado. Parte da biomassa bacteriana não é reconhecido como objectos e não pode ser removido a partir da imagem. Isto leva a inclusão de domínios intracelulares no cálculo do pH e consequentemente resultados erróneos. (E) camada profunda de um biofilme corado com o corante ratiometric. A imagem foi obtida a partir de 90 um a interface biofilme-substrato. A diferenciação entre as áreas extra e intracelulares está comprometida. Barras de escala = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Monitorização microscópica de pH biofilme proporciona várias vantagens, como comparado com eléctrodos ou microeléctrodos 4-6 medições. técnicas microscópicas permitir determinar pH com uma alta resolução espacial e permitir a captura gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes sem perturbar o biofilme mecanicamente. As tentativas anteriores de monitoramento do pH microscópico, no entanto, não conseguiram diferenciar entre pH extracelular e intracelular no biofilme 1,7,9. Devido a homeostase bacteriana, pH intracelular difere do pH extracelular, e os cálculos de pH não pode ser válido se os dois compartimentos intra- e extracelulares contribuir para a emissão fluorescente gravada. O uso de um segundo corante fluorescente, juntamente com o corante sensível ao pH para visualizar as células bacterianas é problemática, uma vez que mesmo uma pequena sobreposição entre o espectro de emissão dos corantes pode comprometer a quantificação da luz fluorescente. Por conseguinte, a técnica aqui apresentadabaseia-se em um gradiente de concentração do corante raciométrica entre compartimentos extra e intracelulares do biofilme para identificar e depois remover as células bacterianas a partir das imagens adquiridas de pH.
Após a coloração com o corante fluorescente, as células bacterianas em biofilmes e internalizar-se-concentrar a molécula, mas apenas em condições ácidas. ratiometry pH com o corante é, portanto, limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0. A valores de pH acima de 7, o corante não protonada e, assim, carregada não penetram as células bacterianas bem o suficiente para os distinguir do fundo extracelular, e a valores de pH abaixo de 4,5 a maioria das moléculas de corante são protonados e não há mais alterações na emissão de fluorescência pode ser observado. A curva ajustada (pH vs. verde Rácio / vermelho) é mais íngreme em torno de pH 6 e nivela para fora para pH 4,5. Um exemplo é mostrado na Schlafer et al., 2015, Figura S2. 11 Actualmente, o uso do corante fluorescente para ratiometry pH é limitado amonitoramento de pH extracelular 1. Em princípio, o corante pode também ser utilizado para monitorizar variações de pH intracelulares bacterianas, mas, até agora, a calibragem não foi executada para utilização intracelular. Além disso, seria difícil distinguir com exactidão entre a emissão fluorescente intracelular e derivando luz fluorescente de moléculas de corante fixados no exterior da parede celular bacteriana. Além disso, como a coloração com o corante raciométrica é utilizado em combinação com a microscopia confocal, a aquisição de imagem em camadas de biofilme mais profundo do que 75 | iM a partir da interface da tampa de vidro / biofilme é comprometida. Diminuir o contraste entre as células bacterianas e da matriz extracelular torna a diferenciação entre intra e extracelulares áreas difícil. O corante raciométrica empregue foi mostrado para visualizar de forma fiável 15 espécies bacterianas associadas com biofilme, e que cora todas as células bacterianas nos biofilmes dentais cultivadas in situ 11. Embora seja provável que araciométrica corante é um corante universal de bactérias, isso ainda não foi provado e a mancha deve ser testado em biofilmes de outros habitats do que a cavidade oral. O método não permite produzir réplicas técnicas de um determinado medição de pH, como aquisição de imagem leva alguns segundos e biofilme pH muda dinamicamente. imagiologia repetido de soluções tampão livre de biofilme, no entanto, e de imagem repetida de biofilmes em tampão originou valores de pH estáveis (dados não apresentados).
Todos os passos do procedimento descrito acima para o processamento de imagens deve ser seguido exacta. imagens de biofilme deve ser adquirido com o laser suficiente poder / ganho para obter níveis adequados de sinal fluorescente na matriz extracelular, mas a exposição excessiva de células bacterianas devem ser evitados. Se as células bacterianas são sobrexposta (potência do laser de muito alta ou ganho) áreas maiores do que efectivamente coberta por bactérias são reconhecidos como objectos durante a segmentação da imagem e a parte do espaço extracelular é perdidapara o cálculo do pH (ver Figura 3B). Por outro lado, se as imagens são adquiridas com muito laser de baixa potência / ganho, intensidade de fluorescência no espaço extracelular pode não ser suficiente para o cálculo confiável de taxas de emissão verde / vermelho. Uma ferramenta Indicador Faixa no software do microscópio pode ser utilizado para ajustar as configurações de microscópio, de modo que as células bacterianas são capturados com intensidade máxima, mas sem exposição excessiva. segmentação de imagem automatizada deve ser controlada para todas as imagens de biofilme para assegurar que todas as infecções bacterianas e, se estiver presente, as células eucarióticas são reconhecidos como objectos pelo software. Após a segmentação, todas as imagens de biofilme deve ser comparadas uma por uma com as respectivas imagens não segmentados para verificar a congruência entre a biomassa bacteriana e a área reconhecida como objectos. Se áreas maiores do que as abrangidas por bactérias são reconhecidos como objetos do limiar de brilho é muito baixo para uma diferenciação precisa e segmentação deve ser realizado com um oilimiar de luminosidade gher. Se uma parte da biomassa bacteriana não está entre os objectos, o limiar de brilho deve ser reduzido para se obter uma diferenciação correcta entre o espaço extracelular e intracelular. Para a análise de grandes conjuntos de dados tem-se revelado vantajoso segmento de todas as imagens, com uma fileira de diferentes limiares de brilho e posteriormente para determinar o limiar ideal para cada imagem. Uma vez que uma distinção correcta entre as bactérias e a matriz extracelular é conseguido, não há mais problemas são de esperar durante o processamento de imagem. Pode, no entanto, haver algumas imagens com um biofilme muito densa, onde as bactérias cobrir todo o campo de vista microscópico. Nestas imagens, obviamente, o pH extracelular pode não ser determinada. Em alguns casos, o problema pode ser resolvido através da aquisição de imagens num plano z ligeiramente diferente, em que a biomassa bacteriana não cobre a totalidade do campo de visão.
Outras aplicações de ratiometry pH extracelular pode ser estudarpaisagens de pH em outras comunidades microbianas do que biofilmes dental (ie. biofilmes Pseudomonas aeruginosa ou biofilme bacteriano atuais produtoras). O efeito de diferentes parâmetros ambientais, tais como a concentração de oxigénio, o fornecimento de hidratos de carbono ou aplicação de corrente eléctrica no pH do biofilme pode ser determinada. A influência da idade do biofilme, a espessura do biofilme e a actividade metabólica sobre o pH pode ser investigada, bem como o efeito de agentes de pH modulador sobre o biofilme bacteriano. Este último é particularmente relevante no contexto de biofilmes dental, onde os agentes tamponantes representam uma abordagem terapêutica promissora para controlar cárie dentária 15. Além disso, pesquisas futuras devem se concentrar em aplicar o método apresentado em condições de escoamento. Até à data pH extracelular ratiometry só foi utilizado para monitorizar o pH, em condições estáticas. fornecimento constante de meio oxigenado fresco é susceptível de ter um impacto considerável no desenvolvimento de microambientes pH e, emparticulares, gradientes de pH verticais dentro biofilmes finas. A depuração de ácidos pelo fluxo médio pode contribuir para o estabelecimento de gradientes verticais mesmo em biofilmes muito finas.
imagem microscópica confocal raciométrica com o corante raciométrica C-SNARF-4 em combinação com pós-processamento preciso das imagens adquiridas autorizações digitais para calcular e visualizar pH biofilme na matriz extracelular, em tempo real, na gama de pH entre 4,5 e 7,0 e até uma espessura de 75 um biofilme.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Javier E. Garcia e Lene Grønkjær de assistência técnica e Merete K. Raarup para discussões frutíferas. Este trabalho foi financiado pelo Aarhus University Research Foundation eo Simon Spies Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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