Summary
وتستخدم على نطاق واسع النهج علم البصريات الوراثي للتلاعب النشاط العصبي وتقييم النتائج المترتبة على وظيفة الدماغ. هنا، ويرد الاسلوب الذي عليها في الجسم الحي التعبير عن منشط البصرية Channelrhodopsin، ويسمح لخارج الجسم الحي تحليل خصائص متشابك بعيدة المدى محددة والوصلات العصبية المحلية في الدوائر ذات الصلة الخوف.
Abstract
وتستخدم نهج علم البصريات الوراثي الآن على نطاق واسع لدراسة وظيفة من السكان العصبي ودوائر عن طريق الجمع بين التعبير التي تستهدف تنشيط البروتينات الخفيفة والتلاعب لاحق من النشاط العصبي من الضوء. Channelrhodopsins (س.) هي قنوات الموجبة بوابات الخفيفة وعندما تنصهر لبروتين فلوري التعبير عنها يسمح لتصور وتفعيل المتزامن لأنواع معينة من الخلايا والتوقعات محور عصبي في مناطق محددة من الدماغ. عن طريق الحقن المجسم من النواقل الفيروسية، والبروتينات الانصهار مركز حقوق الانسان يمكن التعبير عنها بشكل جوهري أو مشروط في خلايا معينة من منطقة في الدماغ تعرف، ويمكن بعد ذلك التوقعات محواري على دراستها تشريحيا ووظيفيا عبر فيفو السابقين تفعيل علم البصريات الوراثي في شرائح الدماغ. هذا الأمر أهمية خاصة عندما تهدف إلى فهم خصائص متشابك من الاتصالات التي لا يمكن تناولها مع النهج التحفيز الكهربائي التقليدية، أو في تحديد affe روايةالإيجار والربط صادر الذي كان متصورا سيئة. هنا، بعض الأمثلة لتوضيح كيفية هذه التقنية يمكن تطبيقها على التحقيق في هذه الأسئلة لتوضيح الدوائر ذات الصلة خوف في اللوزة. اللوزة هي منطقة رئيسية لاكتساب والتعبير عن الخوف، وتخزين الخوف والذكريات العاطفية. العديد من خطوط الأدلة تشير إلى أن قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) تشارك في جوانب مختلفة من اكتساب الخوف والانقراض، ولكن الربط الدقيق مع اللوزة هو مجرد بداية ليكون مفهوما. أولا، فإنه يظهر كيف فيفو السابقين تفعيل علم البصريات الوراثي يمكن استخدامها لدراسة جوانب الاتصالات متشابك بين afferents mPFC والخلايا المستهدفة في اللوزة basolateral (جيش تحرير بلوشستان). وعلاوة على ذلك، ويتضح ذلك كيف يمكن لهذا النهج علم البصريات الوراثي المجراة سابقا يمكن تطبيقها لتقييم أنماط الاتصال رواية باستخدام مجموعة من الخلايا العصبية GABAergic في اللوزة، وparacapsular مجموعة مقحم الخلية (mpITC)، على سبيل المثال.
Introduction
أدوات دقيقة لتصور وتفعيل المتزامن لاتصالات محددة بين مناطق الدماغ وأنواع معينة من الخلايا العصبية أصبحت أكثر أهمية في فهم الكامنة صحية وظيفة الدماغ ومرض دول الربط الوظيفي. من الناحية المثالية، وهذا يستلزم التحقيق الفسيولوجية من خصائص متشابك دقيقة مع الذي حدد الخلايا العصبية التواصل. هذا صحيح بصفة خاصة للاتصالات بين مناطق الدماغ التي لا يمكن الحفاظ عليها في شريحة الدماغ الحادة واحدة هذا. في الماضي، وقد تحقق هذا إلى حد كبير في تجارب منفصلة. من ناحية، ضخت استشفاف العصبية في الجسم الحي واستخدمت جنبا إلى جنب مع ضوء لاحقة أو الإلكترون المجهري تحليل الشركاء قبل وبعد المشبكي. من ناحية أخرى، عندما يتم الحفاظ على مساحات الألياف من منطقة المنشأ ويمكن الوصول إليها في إعداد شريحة، وقد استخدم التحفيز الكهربائي لتقييم آليات الاتصال متشابك مع الخلايا في المنطقة المستهدفة.
مع ظهور علم البصريات الوراثي، والتعبير المستهدفة من قنوات الموجبة للضوء بوابات، مثل Channelrhodopsins (س.) لتنصهر البروتينات الفلورية، يمكن الآن تنشيط الخلايا العصبية ومساراتها محور عصبي بينما يسمح لتصور وبعد تحليل خاص التشريحية 1- 4. لأن المحاور مركز حقوق الانسان، معربا عن أن يكون حافزا حتى عندما قطعت من somata الأم 5، فمن الممكن في شرائح الدماغ إلى: 1) تقييم المدخلات من مناطق الدماغ التي لم تكن في متناول مع التحفيز الكهربائي التقليدية، لأن مساحات الألياف لا يمكن فصلها أو مسار معين ليس معروفا؛ 2) تحديد بشكل لا لبس فيه المنطقة من أصل لالمدخلات المحددة التي تم المفترضة ولكن غير مفهومة تماما. و3) تحقيق الربط الوظيفي بين أنواع الخلايا المحددة، على حد سواء محليا والتوقعات بعيدة المدى. بسبب وجود عدد من المزايا، أصبح هذا التعيين علم البصريات الوراثي للدوائر في شرائح الدماغ واسعةلاي المستخدمة في السنوات الأخيرة، ومجموعة متنوعة من النواقل الفيروسية للتعبير عن س. fluorescently الموسومة متوفرة بسهولة من الموردين التجارية. بعض المزايا الرئيسية لتفعيل علم البصريات الوراثي على التحفيز الكهربائي التقليدية هي عدم وجود ضرر في الأنسجة نتيجة لوضع أقطاب كهربائية التحفيز، خصوصية تحفيز ألياف بسبب التحفيز الكهربائي ويمكن أيضا توظيف الألياف المرور أو خلايا أخرى مجاورة، والتحفيز السريع على قدم المساواة ودقيق زمنيا. وبالإضافة إلى ذلك، حقن المجسم من ناقلات فيروسية يمكن بسهولة أن تستهدف مناطق محددة في الدماغ 6 و المشروط أو خلية من نوع التعبير محددة يمكن تحقيق ذلك باستخدام التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد و / أو المروجين محدد 7. هنا، يتم تطبيق هذه التقنية لرسم خرائط طويلة المدى ودوائر المحلية في نظام الخوف.
اللوزة هي منطقة رئيسية لاكتساب والتعبير عن الخوف، وتخزين الخوف والذكريات العاطفية 8،9. وبصرف النظر جيئة وذهابام اللوزة، وقشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) وقرن آمون (HC)، والهياكل التي ترتبط تبادليا اللوزة، وتورط في جوانب الاستحواذ، وتوطيد واسترجاع الخوف والانقراض ذكريات 10،11. يبدو النشاط في التقسيمات الفرعية للmPFC أن تلعب دورا مزدوجا في السيطرة على الخوف على حد سواء ارتفاع وانخفاض تنص 12،13. يمكن أن يكون في اطار بوساطة ذلك عن طريق الاتصالات المباشرة من mPFC إلى اللوزة المخية التي من شأنها أن تتحكم في نشاط اللوزة والإخراج. لذلك، في السنوات الأخيرة، بدأت عدة دراسات في السابق تجارب شريحة الجسم الحي للتحقيق في التفاعلات متشابك بين afferents mPFC والخلايا المستهدفة المحددة في اللوزة 14-17.
خلال التعلم الخوف والمعلومات الحسية عن المحفزات مكيفة وغير مشروطة تصل اللوزة عبر التوقعات من المناطق المهادية والقشرية محددة. اللدونة من هذه المدخلات إلى الخلايا العصبية في الجزء الجانبي (LA) من basolاللوزة ateral (جيش تحرير بلوشستان) هي آلية هامة الكامنة تكييف الخوف 9،18. وتشير أدلة متزايدة على أن عمليات البلاستيك موازية في اللوزة تنطوي على عوامل المثبطة للسيطرة على ذاكرة الخوف 19. مجموعة من الخلايا العصبية المثبطة مقسمة إلى كتل هي GABAergic سطي paracapsular مقحم الخلايا (mpITCs)، ولكن التواصل فيما بينها الدقيق وظيفة غير مفهومة تماما 20-22. هنا، يتم استخدام خرائط الدوائر علم البصريات الوراثي لتقييم وارد وصادر التواصل بين هذه الخلايا وتأثيرها على الخلايا العصبية المستهدفة في اللوزة المخية، مما يدل على أن mpITCs تلقي المدخلات الحسية المباشرة من محطات التقوية المهادية والقشرية 23. تعبيرا محددا من مركز حقوق الانسان في mpITCs أو الخلايا العصبية جيش تحرير بلوشستان يسمح رسم الخرائط من التفاعلات المحلية، وكشف عن أن mpITCs تمنع، ولكن أيضا تنشيط للطرفين من خلال الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان، وتجعلهم في الدوائر المثبطة رواية التغذية إلى الأمام وردود الفعل التي تتحكم في فعالية النشاط جيش تحرير بلوشستان23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: وكانت جميع الإجراءات التجريبية وفقا لتوجيهات الاتحاد الأوروبي على استخدام الحيوانات في البحوث وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المحلية واللجنة الاستخدام (Regierungspräsidium توبنغن، ولاية بادن فورتمبيرغ، ألمانيا) مسؤولة عن جامعة توبنغن.
1. إجراء حقن المجسم
- إعداد أدوات معقمة (مقص، مشرط، والمشابك، وحفر، والإبر، مواد خياطة الجروح) باستخدام معقم. ترتيب أدوات معقمة والحلول الأخرى المطلوبة وإمدادات الجراحة مثل مقايضات معقمة من القطن، مطهر، معقم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4)، و H 2 O 2 على ثنى الجراحية المعقمة.
- سحب بال micropipettes الزجاج لحقن (الشكل 1A، أقحم) باستخدام 3 مم واسعة مربع خيوط على مسرى مكروي الأفقي مجتذب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: للحصول على حقن عميقة، يجب أن يكون تفتق القطب بما فيه الكفايةمنذ فترة طويلة للوصول إلى معظم الإحداثيات البطنية (حوالي 5 ملم؛ لالإحداثيات، انظر 1.10). - بريمكس 1 ميكرولتر من حل الفيروس و 0.2 ميكرولتر من حل سريع الأخضر 0.1٪ في برنامج تلفزيوني العقيمة (لرؤية أفضل من الحل في ماصة الزجاج). ملء الماصات الزجاج مع مزيج من حل الفيروس والأخضر سريع باستخدام ماصة ميكروليتر مع طرف على ما يرام (الشكل 1A، أقحم).
يعتبر العمل مع المؤتلف المرتبطة الغدة النواقل الفيروسية (rAAV) مستوى السلامة الحيوية 1 (BSL 1) العمل ويحتاج إلى أن يقوم في بي إس إل 1 المختبر: ملاحظة. كانت rAAVs المستخدمة في هذه الدراسة (الشكل 1C): 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (المصلي 2/9) 16؛ 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (المصلي 2/9) 23؛ 3) mpITC / جيش تحرير بلوشستان: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (المصلي 2/1) 23 - تخدير الماوس باستخدام آلة التخدير الحيوانات الصغيرة (الأيزوفلورين: 3٪ في الأكسجين لتحريض).
ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذه الدراسة كانت 4 -7 أسابيع من العمر والسلالات والطرز التالية: C57Bl6 / J النوع البري (تجربة في أرقام 2A و 3A-D)؛ GAD67-GFP 24 (التجربة في أرقام 2B و3E-H)؛ Tac2-لجنة المساواة العرقية 25 (التجربة في أرقام 2C و3I-J). - حلق الرأس بين الأذنين والعينين. تطبيق مطهر (providone اليود القائم) إلى حليق الرأس باستخدام قطعة قطن.
- تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء التخدير. تحت الجلد حقن الفأر مع مسكن (القائم على ميلوكسيكام، 0.1 مل من 5 ملغ / مل حل).
- ضع الماوس في إطار المجسم (الشكل 1A) والحفاظ على التخدير عن طريق قناع غازات التخدير (الأيزوفلورين: 2٪ في الأكسجين للصيانة). تحقق عمق التخدير باستخدام انسحاب الطرف المنعكس قبل المتابعة.
ملاحظة: الحفاظ على ظروف معقمة وكذلك ممكن خلال العملية الجراحية بأكمله؛ ارتداء قناع الوجه القابل للتصرف، الذهاب الجراحيةسفل، وقفازات. - جعل شق الجلد في أعلى الرأس باستخدام مقص. سحب الجلد بلطف إلى الجانب باستخدام الملقط حادة، مع تحديد المشابك لفضح سطح الجمجمة، والجمجمة نظيفة مع H 2 O 2.
- مواقع الحقن علامة على الجمجمة باستخدام غرامة غيض علامة وحفر ثقوب دائمة لكل من نصفي الكرة الأرضية (الشكل 1B). إحداثيات الحقن في هذه الدراسة (من Bregma (مم)): mPFC: الأمامي 1.9 الجانبية ± 0.3، 2.1 بطني. MGM / PIN: الخلفية 3.0 الجانبية ± 1.8، 3.8 بطني. mpITC / جيش تحرير بلوشستان: الخلفي 1.45، 3.35 ± الوحشي، وبطني 4.75.
- جبل ماصة زجاجية مملوءة على إطار المجسم اتصال إلى جهاز حقن الضغط وتقديم ماصة للموقف Bregma.
- قطع غيض من ماصة الزجاج باستخدام ملقط غرامة مستقيم الحافة. هل هذا بلطف لمنع توليد الهباء الجوي من حل الفيروس. تأكد من غيض ماصة مفتوح من خلال تطبيق عدد قليل من البقول ضغط ومراقبة قذف قطرات من فيروالصورة الحل.
- انتقل إلى إحداثيات حقن المطلوب وحقن نصف محتوى ماصة (~ 0.5 ميكرولتر) باستخدام الإعدادات التالية على جهاز حقن الضغط: الضغط: 20 رطل، ومتوسط طول النبض: 30 مللي ثانية، ومتوسط عدد النبضات: 50.
- ترك ماصة في مكان ~ 1 دقيقة قبل ببطء (1 مم / دقيقة) يتراجع ذلك.
ملاحظة: تأكد لا يتم حظر على يقين ماصة قبل تكرار العملية مع نفس ماصة على نصف الكرة الأرضية الآخر. في حالة طرف المحظورة، نظيفة أو قطع طرف وموقف ماصة صفر في Bregma مرة أخرى. - الجمجمة نظيفة مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4)، وإزالة المشابك، بلطف سحب الجلد معا، وخياطة الجرح مع الفردية خياطة زر (3-4 عقدة). تطبيق مطهر (providone اليود القائم) حول الجرح.
- وقف التخدير ولا تترك الماوس غير المراقب حتى يتم مستيقظا تماما. الحفاظ يقع فندق واحد أو العودة إلى صحبة الحيوانات الأخرى فقط عندما تعافى تماما. بعد العمل الجراحي، ومواصلة مراقبة الوضع الصحي، واداريةثالثا مسكن إذا لزم الأمر. اتبع الإجراءات وفقا للقواعد التي طرحتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المحلية.
2. إعداد شرائح الحادة
- إعداد ACSF، وقطع حل، أدوات (مقص، مشرط، ملقط، ملعقة، ماصة باستير)، وكتل آغار.
ملاحظة: 1 لتر من الاصطناعي الدماغية الشوكي السائل (ACSF) مطلوب في التجربة، وأنها مستعدة عن طريق إذابة المواد الكيميائية في المقطر المزدوج-H 2 O كما نشرت سابقا 16،23. يتم تحضير محلول القطع من خلال استكمال 200 مل من ACSF مع 0.87 مل من 2 M MgSO 4 الحل الأسهم. - ACSF الأوكسجين والحل القطع في كافة مراحل التجربة مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- تخدير عميق ماوس باستخدام آلة التخدير الحيوانات الصغيرة باستخدام الأيزوفلورين (3٪ في الأكسجين). تحقق عمق التخدير باستخدام انسحاب الطرف المنعكس قبل المتابعة.
- قطع رأس فأر باستخدام مقص كبير والبرد فورارئيس في حل قطع الجليد الباردة.
- الجمجمة مفتوحة من شق خط الوسط واحد من الذيلية إلى منقاري، ودفع بلطف قطعة من الجمجمة إلى الجانبين باستخدام ملقط. بسرعة إزالة الدماغ عن طريق رفع برفق خارج الجمجمة باستخدام ملعقة صغيرة مدورة. قطع المخيخ مع مشرط. وضع الدماغ في حل قطع الجليد الباردة.
- لمواقع الحقن mPFC: قطع الجزء الأمامي من الدماغ (التي تحتوي على mPFC) باستخدام مشرط ووضعها في محلول قطع الجليد الباردة حتى تشريح.
- إزالة حل القطع الزائد مع ورقة الترشيح والغراء الجزء الخلفي من الدماغ على خشبة المسرح vibratome.
- لشرائح اللوزة إمالة، الغراء الدماغ على خفض كتلة آغار (4٪) عند 35 درجة زاوية (1D الشكل، وسط). لشرائح اللوزة الاكليلية، مواقع الحقن MGM / PIN ومواقع الحقن mPFC، الغراء الدماغ مباشرة على خشبة المسرح (1D الشكل، اليسار واليمين). وضع كتلة آغار إضافي وراء الدماغ للاستقرار أثناء تقطيع.
- PLACالمرحلة الإلكترونية في قطع الغرفة مع الحل قطع الاوكسيجين الجليد الباردة التي يتم الاحتفاظ في 4 درجة مئوية باستخدام وحدة التبريد. تحضير شرائح الحادة للاللوزة (320 ميكرون) باستخدام شفرة الياقوت. وضع شرائح في غرفة واجهة المتوفرة مع ACSF الاوكسيجين في RT.
- بعد إعداد شرائح اللوزة الحادة، ووضع غرفة واجهة في بالحمام المائي في 36 درجة مئوية لاسترداد شرائح ل35 - 45 دقيقة. وفي وقت لاحق، والعودة غرفة اجهة لRT. للتسجيل من هذه الشرائح، تابع الخطوة 3.2.
- أثناء بدء خطوة 2.10، وقطع شرائح من مواقع الحقن كما هو موضح من قبل لشرائح اللوزة الحادة (الخطوات 2،8-2،9). ليس مطلوبا استرداد شرائح في بالحمام المائي هنا. اختياري: لتقدير بسرعة موقع الحقن، ومراقبة شرائح على المجسام مجهزة مصباح الفلورسنت وأجهزة تصفية مناسبة.
- إصلاح شرائح تحتوي على مواقع الحقن لتحليل ما بعد مخصصة من قبل يقحم عليها بين أوراق الترشيح وsubmerجينج لهم في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني حل O / N. لتحليل مواقع الحقن المضي قدما في خطوة 4.1.
3. التصور وتحفيز ألياف قبل المشبكي
- إعداد المجهر التصحيح لتفعيل علم البصريات الوراثي من الألياف والخلايا:
- توسيط الصمام الثنائي ضوء ينبعث منها شنت (LED) على مسار تسليم خفيفة.
- قياس شدة الضوء LED في المستوى البؤري الظهر وفي إخراج كل هدف مع السلطة متر اختيار الطول الموجي المناسب من 470 نانومتر.
- حساب شدة الضوء في ميغاواط / مم 2 وإنشاء منحنى المعايرة (كثافة LED (٪) مقابل ناتج الضوء (ميغاواط / مم 2)) لكل هدف من الأهداف عن القيم المقاسة عن 470 نانومتر الطول الموجي.
- استرداد شريحة اللوزة الحادة من غرفة واجهة ومكان في الغرفة شريحة التي شنت على المجهر تستقيم مجهزة مصباح الفلورسنت. احرص على وضع شريحة من هذا القبيل أن SLICالبريد سطح تواجه صعودا في غرفة واجهة يواجه أيضا صعودا في غرفة تسجيل. يروي شريحة مع الطازجة، ASCF الاوكسيجين بمعدل 1-2 مل / دقيقة عند درجة حرارة ~ 31 درجة مئوية.
- مراقبة الألياف قبل المشبكي في شريحة باستخدام مصباح الفلورسنت بالاشتراك مع مجموعات مرشح المناسبة لببروتين معين التعبير عنها. استخدام الهدف 5X للحصول على نظرة عامة (الشكل 1E)، و60X الهدف لتقييم كثافة الألياف داخل المنطقة المستهدفة.
ملاحظة: للحصول على GFP و YFP، واستخدام تصفية مجموعة "الخضراء" (الإثارة 472/20، مقسم الأشعة 495، انبعاث 490 ليرة لبنانية) لmCherry استخدام فلتر ضبط "الأحمر" (الإثارة 560/40، مقسم الأشعة 585، انبعاث 630/70) كما هو محدد في الجدول المواد / المعدات. - فتح أو تقييد فتحة في ضوء مسار المجهر النحو المرغوب فيه للتجربة (الشكل 2D).
- للحصول على تسجيل التصحيح، وملء ماصة التصحيح مع الحل الداخلي وجبل طحامل القطب ن. تطبيق الضغط الايجابي على ماصة التصحيح وخفض ببطء لأول مرة في حل حمام ثم تحت المراقبة البصرية في شريحة باستخدام micromanipulator.
- الاقتراب من الخلايا العصبية في المصالح مع ماصة التصحيح من جانب وأعلى. الافراج عن الضغط الايجابي عندما ماصة هو على سطح الخلية (مرئية الدمل على سطح الخلية) والحصول على "gigaseal" عن طريق الضغط السلبي.
- تطبيق مزيد من الشفط لتمزق غشاء التصحيح للحصول على تسجيل خلية كاملة. وفي وقت لاحق، وتحفيز ألياف المسمى مع الصمام مرتبطة باستخدام الطول الموجي المناسب لتفعيل لجنة حقوق الإنسان (470 نانومتر) في حين تم تسجيل الاستجابات الكهربائية من الخلية.
- لتحفيز متشابك تبدأ مع الصمام كثافة منخفضة وزيادة حتى يتم الوصول إلى السعة الحالية متشابك المطلوب. تحريك الصمام عن طريق تكوين مخرجات الرقمية في البرنامج الحصول على البيانات للسيطرة على توقيت ونبض طول (الأمثلة في الشكل3).
ويمكن استخدام برامج أخرى و / أو توليد TTL أجهزة لتحريك الصمام: مذكرة.
- كرر التحفيز مع فتح أو المقيدة الفتحة (الخطوة 3.4) في ضوء مسار المجهر النحو المرغوب فيه للخلية سجلت المقبلة و / أو في وجود أدوية محددة.
- بعد تسجيل، وتحديد شرائح لتحليل ما بعد مخصصة من قبل يقحم عليها بين أوراق الترشيح وغمر لهم في 4٪ PFA O / N.
- تحليل البيانات الكهربية.
ملاحظة: استخدام البرمجيات المناسبة لتصور البيانات الاجتياح المسجلة لكل فرد التحفيز حاليا. عند تحليل آثار المخدرات، استخدم للكشف عن الروتين الذروة للحصول على مدار الساعة من تأثير المخدرات على سعة الحالية متشابك لجميع الاحتلالات الفردية. تحديد متى يصل تأثير المخدرات حالة مستقرة. لإعداد متوسط الاستجابات التمثيلية للشخصيات، استخدام البرنامج لمتوسط ≥10 الاحتلالات الفردية لكل حالة تجريبية (راجع الشكل 3B-D، FH، J اللوحة اليمنى).
ملاحظة: عدة حزم البرمجيات بديلة يمكن استخدامها لتحليل البيانات.
4. بعد خاص تحليل مواقع حقن
- تغسل شرائح من مواقع الحقن (من الخطوة 2.12) وتسجيل المواقع (إذا كان المطلوب هو إعادة التصوير، من الخطوة 3.7) ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. ويتم ذلك عن طريق استبدال مرارا وتكرارا الحل مع برنامج تلفزيوني جديد على شاكر الدورية ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة.
- إعداد 2٪ محلول الآجار في برنامج تلفزيوني، وندعه يبرد إلى ~ 65 درجة مئوية. مكان شرائح مسطحة على الجزء السفلي من الصغيرة 30 مم طبق بتري قطر، تضمين شرائح في أجار أجار وندعه يبرد حتى الصلبة.
- الغراء كتلة أجار مع شريحة جزءا لا يتجزأ أو شرائح لمرحلة من مراحل vibratome ووضع مرحلة في قطع الغرفة مع برنامج تلفزيوني.
- بتر جزءا لا يتجزأ من شرائح إلى 70 ميكرون سمك. اختياري: بعد resectioning، يمكن أن تكون ملطخة شرائح، أي مع Neurotrace للكشف عن التهندس الخلوي (الشكل 3A، C)، و / أو بذ تلطيخ المناعي للYFP أو mCherry لتعزيز إشارة من انصهار بروتين مركز حقوق الانسان.
- شرائح جبل على الشرائح وساترة مع وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. مواقع الحقن صورة و، إذا رغبت في ذلك، أيضا شرائح صورة تحتوي على الألياف في مناطق الإسقاط باستخدام مجهر فلوري أو متحد البؤر ليزر المسح المجهر (الشكل 2A-C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهذا المقطع يبين سير العمل نهج علم البصريات الوراثي خارج الحي ونتائج ممثلة من استراتيجيات تجريبية مختلفة للتحقيق في الخصائص الفيزيولوجية من التوقعات الحسية وتغييري بعيدة المدى لجيش تحرير بلوشستان والخلايا العصبية mpITC وكذلك خصائص الاتصال المحلي بين mpITC وجيش تحرير بلوشستان.
بعد حقن المجسم من ناقلات فيروسية المختارة في الإحداثيات المطلوبة في مخ الفأر (الشكل 1A-C، الفيروسي الوقت التعبير 2-6 أسابيع، اعتمادا على التجربة)، ويتم إعداد شرائح الدماغ الحادة للمواقع الحقن ومناطق الإسقاط في اللوزة في زاوية مناسبة للتجارب التصحيح، المشبك ومن منطقة في الدماغ حقن لتحليل ما بعد مخصصة للمواقع الحقن (1D الشكل). قبل بدء التسجيلات والتحفيز علم البصريات الوراثي، وخلايا fluorescently المسمى أو الموالية المحاوريجب أن يتم التحقق jections في المنطقة المستهدفة (اللوزة) على المجهر تستقيم للتسجيلات التصحيح المشبك باستخدام مصباح الفلورسنت المرفقة (الشكل 1E). بعد الحصول على التصحيح، المشبك تسجيل من الخلية المستهدفة المفترضة في المنطقة إسقاط شريحة، يتم بدء التحفيز خفيفة بينما يتم التحكم في نقطة زمنية، الفاصلة، وطول النبض عن طريق برنامج التصحيح الذي يقوم بتشغيل التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED). اعتمادا على استراتيجية التجريبية (الشكل 2A-C، يمين) فتحة في مسار ضوء الفلورسنت إما فتح تماما أو مقيدا (الشكل 2D). مع الحفاظ على طول نبض ثابتة وقصيرة قدر الإمكان (مثالي ≤1 ميللي ثانية)، الصمام كثافة الانتاج يزداد ببطء لتقييم أي كثافة هو مطلوب لتحقيق السعة المطلوبة للاستجابة متشابك في تجربة معينة (الشكل 2E). بعد التسجيل، شرائح اللوزة هي مرحلة ما بعد الثابتة. على resectioning واختيارييتم تصوير مواقع تلطيخ والحقن وتسجيل على المجهر متحد البؤر للتحقق من حقن موقع واستبعاد البيانات من الحقن في غير محله. وتظهر الصور من مواقع الحقن والتوقعات محور عصبي يرتبط في اللوزة المخية للاستراتيجيات التجريبية الثلاث (مدخلات mPFC لجيش تحرير بلوشستان، والمدخلات مهادي إلى mpITCs، وتفعيل mpITC المحلي) في الشكل 2A-C.
ويبين الشكل 3 نتائج ممثلة تسجيل تم الحصول عليها من الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان، interneurons جيش تحرير بلوشستان المحلي والخلايا العصبية mpITC توضح خصائص ردود أثار ضوئية للاستراتيجيات التجريبية المختلفة المستخدمة (الشكل 3A، E، I). لاستهداف الخلايا العصبية GABAergic (interneurons المحلي وmpITCs) للتسجيل، واستخدمت GAD67-GFP الفئران مراسل (24). لmPFC والتوقعات مهادي الحسية، عدة جوانب من انتقال متشابك يمكن دراستها. الدقة الزمنية للميلانيحصر تفعيل والخصائص الحركية للس. المستخدمة في هذه الدراسة تمكن التحفيز موثوق بها مع نبضات يقترن في أحد بين التحفيز الفاصل الزمني من 50 مللي ثانية. وهذا يسمح لتحليل نسب إقران النبض (PPR) من التيارات بعد المشبكي (شركات الأمن الخاصة)، والتي يمكن أن تكون إما تسهيل أو الاكتئاب اعتمادا على الإسقاط ونوع الخلية المستهدفة، وتكون بمثابة مؤشرات احتمال الإفراج قبل المشبكي (الشكل 3B، F، H) . بالإضافة إلى ذلك، تحليل الإختفاء متشابك يسمح لتشريح مختلف مكونات استجابة بعد المشبكي.
في هذا المثال، الإختفاء أطول من مجلس السلم والأمن المثبطة (IPSC) مقابل عنصر PSC مثير (EPSC) تشير إلى وجود مدخلات ثنائي التشابك والأحادي المشبك، على التوالي (الشكل 3C). وفي حالات أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى تحليل أكثر دقة من خصائص إضافية EPSC مثل غضب استجابة أو معامل التباين في حجم الاستجابة لاستخلاص استنتاجات على أحادية، أو disynaطبيعة ptic 17،23. وعلاوة على ذلك، يمكن للتطبيق حاصرات الدوائية لمستقبلات معينة تحدد طبيعة الأمنية الخاصة (أي glutamatergic EPSC وGABAergic IPSC، الشكل 3C-D). كما هو متوقع، كان العنصر في وقت مبكر من المدخلات mPFC glutamatergic، في حين أن المكون أواخر GABAergic. كتلة كاملة من كلا EPSC وIPSC مع مستقبلات الغلوتامات مانع CNQX يدعم كذلك أن IPSC هو ثنائي التشابك. للتحقيق في تعديل انتقال متشابك في الألياف تنشيط optogenetically، وآثار منبهات ومضادات لمستقبلات metabotropic (هنا مستقبلات GABA B) على السعة وطاعون المجترات الصغيرة يمكن تقييم لتقييم التأثيرات على مواقع قبل وبعد المشبكي. في هذا المثال، انخفاض يصاحب ذلك من السعة مع زيادة في طاعون المجترات الصغيرة يدل على التشكيل قبل المشبكي من الألياف تفعيلها للضوء (الجيل الثالث 3G، H). وأخيرا، والتفاعلات المحلية من الخلايا في اللوزة يمكن تقييم، على سبيل المثال،عندما يتم حقن الفئران التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة المروج Tac2 25 مع مركز حقوق الانسان معربا عن ناقلات فيروسية floxed المزدوج (الشكل 1C). لأن Tac2 وبالتالي، يتم التعبير عن مركز حقوق الانسان في mpITC واللوزة المركزية (الشكل 2C)، واقتصر تفعيل الضوء على mpITC عن طريق إغلاق مسار ضوء الفلورسنت الفتحة (الشكل 2D). في ظل هذه الظروف، إمكانات العمل، أثار ضوء يمكن استنباط في mpITCs المصابين. الردود المثبطة الكمون قصيرة متشابك في جيش تحرير بلوشستان تشير إلى وجود علاقة وظيفية بين المثبطة mpITC وجيش تحرير بلوشستان الخلايا العصبية الرئيسية.
الشكل 1. التجسيمي الحقن، إعداد الحاد الدماغ شرائح، والتخيل من ألياف قبل المشبكي. (A، B) حقن فيروس المجسم. أ) صورة من الماوس تخدير وضعت في إطار المجسم مع الجمجمة كشفت وحقن ماصة. أقحم: التكبير في صورة ماصة الحقن مملوءة بمحلول فيروس مختلطة مع الأخضر سريع. شريط مقياس: 3 مم. (ب) رسم تخطيطي للجمجمة الفأر مع مواقف ملحوظ في الحفر للمناطق الحقن المختلفة. (ج) خطة تبين يبني الفيروسية المختلفة المستخدمة في هذه الدراسة. الرمادي الداكن: تسلسل المروج. الأزرق: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R))؛ الأخضر / الأحمر: البروتين الفلوري. كان الوقت التعبير 2 أسابيع لتوقعات اللوزة المحلية و4-6 أسابيع لتوقعات من mPFC وMGM / PIN. (د) إعداد شرائح الدماغ الحادة: مخطط يظهر وضع مخ الفأر في مرحلة تقطيع اللحم للحصول على شرائح من مناطق الحقن والإسقاط مختلفة. (E) التصور من الألياف في شرائح الدماغ الحادة من ماوس GAD67-GFP حقنه بفيروس ChR2-mCherry في MGM / PIN. تؤخذ الصور على المجهر التصحيح تستقيم مع مختلف مجموعات مرشح: التعبير GAD67-GFP والمتوسطة. الألياف MGM / PIN المسمى مع مولوديةهيري، والحق. شريط مقياس: 200 ميكرون. mPFC، سطي الفص الجبهي القشرة. mpITC، سطي paracapsular خلايا مقحم. جيش تحرير بلوشستان، اللوزة basolateral. MGM، سطي نواة الركبي، جزء وسطي. PIN، الخلفية داخل الصفيحة النواة المهادية. LA، اللوزة الجانبية. مكتبة الإسكندرية، واللوزة القاعدية. CEA، النواة المركزية للاللوزة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مواقع حقن، مناطق الإسقاط، وعلم البصريات الوراثي تحفيز التوقعات المحاور. (AC) صور متحد البؤر مواقع الحقن التمثيلية ومناطق الإسقاط في جيش تحرير بلوشستان، ومخططات الاستراتيجيات التجريبية. (A) اليسار: موقع الحقن mPFC في C57BL / 6 الماوس ملطخة Neurotrace. شريط النطاق:500 ميكرون. الأوسط: التوقعات في جيش تحرير بلوشستان المقابلة في شريحة اللوزة مائلة. شريط مقياس: 200 ميكرون. الصحيح: رسم تخطيطي للإضاءة حقل كاملة من التوقعات mPFC وتسجيل الخلايا العصبية في جيش تحرير بلوشستان. (ب) اليسار: MGM / PIN موقع الحقن في الماوس GAD67-GFP. شريط مقياس: 500 ميكرون. الأوسط: توقعات المناظرة في mpITC ولوس انجليس لشريحة اللوزة الاكليلية. شريط مقياس: 200 ميكرون. الصحيح: رسم تخطيطي للإضاءة حقل كاملة من التوقعات MGM / PIN وتسجيل خلية عصبية mpITC. (C) اليسار: التعبير المحلي من ChR2-YFP في Neurotrace الملون اللوزة شريحة من الماوس Tac2-لجنة المساواة العرقية. شريط مقياس: 200 ميكرون. أقحم: التكبير من mpITCs معربا عن ChR2-YFP. شريط الحجم: 20 ميكرون. اليمين: رسم تخطيطي للإضاءة محدودة من الكتلة mpITC وتسجيل الخلايا العصبية جيش تحرير بلوشستان. (D) صور من غرفة تسجيل أثناء الولادة ضوء وصورة من الخلايا العصبية في الدماغ شرائح الحادة (مجموعة mpITC) في الماوس GAD67-GFP مع أبر المفتوحة والمقيدةتلح. شريط الحجم: 30 ميكرون. (E) التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) التي حركها مختلفة الشدة LED (أعلى) ومؤامرة من السلطة الخفيفة مقابل أثارت EPSC السعة (القاع) من الخلايا العصبية mpITC تمثيلية على تفعيل علم البصريات الوراثي من الألياف من MGM / PIN. شريط الحجم: 100 PA / 10 ميللي ثانية.
ملاحظة: يتم تعديل الشكل 2A من مرجع رقم 16 والشكل 2C من مرجع رقم 23 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. النتائج المثالية من علم البصريات الوراثي تفعيل طويلة المدى والتوقعات المحلية. (A) خطة استراتيجية تجريبية ل(BD). (ب) EPSCs التمثيلية المسجلة من الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان وجيش تحرير بلوشستان عصبون على علم البصريات الوراثي التحفيز إقران النبض (50 مللي ثانية بين التحفيز الفاصل الزمني) من الألياف من mPFC انتزاع إقران تسهيل النبض ويقترن الاكتئاب النبض، على التوالي. شريط الحجم: 100 PA / 25 ميللي ثانية. (ج) تفعيل علم البصريات الوراثي من الألياف من mPFC يثير تثبيط التغذية إلى الأمام. اليسار: الممثل EPSC (في -70 بالسيارات) والحالية بعد المشبكي المثبط (IPSC، في 0 بالسيارات) في الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان. وIPSC لديه الكمون متشابك أطول مقارنة EPSC. الحانات الحجم: 200 PA / 10 ميللي ثانية و 200 PA / 2 مللي ثانية. اليمين: ضوء أثار ثنائي الطور EPSC / IPSC تسلسل (في -50 بالسيارات) تم حظره من قبل خصم أمبا / Kainate CNQX (10 ميكرون)، مما يدعم طبيعة ثنائي التشابك من IPSC. شريط النطاق: 50 السلطة الفلسطينية / 5 ميللي ثانية. (د) آثار كتلة لاحق من EPSC / تسلسل IPSC (في -50 بالسيارات) من الكلور - قناة مانع بيكروتوكسين (PTX، و 100 ميكرومتر) وPTX + CNQX. تم حظر التوجيهية التي كتبها PTX وEPSC المتبقية CNQX. أشرطة النطاق: 50 السلطة الفلسطينية / 5 ميللي ثانية. (E) خطة استراتيجية تجريبية ل(FH). F) EPSCs التمثيلية سجلت من mpITC والخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان على علم البصريات الوراثي التحفيز إقران النبض من الألياف من MGM / PIN. شريط النطاق: 50 السلطة الفلسطينية / 20 ميللي ثانية. يتم حظر (G) EPSCs في الخلايا العصبية mpITC آخر من حاصرات قنوات الصوديوم سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، و 0.5 ميكرومتر)، مشيرة إلى أنها تعتمد على النشاط قناة الصوديوم. شريط النطاق: 50 السلطة الفلسطينية / 20 ميللي ثانية. (H) والتضمين المدخلات مهادي إلى الخلايا العصبية mpITC من قبل المشبكي مستقبلات GABA B. EPSCs تحت ظروف الرقابة، والحد من EPSC السعة ويصاحب ذلك زيادة في نسبة النبض تقرن خلال تطبيق ناهض GABA B باكلوفين (2 ميكرون)، واسترداد كل من السعة والمبدئي يقترن التموينية نبض على المشارك تطبيق خصم CGP55845 GABA B (10 ميكرومتر). هذه التغييرات هي التي تشير إلى تعديل قبل المشبكي بواسطة مستقبلات GABA B. شريط النطاق: 50 السلطة الفلسطينية / 20 ميللي ثانية. (I) خطة استراتيجية تجريبية ل(J). (J) امكانات العمل المسجلة من ChR2-YFP معربا عن mpITC الخلايا العصبية الخفيفة أثار. IPSCs ضوء أثار المسجلة من الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان في إمكانات عقد مختلفة (-90، -70، -50، -20، و 0 فولت) عكس حول إمكانية التوازن المحسوب لالكلورين -. أشرطة النطاق: 20 فولت / 100 ميللي ثانية و 10 PA / 10 ميللي ثانية. ملاحظة: يتم تعديل الشكل 3B-D من المرجع # 16، والشكل 3H وJ من مرجع رقم 23 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لخارج الحي التحقيق علم البصريات الوراثي من الدوائر العصبية والربط المحلية التي يمكن تنفيذها بسهولة على معظم، إن لم يكن كلها، تستقيم شريحة تسجيل التصحيح، المشبك الاجهزة عن طريق تزويدهم مع ~ 470 نانومتر LED في ميناء ضوء epifluorescence. والميزة الرئيسية لتحفيز علم البصريات الوراثي من التوقعات محور عصبي في شرائح هو أنه يتيح للتنشيط والتحقيق في خصائص الاتصالات التي لم تكن في متناول مع التحفيز الكهربائي التقليدية محددة، لأن مساحات الألياف المقابلة لم تكن معروفة، غير واضح المعالم، أو لا يتم الاحتفاظ في شريحة الدماغ واحدة. وكمثال رئيسي ذات الصلة للدوائر الخوف، فمن يتضح كيف يمكن تطبيقها على تشريح خصائص مدخلات mPFC إلى اللوزة.
وحتى في الحالات التي تم فيها استخدام التحفيز الكهربائي الألياف الجهاز على نطاق واسع في الدراسات السابقة، هذه المناطق غالبا ما تحمل الألياف من مناطق مختلفة المنشأ. على سبيل المثال، في الدوائر ذات الصلة للخوف التعلم، والتوقعات من نواة مهادي أو المناطق القشرية مختلفة الحسية شوط تتداخل من خلال كبسولات الداخلية والخارجية، على التوالي. ميزة التحفيز علم البصريات الوراثي هو أنه يمكن تفعيل الانتقائي للمجموعة فرعية من الألياف من منطقة محددة. ويتضح ذلك للمدخلات مهادي محددة من PIN و MGM إلى خلايا مقحم والخلايا الرئيسية اللوزة الجانبية. وعلاوة على ذلك، المشاكل التي تنشأ مع التحفيز الكهربائي، أي تفعيل ألياف أخرى المرور أو الخلايا في محيط القطب محفزة التي قد تجعل الاتصالات المحلية في المنطقة المستهدفة يمكن التغلب عليها. ومع ذلك، في حين أن التحفيز علم البصريات الوراثي سريعا على قدم المساواة مع التحفيز الكهربائي، قد تكون هناك قيود بشأن وتيرة التحفيز التي يمكن تطبيقها بشكل موثوق. هذا يعتمد على تثبيط وdeinactivation حركية والبديل من مركز حقوق الانسان والذي يتم استخدامه، 4 وكذلك expressioمستويات ن وطرق وأساليب التحفيز ضوء 26.
عند استخدام LED التي شنت على ميناء مضان لتحفيز الضوء، مضاءة عادة الحقل بالكامل نظر هدف معين، مما أدى إلى تفعيل جميع الألياف أو خلايا في الميدان وداخل عمق معين. هذا لا يمكن إلا جزئيا يقتصر على منطقة صغيرة أو مجموعة من الخلايا المسمى (في هذا المثال، mpITC) باستخدام فتحة في مسار ضوء الفلورسنت 23،27. مع المصابيح، قوة الضوء ليست قضية، وعالية الطاقة المصابيح الزرقاء متوفرة الآن من العديد من الشركات المصنعة. ومع ذلك، فإن أطياف الانبعاثات لديها قيم نصف كحد أقصى ذات العرض الكامل من عدة عشرات من نانومتر. لذلك، المصابيح تشكل القيود عندما يتم المطلوب إما التحفيز دقيقة مكانيا لرسم الخرائط التحت خلوية من الاتصال و / أو التحفيز أحادي اللون. يمكن تحسين كلا باستخدام أشعة الليزر الزرقاء ومصادر الضوء، وعادة في تركيبة مع الاجهزة أكثر تطورا تتيح القطرانغيتينغ و / أو المسح الضوئي من الحزم في مناطق صغيرة وأعماق الأنسجة محددة (على سبيل المثال، انظر 28).
مع وصف فيفو السابقين نهج علم البصريات الوراثي هنا، العديد من الخصائص من انتقال متشابك يمكن دراستها. لتقييم monosynapticity المكون أوائل متشابك ردا على ذلك، تحليل دقيق من الإختفاء وغضب، وكذلك استجابة اتساع التباين وينبغي أن تستخدم على عينة تمثيلية من الخلايا العصبية المسجلة (على سبيل المثال، انظر 16،17،23). في الحالات التي يكون فيها تفعيل نشاط الشبكة قد تلعب دورا، وطريقة الاختيار لعزل العنصر الأحادي المشبك المباشر من خلال تطبيق مجموعة من سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) لمنع إمكانات العمل في تركيبة مع K + قناة مانع 4 aminopyridine (4- AP) لمنع عودة الاستقطاب 14،28،29. يمكن التعرف على المستقبلات التوسط المكونات الأحادية وثنائي التشابك المدخلات باستخدام حاصرات الدوائية. Furthermorالبريد، فمن الممكن لدراسة جوانب التشكيل قبل المشبكي المدخلات تنشيط optogenetically في اللوزة 23،30. والتحذير المحتمل أن ChR2 لديه بعض 1،4 نفاذية الكالسيوم وتم اقتراح تفعيله في ألياف قبل المشبكي ومحطات لتغيير الافراج عن احتمال بواسطة آليات مختلفة 26،31. ومع ذلك، العديد من الدراسات بما في ذلك أمثلة تظهر هنا استخدمت بنجاح التعبير ChR2 لتحديد الإدخال- واستهداف الاختلافات خلايا محددة في نسب إقران النبض في اللوزة وغيرها من مناطق الدماغ 16،23،26،32 وتعديل أظهرت علاوة على ذلك الإفراج احتمال بتنشيط من مسارات إشارات محددة في محطات قبل المشبكي التي لم يستبعدها تفعيل لجنة حقوق الإنسان 23،30. مزيد من الدعم يأتي من البيانات في الحصين والمخيخ، وتبين أن مع أسلوب التعبير مركز حقوق الانسان المناسب وتقنية التحفيز الخفيفة، والجوانب الفسيولوجية بما في ذلك فعالية إطلاق والإخلاص سانتقال متشابك و يمكن دراسة موثوق بها (26). وأخيرا، قد استخدمت أيضا تنشيط الألياف علم البصريات الوراثي بنجاح لتطبيق بروتوكولات التحفيز التي تحفز متشابك 31،33،34 اللدونة.
عدة جوانب حاسمة لنجاح هذا الأسلوب. واحد هو دقة استهداف المجسم من ناقلات فيروسية. ولذلك، فإنه من المفيد لتقييم بسرعة موقع الحقن قبل الحصول على التسجيلات وثم إجراء تحليل أكثر تفصيلا بعد خاص. بالإضافة إلى الدقة المكانية، وبقاء الخلايا العصبية في موقع الحقن هي المحدد الرئيسي لإجراء تجربة ناجحة وتعتمد على تقنية الحقن. فالخيار المعروض، وذلك باستخدام أقطاب الزجاج طويلة ورقيقة مدبب، يخدم هذا الغرض جيدا لكل من مناطق الدماغ أكثر عمقا سطحية، ولكن قد يكون العيب أن تفتق مرنة جدا. والبديل هو استخدام المحاقن ميكروليتر خاصة المتقدمة للتسليم التجسيمي في علم الأعصاب (العصبية الصورةyringes) مع الإبر أكثر جمودا التي يمكن الاستغناء كميات صغيرة. خصوصية استهداف مركز حقوق الانسان في التعبير إلى أنواع الخلايا المحددة والمناطق يمكن زيادة تحسين استخدام مشروط التعبير 7، على سبيل المثال مع لجنة المساواة العرقية النظام كما هو موضح لخلايا اللوزة مقحم. وهذا يسمح أيضا استخدام المروجين قوي في ناقلات فيروسية لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على.
جانب آخر بالغ الأهمية هو اختيار الناقل الفيروسي. للتعبير عن لجنة حقوق الإنسان، واستخدمت الفيروسات المرتبطة الغدة المؤتلف (rAAVs) التي لديها ميزة كونها مستوى السلامة الأحيائية 1 ناقلات مقارنة بأنظمة الفيروسية الأخرى الشعبية. وقد استخدمت rAAVs لبعض الوقت، وعادة ما تكون ناقلات آمنة وموثوق بها مع مع الأجسام العصبي جيدة والقليل أو لا إمكانية المناعية، ولكن حجم عبواتها يقتصر (حوالي 4-5 كيلو بايت) 35. في هذه التجارب محددة، الأنماط المصلية 2/9 و 2/1 استخدمت للتعبير في كل مكان ومشروط، على التوالي. وفقا للأدب، والأنماط المصلية حد ذاته تنبيغ الخلايا في المنطقة المستهدفة، ولكن يبدو أن لا يتم تناولها من قبل محاور لretrogradely خلايا التسمية، على عكس الأنماط المصلية 2/5 و 2/6 36،37. ومع ذلك، ينبغي أن التجارب الأولية تستبعد أن هناك أجسام الخلايا وصفت لجنة حقوق الإنسان في المناطق إسقاط لموقع الحقن، وهو أمر مهم خصوصا عند دراسة مناطق الدماغ مرتبطة بالتبادل مثل mPFC واللوزة. عدة دراسات حديثة مقارنة فعالية الأنماط المصلية rAAV في مناطق الدماغ المختلفة في الجرذان والفئران 36،38،39. لقد برزت فكرة أن الأنماط المصلية الجديدة (على سبيل المثال، 2/1، 2/8 و 2/9) عادة ما تكون أكثر كفاءة من الأصلي 2/2 المصلي. ومن الجدير ذكره التعبير بوساطة rAAV لجنة حقوق الإنسان، في المقابل إلى أساليب أخرى، لم تتسبب في آثار ضارة على التعبير عن الخلايا أو محاور وصفت 40. الساعة التعبير اللازمة لتحقيق تنشيط الألياف فعالة خارج الجسم يبدو أن تعتمد على المسافة من الإسقاط دراستها. هنا وبما يتفق مع لايتrature، لوضع العلامات وتفعيل الاتصالات بعيدة المدى في الماوس (mPFC والمدخلات الحسية)، وقت التعبير عن 4-8 أسابيع هو مطلوب، في حين لدراسة الربط المحلي في اللوزة، وأحيانا التعبير أقصر من 2-3 أسابيع ل يكفي 14-17،23،30،34.
لتسجيل استجابات أثارت optogenetically في المنطقة المستهدفة، واثنين من العوامل الحاسمة: 1) يحتاج إلى شريحة الدماغ الحادة لتكون من نوعية جيدة و 2) كمية كبيرة من الألياف وصفت قابلة للحياة لا بد من الحفاظ عليها. ويمكن تحسين نوعية شرائح باستخدام شفرات الياقوت للتشريح. الحفاظ على محاور عصبية وبالتالي، حجم والاستقرار الردود الخفيفة يمكن تحسين قطع شرائح في زاوية معينة كما هو موضح لتوقعات mPFC اللوزة (1D الشكل و2A) 16،34. ومع ذلك، وهذا يعتمد بقوة على اتجاه afferents في المنطقة المستهدفة، وسوف يتعين تحديدها لكل مجموعة من منطقة الإسقاط وتاr يمكنك الحصول المنطقة. في هذا الصدد، وتحليل ما بعد مخصصة من التوقعات في المنطقة المستهدفة يمكن أن تكون مفيدة. لتعزيز الكشف الألياف وتبيض الالتفاف قد تكون وقعت خلال التحفيز شريحة، المناعية ضد العلامة الفلورسنت على يمكن استخدام البروتين الانصهار مركز حقوق الانسان.
عموما، في الآونة الأخيرة ليس فقط تم تطبيق هذا الأسلوب من خرائط الدوائر علم البصريات الوراثي للخوف من الدوائر، ولكن العديد من الأنظمة الأخرى في الدماغ. في المستقبل، واستهداف subnuclei وأنواع معينة من الخلايا من خلال الجمع بين مجموعة متزايدة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا وناقلات فيروسية الشرطية وتقديم فهم أكثر تفصيلا من تنوع خصائص متشابك وظيفية للدوائر محددة المحلية والبعيدة المدى. وعلاوة على ذلك، immunolabeling بعد خاص من لجنة حقوق الإنسان fluorescently الموسومة في الاتصالات الوظيفية التحقيق يمكن الجمع بين تحليل التركيبية (أي، وذلك باستخدام أساليب مجهرية الإلكترون) لتوفير نظرة ثاقبة مور الدقيقخصائص phological من نقاط الاشتباك العصبي تنشيط سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006--50----ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | Filters can be bought as set F46-008 |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406--25------N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
References
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).
- Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).
- Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).
- Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
