Propportionell Imaging av extracellulära pH i Tand Biofilmer

Summary

Ett pH-känsligt ratiometrisk färgämne används i kombination med konfokala laserskanning mikroskopi och digital bildanalys för att övervaka extracellulära pH i tand biofilmer i realtid.

Abstract

PH i bakterie biofilmer på tänderna är av central betydelse för karies, en sjukdom med hög världsomspännande prevalens. Näringsämnen och metaboliter inte fördelas jämnt i tand biofilmer. Komplex samspel av sorption till och reaktion med organiskt material i biofilmen minskar diffusionsvägarna av lösta ämnen och skapar branta gradienter av reaktiva molekyler, innefattande organiska syror, över biofilmen. Kvantitativa fluorescerande mikroskopiska metoder, såsom fluorescens livstid avbildning eller pH ratiometry, kan användas för att visualisera pH i olika mikromiljöer av dentala biofilmer. pH ratiometry utnyttjar en pH-beroende förändring i den fluorescerande emissionen av pH-känsliga färgämnen. Beräkning av emissionsförhållandet vid två olika våglängder medger bestämning lokala pH i mikroskopiska bilder, oberoende av koncentrationen av färgämnet. I motsats till mikroelektroder tekniken tillåter övervakning både vertikala och horisontella pH-gradienter i realtid medut mekaniskt störa biofilmen. Emellertid måste försiktighet iakttas för att noggrant skilja mellan extra- och intracellulära fack i biofilmen. Här, den kvotmetriska färgämnet seminaphthorhodafluor-4F 5- (och-6) karboxylsyra (C-Snarf-4) används för att övervaka extracellulära pH i in vivo odlas tand biofilmer av okänd artsammansättning. Vid exponering för glukos färgämnet är upp-koncentreras i alla bakterieceller i biofilmer; den används sålunda både som en universell bakterie fläcken och som en markör för extracellulärt pH. Efter konfokala mikroskopisk bild förvärv, är den bakteriella biomassan bort från alla bilder med digital bildanalys programvara som tillåter att enbart beräkna extracellulära pH. pH ratiometry med ratiometrisk färgämnet är väl lämpad för att studera extracellulärt pH i tunna biofilmer på upp till 75 um tjocklek, men är begränsad till pH-intervallet mellan 4,5 och 7,0.

Introduction

Den här beskrivna metoden gör det möjligt att övervaka extracellulära pH i dental biofilmer i intervallet mellan 4,5 och 7, med användning av den kvotmetriska färgämnet seminaphthorhodafluor-4F 5- (och-6) karboxylsyra (C-snarf-4) i kombination med konfokal laserscanningsmikroskopi och digital bildanalys. Sysselsatta fluorescerande färgämne är pH-känslig och visar en förändring i sin fluorescensemission beroende på tillståndet hos protone. Den fluorescerande emission av protone molekyl toppar vid 580 nm, och emissionen av deprotonerade molekylen vid 640 nm ^en. Förhållandet mellan de fluorescerande emissionsintensitet i två detekteringsfönster som innefattar de två emissionstopparna (576-608 nm och 629-661 nm) återspeglar således pH i den flytande fasen, oberoende av färgkoncentrationen. Med _ett pKa av ~ 6,4 färgämnet är lämpligt att visualisera pH i måttligt sura miljöer.

PH i bakteriella biofilmer är av central betydelse för alla metaboliska processer.I fallet med tand biofilmer, är pH i den extracellulära matrisen nyckeln virulens faktor för utvecklingen av dental karies. Längre perioder med lågt pH vid biofilmen tand gränssnitt leder till långsam demineralisering av den underliggande emalj ^2. Grund av den komplexa tredimensionella arkitekturen i biofilmer, metaboliter, innefattande organiska syror, inte är enhetligt fördelade över biofilmen. Mycket och mindre syrabildande mikromiljöer kan hittas i nära fysisk närhet ^3.

I årtionden har vertikala pH-gradienter i biofilmer som spelats in med hjälp av mikroelektroder ^4-6. Medan de erbjuder en bra rumslig upplösning på grund av sin lilla spetsstorlek, är de inte väl lämpade för att övervaka horisontella gradienter. Dessutom införing av elektroden stör biofilmen mekaniskt. Kvantitativa fluorescerande mikroskopiska tekniker erbjuder fördelen med att visualisera pH-förändringar i olika områden av en biofilm utan mekanisk interfererance. Olika mikroskopiska synfält kan väljas fritt och avbildas flera gånger under längre perioder ^1,7-9. Men när man tolkar mikroskopiska biofilm bilder, är det viktigt att skilja mellan fluorescens som härrör från den mikrobiella biomassan och fluorescens som härrör från det extracellulära utrymmet. Under sura betingelser, är pH inuti bakterieceller skiljer sig från pH i den extracellulära matrisen, som bakterierna aktivt transportera protoner över deras cellmembran på bekostnad av adenosintrifosfat ^10. Inom ramen för karies, inte intracellulär bakterie pH inte har en direkt inverkan på de underliggande emalj, medan låg extracellulära pH leder till demineralisering. Genomsnitt pH i mikroskopiska bilder som innehåller både bakteriefria områden och bakterier leder till felaktiga resultat. Användning av andra fläckar tillsammans med pH-känsligt färgämne för att visualisera den bakteriella biomassan och skilja mellan extra- och intracellulära områden ger abut risken för fluorescerande kontaminering av det extracellulära utrymmet och falska mätningar ^11.

Föreliggande manuskript beskriver därför användning av den kvotmetriska färgämnet i en dubbel funktion; både som en pH-markör och som en universell bakterie fläck. Som färgämnet är upp-koncentreras i bakterieceller, en kombination av konfokala mikroskopisk avbildning och en korrekt digital förfarande bildanalys medger bestämning extracellulärt pH i området mellan 4,5 och 7,0 i tunna tand biofilmer.

Protocol

Experimentprotokollet granskades och godkändes av den etiska kommittén i Århus Amt (M-20.100.032).

1. Confocal Mikroskopisk Kalibrering av Propportionell Dye

1. För bildtagning, använda ett inverterat konfokalmikroskop utrustad med en inkubator, en 63x / 1.2-numerisk öppning nedsänkning i vatten mål, en 543 nm laserlinjen och en META detektor.
2. Förbered HEPES buffert stamlösningar (50 mM, justerat till pH 4,5 till 8,5 i steg om 0,1 pH-enheter). Pipettera 100 | il av varje lösning i brunnarna på en klar bottnad 96-brunnsplatta för fluorescensmikroskopi.
3. Bära nitrilhandskar vid hantering av ratiometrisk färgämnet C-Snarf-4. Bered en 1 mM stamlösning av färgämnet i dimetylsulfoxid. Tillsätt 5 | il av stamlösningen till varje brunn med HEPES-buffert. Placera 96-brunnar på mikroskopet.
4. Slå på mikroskopet. Öppna mikroskop programvara. Klicka på följande paneler: Skaffa → Laser; Förvärva → Micro; Förvärva → Config Förvärva → Scan; Förvärva → scenen. Värm upp inkubatorn till 37 ° C.
5. Slå på 543 nm laserlinjen genom att klicka på 543 nm laser och "On" i "Laser Control" fönstret. Välj 63x / 1.2-numerisk öppning nedsänkning i vatten mål i "Mikroskop Control" fönstret.
6. Ställ in META detektorn samtidigt övervaka fluorescens inom 576- till 608-nm (grön) och 629- till 661 nm (röd) med jämna mellanrum ( "konfigurationskontroll" → "ChS"). Justera lasereffekt ( "Configuration Control" → "Excitation"). Ställ hål för att ge en optisk skiva tjocklek på 1,6 pm ( "Scan Control" → "Pinhole").
7. Får en bild av varje HEPES-buffertlösning, 5 | j, m ovanför glas botten av 96-brunnsplatta. Obs: När fokusplanet ligger under glas botten, kan ingen fluorescerande ljus sespå skärmen. Efter var tredje bild, ställa in lasereffekt till noll och ta en bild för bakgrund subtraktion.
8. Utför kalibreringen experiment i tre exemplar (1,2-1,7).
9. Bestämma den genomsnittliga fluorescensintensiteten och standardavvikelsen i alla röda och gröna bilder.
   1. Beräkna förhållandet R och medelvärdets medelfel, S _R, för varje bild enligt ekvationerna (1) och (2)
      (1)
      (2)
      g, r, s _g och s _r är medeltal och standardavvikelser i de respektive gröna och röda bilder. b _g, b _r, s _bg och s _br är motsvarande värden för de bakgrundsbilder. n 2 är antalet pixlar avbildas.
   2. Plotta de beräknade förhållandena för varje pH-värde från de tre replikat kalibreringsexperiment i ett diagram och konstruera en monterad kurva från denna serie av datapunkter (dvs med hjälp av programmet Sigmaplot 13). Gör en matematisk funktion från den anpassade kurvan som kan konvertera förhållanden till pH-värden ^10.

2. Insamling av In Situ Grown Dental Biofilm Prover

1. Välj volontärer som uppfyller inklusionskriterier och uteslutningskriterier som är relevanta för studien. Gör alginat intryck av deras övre och undre tandbågen. Gör gjutna modeller från dessa intryck och tillverka en akryl skena i underkäken. Utforma skenan med buckala akryl flänsar förbundna med en lingual ortodontisk tråd som gör volontären att bita i normal ocklusion ^12.
2. Borr recessioner i kind flänsar akryl skenan (Figur 1
3. För biofilm samling använder skräddarsydda icke-fluorescerande glasplattor (4 x 4 x 1 mm ³⁾ med en ytjämnhet av korn 1200 i syfte att efterlikna kolonisering mönster på naturlig emalj ^11.
4. Sterilisera glasplattor genom autoklavering före montering. Montera plattor glas med klibbigt vax i fördjupning i de buckala flänsar vardera sidan något infällda till ytan av akrylytan i syfte att skydda biofilmen från skjuvkrafter som utövas genom förflyttning av kinderna ^11.
   Obs: antalet glasskivor placeras i en lågkonjunktur kan variera mellan 3 och 14, beroende på syftet med studien.
5. Sätt apparaten i munnen av volontären. Instruera volunTeer för att kvarhålla apparaten intra-oralt under hela försöksperioden. Instruera volontären att förvara apparaten i en ortodontisk hållare behållare med en bit av våt pappersnäsduk (för att hålla det fuktigt) vid rumstemperatur under tandborstning och intag av mat och andra än vatten drycker. Instruera volontär att inte röra buckala akryl flänsar med glasplattor medan placera och ta bort apparaten.
   Obs: Den experimentella period kan variera beroende på syftet med studien (en dag till flera veckor).
6. Försiktigt bort plattorna glas från apparaten vid slutet av försöksperioden. Avlägsna klister vax runt plattor med en kniv och överföra dem med en pincett till en sluten behållare, varvid biofilmen är vänd uppåt, tills mikroskopisk analys. Förvaras fuktigt med våta pappersnäsduk. Utför pH avbildning inom några timmar efter biofilm samling.

3. Biofilm pH Imaging

1. Förberedasalivlösning genom tillsats av ditiotreitol till uppsamlades saliv enligt metoden av de Jong et al. ^13. Titrera salivlösning till pH 7,0 och tillsätt glukos till en koncentration av 0,4% (vikt / volym). Pipettera 100 | il per biofilm som skall analyseras i en glasbottnad 96-brunnsplatta för mikroskopi. Tillsätt 5 pl av ratiometrisk färgämnet per brunn.
2. Placera 96-brunnar på mikroskop scenen. Slå på mikroskopet och 543 nm laserlinjen. Värm upp inkubatorn till 37 ° C. Använd samma mikroskop inställningar som används för kalibrering av färgen (se steg 1,5-1,6). Vänta i 30 minuter, till dess att 96-brunnar har nått arbetstemperatur.
3. Plocka upp en eller flera glasplattor med en smal uppsättning pincett och placera dem i saliven fyllda brunnar, en platta per brunn, med biofilmer vända nedåt.
4. Förvärva enstaka bilder ( "Scan Control" → "Single") eller Z-stackar ( "Scan Control" → "Start") spanning djupet av biofilmer på olika områden. Att förvärva z-stackar välja antal skivor som ska avbildas ( "Scan Control" → "Z Inställningar" → "Num skivor") och markera z-positionen för den första och den sista skivan i mikroskop programvara ( "Scan kontroll "→" Z Inställningar "→" Mark först "," Mark Senaste ").
   Obs: Z-stackar med ett djup på upp till 75 pm kan förvärvas med bra kontrast mellan extracellulära och intracellulära områden.
5. För att följa pH-förändringar i en mikroskopisk synfält över tiden, markerar xy-positionen i mikroskop programvara ( "scenen och Focus Control" → "Mark Pos") och ta upprepade bilder på varandra följande tidpunkter ( "Scan Control" → " Enda"). Regelbundet ta bilder med lasereffekt satt till noll för bakgrunds subtraktion.

4. Digital bildanalys

1. Export de mikroskopiska bilder som TIF-filer, använda filen parti export av mikroskop programvara ( "Macro" → "File Batch Export"). Markera de filer som ska exporteras och spara röda och gröna kanalen bilder i olika mappar som TIF-filer ( "Starta Batch Export"). Byt namn på filer i båda mapparna ger dem löpnummer.
2. Importera de röda och gröna bildserie i program som Daime (digital bildanalys i mikrobiell ekologi) ^14. Segment den gröna kanalen bilder individuellt valda tröskelvärden ljusstyrka (segment → Automatisk segmente → Custom tröskel). Välja de tröskelvärden ljusstyrka med omsorg (typiskt mellan 20 och 80), så att alla bakterier (ljusare än den extracellulära matrisen), men inte matrisen kommer att erkännas som objekt under segmentering. Kontrollera visuellt att de områden som erkänns som objekt svarar väl mot den bakteriella biomassan.
3. Överför objekt lagret av segmente gReen kanal bilder till motsvarande röda kanalbilder (segment → Transfer objekt Layer). Använd objektseditorn funktionen att avvisa och ta bort alla objekt i de röda och gröna kanal. Nu endast den extracellulära matrisen finns kvar i de biofilm bilder. Exportera bearbetade bildserie som TIF-filer.
4. Importera bildserie i ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij, v.1.47). Bestäm den genomsnittliga fluorescensintensiteten i bakgrundsbilder tagna med lasern avstängd (Analysera → Histogram). Subtrahera lämplig bakgrund från de röda och gröna bilder (Process → Math → Subtrahera).
5. Fortfarande i ImageJ, dela den gröna bildserie (G1) av sig själv (Process → Bildräknare). sedan multiplicera den resulterande bilden serien (G2) med den gröna bildserie (G1). Detta kommer att ge en bildserie (G3), där NaN tilldelas alla bildpunkter som hör till områden som redovisats som objekt i Daime. Fortsätt i than samma sätt med den röda bildserie (R1 / R1 = R2, R2 x R1 = R3).
   Notera: Såsom den bakteriella biomassan avlägsnades från bilderna i steg 4,3, är den fluorescerande intensiteten 0 inom dessa områden. Steg 4.5 är nödvändig för att omvandla värdet 0 till Nan, som gör det möjligt att beräkna förhållandet i steg 4,6.
6. Applicera "Mean" filter (Process → Filter → Mean; radie: 1 pixel) för att kompensera för detektorn buller. Dela den gröna bildserie av den röda bildserie (Process → Bildräknare). Detta resulterar i en grön / röd förhållande för varje återstående pixel i det extracellulära utrymmet av bilderna. Använd falsk färg för grafisk återgivning av förhållandena i bilderna (Bild → uppslagstabeller). Beräkna medelförhållandet för varje bild (Analysera → Histogram).
7. Konvertera de gröna / röda förhållanden till pH-värden enligt funktionen monterad under 1.9.2). Notera: Ett exempel på kalibreringsdata och anpassade kurvan kan ses i Schlafer etal, 2015 ^11.

Representative Results

Denna metod medger övervakning extracellulärt pH sjunker i olika mikromiljöer av dentala biofilmer i pH-området från 4,5 till 7 i realtid. Om de experimentella betingelserna är valda såsom beskrivits ovan, börjar pH att släppa i alla områden av de biofilmer strax efter exponering för glukos.

När pH i en biofilm droppar, bakterieceller blir synliga inom kort tid (<1 min), eftersom den kvotmetriska färgämnet upconcentrated i celler (Figur 2A). I början, innan syraproduktionen i de biofilm startar, ingen skillnad kan ses mellan bakgrund och celler. Bilder som exporteras till programvaran Daime måste segmenteras med individuellt valda tröskelvärden ljusstyrka för att få en god överensstämmelse mellan den bakteriella biomassan i bilderna och objekten som känns igen av programmet (Figur 2B). Om segmente lämpbart, deletion av objekt i Daime tar bort alla fluorescenssignaler som härrör från bakterieceller (Figur 2C). Efterföljande bildbehandling i ImageJ resulterar i grön / röd-förhållanden för bildpunkter i det extracellulära utrymmet av bilderna. Med hjälp av kalibreringskurvan, kan dessa förhållanden omvandlas till pH-värden och visualiseras med falsk färg för grafisk representation (figur 2D). Medel-pH kan beräknas för vart och ett av de bearbetade bilderna, och pH-utveckling kan följas över tiden (Figur 2E). pH-droppar kan skilja sig mellan olika mikroskopiska synfält, och både horisontella och vertikala pH-gradienter kan övervakas. Men under statiska förhållanden inom tunna biofilmer, kan observeras endast mindre vertikala pH-gradienter.

I vissa fall kan hela det mikroskopiska synfältet vara täckt med bakterieceller som gör beräkningen av extracellulärtpH omöjligt (figur 3A). Problemet kan lösas genom att välja en något annorlunda inriktning plan. Man måste vara försiktig att inte överexponera de mikroskopiska bilder, eftersom den bakteriella biomassan i bilderna täcker då ett större område än i verkligheten (figur 3B). När segmentera bilden i Daime är det viktigt att välja ljusstyrka trösklar som känner igen alla bakterieceller och, om närvarande, humana epitelceller (figur 3C) som objekt. Om segmente utförs med tröskelvärden för hög ljusstyrka, kommer intracellulära områden att ingå i pH beräkning och leder till felaktiga resultat (Figur 3D). Övervakning av extracellulärt pH med den kvotmetriska färgämnet är begränsad genom användningen av konfokalmikroskopi. Upp till ett penetrationsdjup av 75 um, kan extra- och intracellulära områden särskiljas på ett tillförlitligt sätt (figur 3E). För att mäta vertikala pH-gradienter i tjockare biofilmer, mikroelektroder förblir uppfylldahod val.

Figur 1:.. Akryl Splint för Intraoral Biofilm Collection Skenan är utformad med buckala akryl flänsar förbundna med en lingual ortodontisk tråd som gör volontären att bita i normal ocklusion Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Bildbehandling för mikroskopisk mätning av extracellulärt Biofilm pH (A) Confocal mikroskopisk bild av en biofilm färgades med ratiometrisk färgämne, 9 minuter efter exponering för glukos. Den bakteriella biomassan i bilden kan urskiljas från den extracellulära bakgrunden. (B) Samma bild efter segmentering i Daime. Hela bakteriell biomassa i det mikroskopiska synfältet har erkänts som föremål under segmentering, såsom indikeras av de orange linjer. (C) Samma bild efter avlägsnande av den bakteriella biomassan. All fluorescens som härrör från bakterieceller har tagits bort, och endast fluorescens som härrör från den extracellulära matrisen är kvar i bilden. (D) Grafisk representation av extracellulärt pH i samma mikroskopiska synfält. Grön / Röd förhållanden har beräknats i ImageJ, och falsk färg tillämpades för grafisk återgivning av extracellulärt pH. Genomsnittlig extracellulärt pH = 5,86. (AD) Skalstrecken = 20 | im. (E) Genomsnittlig pH-fallet i samma mikroskopiska synfält, övervakades under 15 min. PH droppe i detta område av biofilmen är snabbast i början, strax efter exponering för glukos. Då saktar ner men når inte en platå inom observationstiden.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53622/53622fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3:. Mikroskopisk Mätning av extracellulärt Biofilm pH - potentiella problem och misstag (A) Confocal mikroskopisk bild av en tät biofilm utsätts för glukos och färgades med ratiometrisk färgämnet. I denna mikroskopiska synfält, är hela bilden täckt med bakterieceller, och avlägsnande av bakterierna kommer inte att lämna extracellulära områden för pH beräkning. (B) Överexponering konfokala mikroskopisk bild av en biofilm färgades med ratiometrisk färgämnet. Under bildsegmentering av överexponerade bilder större områden än faktiskt omfattas av bakterier redovisas som objekt och en del av det extracellulära utrymmet försvinner för pH beräkning. (C) Biofilm bild med epiteliala celler (pilar). Ljusstyrketröskelvärdena för bildsegmentering skall väljas, så att epitelceller redovisas som objekt och avlägsnas från bilderna före pH beräkning. (D) Samma biofilm bild som i figur 1B, segmenterad med fel ljusstyrka tröskel. En del av den bakteriella biomassan erkänns inte som objekt och kan inte tas bort från bilden. Detta leder till integration av intracellulära områden i pH-beräkning och följaktligen felaktiga resultat. (E) Djup skikt av en biofilm färgades med den kvotmetriska färgämne. Bilden förvärvades 90 um från biofilmen-underlaget gränssnitt. Differentieringen mellan extra- och intracellulära områden äventyras. Skalstrecken = 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Mikroskopisk analys av biofilm pH ger flera fördelar, jämfört med elektrod eller mikroelektrodmätningar ^4-6. Mikroskopiska tekniker tillåter att bestämma pH med en hög rumslig upplösning och tillåta fånga både horisontella och vertikala pH-gradienter i biofilmer utan att störa biofilmen mekaniskt. Tidigare försök av mikroskopisk pH-övervakning, dock misslyckats med att skilja mellan extracellulära och intracellulära pH i biofilmer ^1,7,9. På grund av bakteriell homeostas skiljer intracellulär pH från extracellulärt pH, och pH-beräkningar kan inte vara giltigt om båda intra- och extracellulära fack bidrar till den inspelade fluorescerande emission. Användningen av ett andra fluorescerande färgämne tillsammans med den pH-känsligt färgämne för att visualisera bakterieceller är problematisk, eftersom även en liten överlappning mellan emissionsspektra för färgämnena kan äventyra kvantifiering av fluorescerande ljus. Därför den teknik som presenteras härförlitar sig på en koncentrationsgradient av den kvotmetriska färgämnet mellan extra- och intracellulära fack i biofilmen att identifiera och senare ta bort bakterieceller från de förvärvade pH bilderna.

Vid färgning med det fluorescerande färgämnet, bakterieceller i biofilmer internalisera och up-koncentrat molekylen, men endast i sura betingelser. pH ratiometry med färgämnet är därför begränsad till pH-intervallet mellan 4,5 och 7,0. Vid pH-värden över 7, inte oprotonerade och således laddat färgämne inte penetrera bakterieceller tillräckligt bra för att skilja dem från den extracellulära bakgrunden, och vid pH-värden under 4,5 flesta av färgämnesmolekylerna är proton och inga ytterligare ändringar i den fluorescerande emissionen kan vara observeras. Den anpassade kurvan (pH vs Ratio grön / röd) är brantast kring pH 6 och planar ut mot pH 4,5. Ett exempel visas i Schlafer et al., 2015, figur S2. ¹¹ För närvarande är användningen av det fluorescerande färgämnet för pH ratiometry är begränsad tillövervaka extracellulära pH ^1. I princip kan färgämnet också användas för att övervaka intracellulära bakteriella pH-förändringar, men hittills har ingen kalibrering utförts för intracellulär användning. Dessutom skulle det vara svårt att kunna skilja mellan olika intracellulära fluorescensemission och fluorescerande ljus som härrör från färgämnesmolekyler bundna till utsidan av den bakteriella cellväggen. Dessutom, som färgning med den kvotmetriska färgämne används i kombination med konfokalmikroskopi, bildinhämtning i biofilm skikt djupare än 75 ^ m från täckglas / biofilm gränssnittet äventyras. Minskad kontrast mellan bakterieceller och extracellulära matrisen gör differentieringen mellan intra- och extracellulära områden svårt. Sysselsatta ratiometrisk färgämnet har visat sig tillförlitligt visualisera 15 bakteriearter i samband med dental biofilm, och det fläckar bakterieceller i tand biofilmer odlas på plats ^11. Även om det är troligt attkvotmetrisk färgämne är en universell bakterie fläck, detta har ännu inte bevisats och fläcken måste testas på biofilmer från andra miljöer än munhålan. Metoden tillåter inte att producera tekniska replikat av ett givet pH-mätning, som bildtagning tar några sekunder och biofilm pH ändras dynamiskt. Upprepad avbildning av biofilm-fri buffertlösningar, dock, och upprepad avbildning av biofilmer i buffert gav stabila pH-värden (data ej visade).

Alla steg i den ovan beskrivna proceduren för bildbehandling vara noggrant följas. Biofilm bilder måste förvärvas med tillräcklig lasereffekt / förstärkning för att få tillräckliga nivåer av fluorescerande signal i den extracellulära matrisen, men överexponering av bakterieceller bör undvikas. Om bakterieceller överexponerad (för hög lasereffekt eller vinst) större områden än faktiskt omfattas av bakterier redovisas som objekt under bildsegmentering och en del av det extracellulära utrymmet försvinnerför pH-beräkning (se figur 3B). Å andra sidan, om bilder förvärvas med mycket låg lasereffekt / vinst, fluorescensintensitet i det extracellulära utrymmet räcker kanske inte för tillförlitlig beräkning av grön / röd utsläppskvoter. En Range indikator verktyg i mikroskop mjukvaran kan användas för att justera inställningarna mikroskop, så att bakterieceller fångas med maximal intensitet, men utan överexponering. Automatiserad bildsegmentering måste kontrolleras för alla biofilm bilder för att säkerställa att alla bakterier och, om närvarande, är eukaryota celler redovisas som objekt med hjälp av mjukvara. Efter segmentering, bör alla biofilmen bilder jämföras ett i taget till respektive unsegmented bilderna för att säkerställa kongruens mellan den bakteriella biomassan och området erkänns som objekt. Om större områden än de som omfattas av bakterier redovisas som objekt tröskeln ljusstyrka är för låg för en korrekt differentiering och segmentering måste utföras med en hiGher ljusstyrka tröskel. Om en del av den bakteriella biomassan är inte bland de objekt måste tröskeln ljusstyrka sänkas för att ge en korrekt differentiering mellan extracellulära och intracellulära utrymmet. För analys av stora datamängder har det visat sig fördelaktigt att segmentera alla bilder med en rad olika tröskelvärden ljusstyrka och att därefter bestämma den ideala tröskel för varje bild. En gång uppnås en korrekt åtskillnad mellan bakterier och extracellulär matris, inga ytterligare problem är att vänta under bildbehandling. Det kan dock finnas vissa bilder med en mycket tät biofilm, där bakterier täcker hela mikroskopiska synfältet. I dessa bilder, uppenbarligen, extracellulära pH-värdet kan inte bestämmas. I vissa fall kan problemet lösas genom att förvärva bilder i en något annorlunda z-planet, där den bakteriella biomassan inte täcker hela synfältet.

Ytterligare tillämpningar av extracellulära pH ratiometry kan vara att studerapH landskap i andra mikrobiella samhällen än tand biofilmer (dvs.. Pseudomonas aeruginosa biofilmer eller strömproducerande bakteriella biofilmer). Effekten av olika ekologiska parametrar, såsom syrekoncentration, kolhydrattillförsel eller applicering av elektrisk ström på biofilm pH kan bestämmas. Inverkan av biofilm ålder, biofilm tjocklek och metabolisk aktivitet på pH kan undersökas, liksom effekten av pH-modulerande medel på bakterie biofilmer. Det senare är särskilt relevant i samband med tand biofilmer, där buffertmedel utgör en lovande terapeutisk metod för att styra karies ^15. Dessutom bör den framtida forskningen inriktas på att tillämpa den presenterade metoden enligt flödesförhållanden. Hittills extracellulärt pH ratiometry har endast använts för att övervaka pH under statiska förhållanden. Konstant tillförsel av färsk syre medium är sannolikt att ha en betydande inverkan på utvecklingen av pH-mikromiljöer och isynnerhet vertikala pH-gradienter inom tunna biofilmer. Clearance av syror av medieflödet kan bidra till upprättandet av vertikala gradienter även i mycket tunna biofilmer.

Ratiometrisk konfokala mikroskopisk avbildning med den kvotmetriska färgämnet C-snarf-4 i kombination med exakt efterbearbetning av de förvärvade digitala bilder tillstånd för att beräkna och visualisera biofilm pH i den extracellulära matrisen, i realtid, i pH-området mellan 4,5 och 7,0 och upp till en biofilm tjocklek av 75 | im.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4 x 4 x 1 mm3; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/