Логометрический визуализации внеклеточного рН в зубных биопленок

Summary

РН-чувствительный ратиометрический краситель используется в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и анализа цифровых изображений для мониторинга внеклеточный рН в зубных биопленок в реальном времени.

Abstract

РН в бактериальных биопленок на зубах имеет центральное значение для кариеса, болезни с высоким во всем мире распространенности. Питательные вещества и метаболиты не распределены равномерно в зубных биопленок. Сложное взаимодействие сорбции и реакции с органическими веществами в биопленки снижает диффузионные пути растворенных веществ и создает крутые градиенты реактивных молекул, в том числе органических кислот, через биопленку. Количественные флуоресцентные микроскопические методы, такие как флуоресценция жизни времени изображений или рН ratiometry, могут быть использованы для визуализации рН в различных микросреды зубных биопленок. рН ratiometry использует рН-зависимого сдвига в флуоресцентного излучения рН-чувствительных красителей. Расчет коэффициента эмиссии на двух различных длинах волн позволяет определить локальные значения рН в микроскопических изображений, независимо от концентрации красителя. В отличие от микроэлектродов метод позволяет осуществлять мониторинг как вертикальные, так и горизонтальные градиенты рН в реальном времени смеханически нарушая биопленки. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы дифференцировать точно между вне- и внутриклеточным биопленки. Здесь Логометрический краситель, seminaphthorhodafluor-4F 5- (а-6) карбоновой кислоты (С-Snarf-4) используется для мониторинга внеклеточный рН в естественных условиях , выращенных в зубных биопленок неизвестного видового состава. При воздействии на глюкозу краситель вверх сосредоточено внутри всех бактериальных клеток в биопленки; она, таким образом, используется как в качестве универсального бактериального окрашивания и в качестве маркера внеклеточного рН. После того, как конфокальной микроскопического захвата изображений, бактериальная биомасса удаляется из всех изображений с помощью программного обеспечения цифрового анализа изображений, который позволяет исключительно рассчитать внеклеточного рН. рН ratiometry с логометрической красителя хорошо подходит для изучения внеклеточный рН в тонких биопленок толщиной до 75 мкм, но ограничена диапазоном рН от 4,5 до 7,0.

Introduction

Описанный здесь метод позволяет осуществлять мониторинг внеклеточный рН в зубных биопленок в диапазоне от 4,5 до 7, с использованием Логометрический краситель seminaphthorhodafluor-4F 5- (а-6) карбоновой кислоты (С-Snarf-4) в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и цифрового анализа изображений. Примененный флуоресцентный краситель рН-чувствительный и отображает сдвиг в его флуоресцентного излучения в зависимости от состояния протонирования. Флуоресцентное излучение протонированных пиков молекул при 580 нм, а излучение депротонированным молекулы при 640 нм ^1. Отношение флуоресцентных интенсивностей излучения в двух окнах обнаружения содержит два пика излучения (576 - 608 нм и 629 - 661 нм), таким образом, отражает значение рН в жидкой фазе, независимо от концентрации красителя. С рК _а ~ 6,4 краситель подходит для визуализации рН в умеренно кислой среде.

PH в бактериальных биопленок имеет центральное значение для всех метаболических процессов.В случае зубных биопленок, рН во внеклеточной матрице является ключевым фактором вирулентности для развития кариеса зубов. Длительные периоды с низким рН на границе раздела свинца биопленки зуба , чтобы замедлить деминерализации эмали подстилающей ^2. Из-за сложной трехмерной архитектурой биопленок, метаболитов, в том числе органические кислоты, не распределены равномерно по всему биопленки. Высоко и менее кислотопродуцирующий микросреды могут быть найдены в непосредственной пространственной близости ^3.

В течение многих десятилетий, вертикальные градиенты рН в биопленки были записаны с помощью микроэлектродов ^4-6. Несмотря на то, что они предлагают хорошее пространственное разрешение из-за их небольшого размера наконечника, они не очень хорошо подходят для контроля горизонтальных градиентов. Кроме того, введение электрода нарушает биопленку механически. Количественные флуоресцентные методы микроскопии обеспечивают преимущество визуализации изменений рН в различных областях биопленки без механического интерферироватьсть. Различные микроскопические поля зрения могут быть выбраны свободно и повторно отображены в течение длительных периодов ^1,7-9. Тем не менее, при интерпретации микроскопических биопленки изображений, важно проводить различие между флуоресценцией, вытекающей из микробной биомассы и флуоресценции, вытекающей из внеклеточного пространства. В кислой среде, рН внутри бактериальных клеток отличается от рН в внеклеточного матрикса, так как бактерии активно транспортируют протонов через их клеточную мембрану за счет аденозинтрифосфата ^10. В контексте кариеса, внутриклеточная бактериальная рН не оказывают непосредственное влияние на нижележащих эмали, тогда как низкий внеклеточного рН приводит к деминерализации. Усреднение рН в микроскопических изображений, которые содержат как бактерии участков, свободных и бактерий приводит к ошибочным результатам. Использование других пятен наряду с рН-чувствительного красителя для визуализации бактериальной биомассы и различия между вне- и внутриклеточных областей приносит абиз - за риска флуоресцентного загрязнения внеклеточного пространства и ложных измерений ^11.

Поэтому в настоящем рукопись описывает использование Логометрический красителя в двойной функции; как в качестве рН-маркера и в качестве универсального бактериального окрашивания. По мере того как краска повышающего концентрируется в бактериальных клетках, сочетание конфокальной микроскопических изображений и точная процедура анализа цифровых изображений позволяет определить внеклеточный рН в интервале между 4,5 и 7,0 в тонких зубных биопленок.

Protocol

Экспериментальный протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике Орхусе County (M-20100032) путем.

1. конфокальной Микроскопические Калибровка Логометрический Dye

1. Для получения изображения, используйте перевернутую конфокальной микроскопии, оснащенный инкубатор, 63X / 1.2-цифровой иммерсионный объектив апертуры воды, лазерной линии на 543 нм и META детектор.
2. Подготовка HEPES буфера растворы (50 мМ, рН доводили до 4.5-8.5 с шагом 0,1 единиц рН). Пипетировать 100 мкл каждого раствора в лунки убедительную дна 96-луночный планшет для флуоресцентной микроскопии.
3. Надеть нитриловые перчатки при работе с логометрические красителя C-Snarf-4. Приготовьте 1 мМ маточного раствора красителя в диметилсульфоксиде. Добавьте 5 мкл исходного раствора в каждую лунку с буфером HEPES. Поместите 96-луночного планшета на микроскопе.
4. Включите микроскоп. Откройте программное обеспечение микроскопа. Нажмите на следующие панели: Приобретать → Laser; Приобретать → MICRO; Приобретать → Config; Приобретать → Scan; Приобретать → Stage. Прогреть инкубатор до 37 ° C.
5. Включите лазерной линии 543 нм, нажав на 543 нм лазер, и кнопка "О" в окне "Laser Control". Выберите 63X / 1.2-числовой апертурой иммерсионный объектив воды в окне "Микроскоп Control".
6. Установите детектор META для одновременного мониторинга флуоресценции в пределах 576- до 608 нм (зеленый) и 629- до 661 нм (красный) промежутки времени ( "Управление конфигурацией" → "ChS"). Регулировка мощности лазера ( "Управление конфигурацией" → "возбуждение»). Установите крошечное отверстие, чтобы получить оптическую толщину среза 1,6 мкм ( "Контроль сканирования" → "Пинхол").
7. Приобретать изображение каждого буферного раствора Hepes, 5 мкм над стеклянным дном 96-луночного планшета. Примечание: Как только плоскость фокусировки находится под стеклянным дном, не флуоресцентный свет можно увидетьна экране. После каждого третьего изображения, установите мощность лазера до нуля и принимать изображение для вычитания фона.
8. Выполните калибровку эксперимента в трех экземплярах (1,2-1,7).
9. Определить среднюю интенсивность флуоресценции, и стандартное отклонение во всех красных и зеленых изображений.
   1. Вычислить отношение R и стандартная ошибка среднего значения, S _R, для каждого изображения в соответствии с уравнениями (1) и (2)
      (1)
      (2)
      г, г, з _г и s _г являются средними и стандартные отклонения в соответствующих зеленых и красных изображений. б _г, б _г, з _BG и s _ш являются соответствующие значения для фоновых изображений. п 2 число пикселей отображенных.
   2. Участок рассчитанные коэффициенты для каждого значения рН от трех калибровочных экспериментов повторности на диаграмме и построить кривую подогнанную из этой серии точек данных (т.е. с использованием программного обеспечения Sigmaplot 13). Составьте математическую функцию от подобранной кривой , которая может преобразовать отношения в значениях рН ^10.

2. Сбор В Ситу выращены Стоматологическая биопленки Образцы

1. Выберите добровольцев, которые удовлетворяют критериям включения и исключения, имеющих значение для исследования. Сделайте альгината впечатления от их верхней и нижней зубной дуги. Сделать модели, отлитые из этих впечатлений и производство акрилового щепу в нижней челюсти. Дизайн щепу с щечной акриловых фланцев , соединенных язычной ортодонтической проволоки , что позволяет доброволец вгрызаться в нормальном прикусе ^12.
2. Дрель спады в щечной полкам акриловой шины (Рисунок 1
3. Для сбора биопленки, использовать заказные нефлуоресцентной стеклянные плиты (4 х 4 х 1 мм ³⁾ с шероховатостью поверхности зернистости 1200 для того , чтобы имитировать рисунок на колонизацию естественной эмали ^11.
4. Стерилизовать стеклянные плиты автоклавированием перед монтажом. Установите стеклянные плиты с липким воском в углублениях в щечной фланцах каждой стороны немного утоплена на поверхности акриловой поверхности, чтобы защитить биопленки от сдвигающих сил , оказываемого движению щеками ^11.
   Примечание: Количество стеклянных пластин, помещенных в рецессию может варьироваться в пределах от 3 до 14 лет, в зависимости от цели исследования.
5. Вставьте прибор в устье волонтера. Проинструктировать ВолынскойТир сохранить прибор интраорально в течение всего периода эксперимента. Попросите добровольца хранить прибор в ортодонтической удерживающим контейнер с куском влажной бумажной салфеткой (чтобы держать его влажным) при комнатной температуре в течение чистки зубов и приема пищи и других напитков, кроме воды. Попросите добровольца, чтобы не задеть щечной акриловые фланцы со стеклянными плитами при размещении и удалении прибора.
   Примечание: Экспериментальный период может варьироваться в зависимости от цели исследования (один день до нескольких недель).
6. Осторожно снимите стеклянные плиты из прибора в конце экспериментального периода. Удалите липкий воск вокруг плиты с ножом и перечисляют их с пинцетом в закрытом контейнере, биопленки была обращена вверх, до микроскопического анализа. Держите контейнер влажный с влажной бумажной салфеткой. Выполните визуализацию рН в течение нескольких часов после сбора биопленки.

3. биопленки рН обработки изображений

1. Подготовитьслюнной раствор путем добавления дитиотреитола к собранной слюны в соответствии с методикой де Йонга и др. ^13. Титрование слюнных раствор до рН 7,0 и добавляют глюкозу в концентрации 0,4% (вес / объем). Пипетка 100 мкл на биопленки для анализа в стеклянным дном 96-луночный планшет для микроскопии. Добавьте 5 мкл Логометрический красителя на лунку.
2. Поместите 96-луночного планшета на предметный столик микроскопа. Включите микроскоп и лазерной линии 543 нм. Прогреть инкубатор до 37 ° C. Используйте те же настройки микроскопа как для калибровки красителя (см шаги 1,5-1,6). Подождите в течение 30 мин, до тех пор пока 96-луночный планшет не достигнет рабочей температуры.
3. Возьмите одну или несколько стеклянных пластин с тонким набором пинцетом и поместить их в слюне заполненных скважин, одну плиту на лунку, с которыми сталкивается биопленок вниз.
4. Приобретать отдельных изображений ( "Control Scan" → "Single") или Z-стеки ( "Control Scan" → "Пуск") spanniнг глубину биопленок в различных областях. Для того, чтобы получить Z-стеки выбрать количество срезов, которые будут отображены ( "Контроль сканирования" → "Настройки Z" → "Num Срезы") и отметьте Z-позиции для первого и последнего среза в программном обеспечении микроскопа ( "Scan Control "→" Параметры Z "→" Марк Первый ";" Марк Last ").
   Примечание: Z-стеки с глубиной до 75 мкм может быть получен с хорошим контрастом между внеклеточной и внутриклеточной областях.
5. Для того, чтобы следить за изменениями рН в микроскопическом поле зрения в течение долгого времени, отметьте ху-позиции в микроскоп программного обеспечения ( "Stage и фокус управления" → "Марк Pos") и взять повторные изображения в последовательные моменты времени ( "Контроль сканирования" → " Один"). Регулярно получать изображения с лазерной мощности равным нулю для вычитания фона.

4. Анализ цифрового изображения

1. ЭкспоцентраР.Т. микроскопические изображения в виде TIF файлов, используйте пакетный файл экспорта микроскопа программного обеспечения ( "Macro" → "Batch File Export"). Отметьте файлы, которые нужно экспортировать и сохранить красный и зеленый канал изображения в отдельных папках как TIF-файлов ( "Start Batch Экспорт"). Переименовать файлы в обеих папках, придавая им порядковые номера.
2. Импорт красный и зеленый серии изображений в программное обеспечение , такие как Daime (анализ цифровых изображений в микробной экологии) ^14. Сегмент зеленые изображения каналов с индивидуально выбранными пороговыми значениями яркости (сегмент → Автоматическая сегментация → Пользовательские порогового значения). Выберите пороговые значения яркости с осторожностью (обычно между 20 и 80), так что все бактерии (ярче, чем внеклеточного матрикса), но не матрица будет признан в качестве объектов во время сегментации. Проверьте визуально, что районы, признанные как объекты хорошо соответствуют бактериальной биомассы.
3. Перенести слой объекта сегментированной гReen изображения канала на соответствующие красного канала изображений (сегмент → Передача объекта слой). С помощью функции редактора объектов, чтобы отклонить и удалить все объекты красного и зеленого канала изображения. Теперь только внеклеточный матрикс остается в биопленки изображениях. Экспорт обработанного изображения в качестве серии TIF ​​файлов.
4. Импорт серии изображений в ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij~~HEAD=pobj; v.1.47). Определить среднюю интенсивность флуоресценции в фоновых изображениях, полученных с помощью лазера выключен (Анализировать → Гистограмма). Вычтите соответствующий фон из красных и зеленых изображений (процесс → Math → Subtract).
5. Тем не менее в ImageJ, делят зеленое изображение серии (G1) сама по себе (процесс → калькулятор изображения). Затем умножить ряд результирующего изображения (G2) с зеленой серии изображений (G1). Это приведет к серии изображений (G3), где NaN присваивается всем пикселям, принадлежащим к областям, которые были признаны в качестве объектов в Daime. Продолжайте в тон так же, как с красной серии изображений (R1 / R1 = R2; R2 х R1 = R3).
   Примечание: В качестве биомассы бактерий была удалена из изображений на шаге 4.3, интенсивность флуоресценции в этих областях 0. Шаг 4.5 необходимо преобразовать значение 0 в пользу NaN, что позволяет для расчета коэффициента на этапе 4.6.
6. Примените фильтр "означает '(процесс → Фильтры → Среднее; радиус: 1 пиксель) для компенсации шумов детектора. Разделить зеленый серия изображения по красной серии изображений (процесс → калькулятор изображения). Это приводит к тому зеленый / красный соотношение для каждого оставшегося пикселя во внеклеточном пространстве изображений. Используйте ложную окраску для графического представления отношений в изображениях (Image → таблицы поиска). Вычислить соотношение среднего для каждого изображения (Анализировать → Гистограмма).
7. Преобразование зеленый / красный отношения к значениям рН в соответствии с функцией, установленного под 1.9.2). Примечание: Пример для калибровки данных и подогнанной кривой можно увидеть в Schlafer и дрАль, 2015 ^11.

Representative Results

Представленный метод позволяет осуществлять мониторинг внеклеточный рН падает в различных микросреды зубных биопленок в диапазоне рН от 4,5 до 7 в режиме реального времени. Если условия эксперимента выбраны, как описано выше, рН начинает падать во всех областях биопленок вскоре после воздействия на глюкозу.

Когда рН в биопленки капли, бактериальные клетки становятся видимыми в течение короткого промежутка времени (<1 мин), а Логометрический краситель концентрированию в клетках (фиг.2А). В самом начале, до производства кислоты в биопленки начинается, никакой разницы не видно между фоном и клетками. Изображения , экспортируемые в программное обеспечение Daime должны быть сегментирован с индивидуально выбранными пороговыми значениями яркости для того , чтобы получить хорошее соответствие между бактериальной биомассы в изображениях и объектов распознан программой (Фигура 2В). Если сегментирован appropriленно, удаление объектов в Daime удаляет все флуоресцентные сигналы , которые проистекают из бактериальных клеток (рис 2С). Последующая обработка изображений в ImageJ приводит к зеленым / красным коэффициентов для пикселей во внеклеточном пространстве изображений. С помощью калибровочной кривой, эти отношения могут быть преобразованы в значения рН и визуализировали с помощью ложного красящая для графического представления (рис 2D). Средний рН можно рассчитать для каждой из обрабатываемых изображений, а также развитие рН может следовать в течение долгого времени (рис 2E). рН капли могут отличаться между различными микроскопическими полями зрения, а также горизонтальные и вертикальные градиенты рН можно контролировать. Тем не менее, в статических условиях, в тонких биопленок, можно наблюдать лишь незначительные вертикальные градиенты рН.

В некоторых случаях, вся микроскопическое поле зрения может быть покрыта бактериальными клетками, при наличии которой вычисление внеклеточногорН невозможно (Фиг.3А). Проблема может быть решена путем выбора несколько иной плоскости фокусировки. Необходимо соблюдать осторожность , чтобы не передержать микроскопические изображения, так как биомасса бактерий в изображениях затем покрывает большую площадь , чем в действительности (рис 3б). Когда сегментировать изображение в Daime важно выбрать пороги яркости , которые распознают все бактериальные клетки и, если они присутствуют, человеческие эпителиальные клетки (рис 3C) в качестве объектов. Если сегментация осуществляется слишком высокими порогами яркости, внутриклеточные области будут включены в расчет рН и привести к ошибочным результатам (рис 3D). Мониторинг внеклеточного рН с логометрической красителя ограничивается использованием конфокальной микроскопии. До глубины проникновения 75 мкм, внеклеточном и внутриклеточном области могут быть выделены достоверно (рис 3Е). Для измерения вертикальных градиентов рН в толще биопленки, микроэлектродов остаются встретилиськорыто выбора.

Рисунок 1:.. Акриловые Шинная для интраоральной биопленки Collection Шину разработан с щечной акриловых фланцев , соединенных язычной ортодонтической проволоки , что позволяет доброволец откусить нормальной окклюзии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть большую версию этой фигуры.

Рис . 2: Обработка изображений для микроскопического измерения внеклеточной биопленки рН (А) конфокальной микроскопическое изображение биопленки окрашивали с логометрической красителя, 9 мин после воздействия на глюкозу. Биомассы бактерий в изображении можно отличить от внеклеточной фона. (В) То же самое изображение после сегментации в Daime. Вся биомасса бактерий в микроскопическом поле зрения было признано в качестве объектов во время сегментации, как показано оранжевой линии. (С) То же самое изображение после удаления бактериальной биомассы. Все флуоресценция вытекающего из бактериальных клеток были удалены, и только флуоресценция вытекающего из внеклеточного матрикса оставлен в изображении. (D) Графическое представление внеклеточный рН в том же самом микроскопическом поле зрения. Зеленый / красный коэффициенты были рассчитаны в ImageJ, и ложная окраска была применена для графического представления внеклеточного рН. Средняя внеклеточного рН = 5,86. (AD) Шкала баров = 20 мкм. (E) Среднее снижение рН в той же микроскопического поля зрения, наблюдение в течение 15 мин. Падение рН в этой области биопленки быстрый в начале, вскоре после воздействия глюкозы. Затем он замедляется, но не достигает плато в течение времени наблюдения.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: Микроскопическое Измерение рН внеклеточной биопленки - Потенциальные проблемы и ошибки (А) конфокальной микроскопическое изображение плотной биопленки подвергается глюкозу и окрашивали с логометрической красителя. В этом микроскопическом поле зрения, все изображение покрыто бактериальными клетками, а также удаление бактерий не оставит внеклеточной области для расчета рН. (B) Передержанное конфокальной микроскопическое изображение биопленки окрашивали с логометрической красителя. Во время сегментации изображения из переэкспонированных изображений большие площади, чем на самом деле, покрытые бактериями, отражаются как объекты и часть внеклеточного пространства теряется для расчета рН. (C) BiofILM изображение с эпителиальными клетками (стрелки). Яркость пороговых значений для сегментации изображения, должны быть выбраны так, чтобы эпителиальные клетки распознаются как объекты и удалены из изображения до расчета рН. (D) Та же биопленки изображение, на фигуре 1В, сегментированный с порогом неправильной яркости. Часть бактериальной биомассы не признается в качестве объектов и не могут быть удалены из изображения. Это приводит к включению внутриклеточных областей в расчете рН и, следовательно, к ошибочным результатам. (Е) глубокий слой биопленки , окрашенном Логометрический красителя. Снимок был получен 90 мкм от границы раздела биопленки-субстрате. Разграничение между вне- и внутриклеточных областей находится под угрозой. Шкала баров = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Микроскопический контроль биопленки рН обеспечивает ряд преимуществ, по сравнению с электродными или микроэлектродов измерений ^4-6. Микроскопические методы позволяют определить рН с высоким пространственным разрешением и позволяет захватывать горизонтальные и вертикальные градиенты рН в биопленки, не нарушая биопленку механически. Предыдущие попытки микроскопического мониторирования рН, тем не менее, не удалось провести различие между внеклеточным и внутриклеточным рН в биопленки ^1,7,9. Из-за бактериального гомеостаза, внутриклеточный рН отличается от внеклеточного рН, и расчеты рН не могут быть действительными, если оба внутри- и внеклеточного отсеков способствуют регистрируемого флуоресцентного излучения. Использование второго флуоресцентного красителя вместе с рН-чувствительного красителя для визуализации бактериальных клеток является проблематичным, так как даже небольшое перекрытие между спектрами испускания красителей может поставить под угрозу количественно оценить флуоресцентного света. Поэтому методика, представленная здесьзависит от градиента концентрации Логометрический красителя между вне- и внутриклеточным биопленки для идентификации, а затем удалить бактериальные клетки из полученных изображений рН.

После окрашивания флуоресцентным красителем, бактериальные клетки в биопленки интернализации и повышающего сконцентрировать молекулы, но только в кислых условиях. рН ratiometry с красителем, таким образом, ограничивается диапазоне рН от 4,5 до 7,0. При значениях рН выше 7, непротонированной и, таким образом, заряженный краситель не проникает бактериальных клеток достаточно хорошо, чтобы отличить их от внеклеточного фоне, а при значениях рН ниже 4,5 большинство молекул красителя протонированы и никаких дальнейших изменений в флуоресцентного излучения не может быть наблюдаемый. Приталенный кривая (рН по сравнению с Ratio зеленый / красный) является крутая рН около 6 и уплощается в сторону рН 4,5. Пример показан в Schlafer и др., 2015, рис S2. ¹¹ В настоящее время применение флуоресцентного красителя для рН ratiometry ограничиваетсямониторинг внеклеточный рН ^1. В принципе, краситель также может быть использован для мониторинга внутриклеточные изменения бактериальных рН, но до сих пор, калибровка не была выполнена для внутриклеточного использования. Кроме того, было бы трудно отличить точно между внутриклеточным флуоресцентного излучения и флуоресцентного света, вытекающих из молекул красителя, прикрепленных к внешней стороне клеточной стенки бактерий. Кроме того, как окрашивание с логометрической красителя используется в сочетании с конфокальной микроскопии, получения изображений в биопленки слоях глубже, чем 75 мкм от поверхности раздела покровное стекло / биопленки под угрозу. Уменьшение контраста между бактериальными клетками и внеклеточной матрицы делает различие между внутри- и внеклеточной областей сложной. Примененный ратиометрический краситель было показано, надежно визуализировать 15 видов бактерий , связанных с зубной биопленки, и она окрашивает все бактериальные клетки в зубных биопленок , выращенных на месте ^11. Хотя вполне вероятно, чторатиометрический краситель представляет собой универсальный бактериальный пятно, это еще не было доказано, и пятно должно быть проверено на биопленки из других мест обитания, чем в ротовой полости. Метод не позволяет производить технические повторов данного измерения рН, а получение изображений занимает несколько секунд и биопленки рН изменяется динамически. Повторные обработки изображений биопленки свободных буферных растворов, однако, и повторного формирования изображения биопленки в буфере дали стабильные значения рН (данные не показаны).

Все этапы описанной выше процедуры для обработки изображений необходимо следовать точно. Биопленка изображения должны быть получены с достаточным лазерной мощности / коэффициента усиления для получения адекватных уровней флуоресцентного сигнала во внеклеточном матриксе, но передержка бактериальных клеток следует избегать. Если бактериальные клетки передержано (слишком высокая мощность лазера или усиление) большие площади, чем на самом деле, покрытые бактериями распознаются как объекты во время сегментации изображения и часть внеклеточного пространства теряетсядля расчета рН (рис 3B). С другой стороны, если изображения получены с очень низкой мощности лазера / усиления, интенсивность флуоресценции во внеклеточном пространстве, возможно, не будет достаточным для надежного расчета зеленых / красных коэффициентов выбросов. Инструмент диапазон Индикатор в программном обеспечении микроскоп можно использовать для настройки параметров микроскопа, так, что бактериальные клетки захватываются с максимальной интенсивностью, но без передержки. Сегментация изображения в автоматическом режиме должна контролироваться для всех биопленки изображений, чтобы гарантировать, что все бактериальные и, если они присутствуют, эукариотические клетки распознаются как объекты программного обеспечения. После сегментации, все биопленки изображения должны быть сопоставлены один за другим к соответствующим нечленистые изображений для установления соответствия между бактериальной биомассы и области, признанной в качестве объектов. Если большие площади, чем те, покрытые бактериями, признаются как объекты порог яркости является слишком низким для точной дифференциации и сегментации должна быть выполнена с приветGher порог яркости. Если часть бактериальной биомассы не относится к числу объектов, порог яркости должен быть снижен, чтобы получить правильную дифференциацию между внеклеточной и внутриклеточной пространства. Для анализа больших наборов данных это оказалось выгодным сегментом всех изображений с рядом различных порогов яркости и впоследствии определить идеальный порог для каждого изображения. После того, как правильное различие между бактериями и внеклеточным матриксом достигается, никаких дальнейших проблем не следует ожидать во время обработки изображения. Там может быть, однако, некоторые изображения с очень плотной биопленки, где бактерии покрывают всю микроскопическое поле зрения. В этих изображениях, очевидно, внеклеточный рН не может быть определена. В некоторых случаях эта проблема может быть решена путем получения изображений в несколько иной плоскости г, где бактериальная биомасса не покрывает все поле зрения.

Дальнейшие применения внеклеточного рН ratiometry может быть для изученияландшафты рН в других микробных сообществ , чем зубных биопленок (т.е.. синегнойной биопленок или токообразующих бактериальных биопленок). Влияние различных экологических параметров, таких как концентрация кислорода, поставка углевода или применения электрического тока на биопленки рН могут быть определены. Влияние биопленки возраста, толщины биопленки и метаболической активности от рН могут быть исследованы, а также влияние рН агентов, модулирующих на бактериальных биопленок. Последнее особенно актуально в контексте зубных биопленок, где буферные агенты представляют собой перспективный терапевтический подход к контролю кариеса ^15. Кроме того, будущие исследования должны сосредоточиться на применении предложенного метода в условиях потока. На сегодняшний день внеклеточного рН ratiometry использовался только для контроля рН в статических условиях. Постоянная подача свежего окисленной среды, вероятно, окажет значительное влияние на развитие микросреды рН и, вчастности, вертикальные градиенты рН в пределах тонких биопленок. Клиренс кислот потока среды может способствовать созданию вертикальных градиентов даже в очень тонких биопленок.

Логометрический конфокальной микроскопических изображений с Логометрический красителя C-Snarf-4 в сочетании с точной постобработки полученного цифрового разрешения изображений, чтобы вычислить и визуализировать биопленки рН во внеклеточной матрице, в реальном масштабе времени, в интервале рН от 4,5 до 7,0 и до биопленки толщиной 75 мкм.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/