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Neuroscience

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Abstract

approcci optogenetic sono ora ampiamente usati per studiare la funzione di popolazioni neuronali e circuiti combinando espressione mirata di proteine ​​luce-attivati ​​e successiva manipolazione dell'attività neurale dalla luce. Channelrhodopsins (CHRS) sono cationi canali luce-dipendenti e quando fuso con una proteina fluorescente loro espressione permette la visualizzazione e l'attivazione simultanea di specifici tipi cellulari e le loro proiezioni assonale in aree definite del cervello. Via iniezione stereotassica di vettori virali, proteine ​​di fusione CHR possono essere costitutivamente o condizionatamente espressi in cellule specifiche di una regione del cervello definito, e le loro proiezioni assonale possono essere successivamente studiato anatomicamente e funzionalmente via ex vivo attivazione optogenetic in fettine di cervello. Questo è di particolare importanza quando si punta a capire le proprietà sinaptiche di connessioni che non potevano essere affrontate con approcci convenzionali di stimolazione elettrica, o per identificare romanzo affeaffitto e connettività efferente che è stato precedentemente poco conosciuta. Qui, alcuni esempi illustrano come questa tecnica può essere applicata per studiare queste domande a chiarire i circuiti paura legate nell'amigdala. L'amigdala è una regione chiave per l'acquisizione e l'espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali paura e. Molte linee di evidenza suggeriscono che la corteccia prefrontale mediale (mPFC) partecipa a diversi aspetti di acquisizione paura e l'estinzione, ma la sua connettività preciso con l'amigdala è appena iniziando a essere capito. In primo luogo, si mostra come ex vivo di attivazione optogenetic può essere utilizzato per studiare gli aspetti della comunicazione sinaptica tra le afferenze mPFC e cellule bersaglio nell'amigdala basolaterale (BLA). Inoltre, è illustrato come questo approccio optogenetic ex vivo può essere applicato per valutare modelli di connettività nuovi utilizzando un gruppo di neuroni GABAergici nell'amigdala, il cluster paracapsular intercalate cellule (mpITC), come esempio.

Introduction

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strumenti precisi per la visualizzazione e l'attivazione simultanea di connessioni specifiche tra aree cerebrali e specifici tipi di neuroni stanno diventando sempre più importante per capire le connettività funzionale sottostanti sani stati funzioni cerebrali e malattie. Idealmente, questo comporta indagini fisiologica di precise proprietà sinaptiche con cui i neuroni comunicano identificati. Ciò è particolarmente vero per i collegamenti tra aree cerebrali che non possono essere conservati in una sola fetta cerebrale acuto. In passato, questo è stato ampiamente raggiunto in esperimenti separati. Da un lato, traccianti neurali iniettate in vivo sono stati impiegati in combinazione con conseguente leggero o analisi al microscopio elettronico di partner pre e post-sinaptici. D'altra parte, quando tratti di fibre provenienti dalla regione di origine sono conservati e accessibili nella preparazione fetta, stimolazione elettrica è stato usato per valutare i meccanismi di comunicazione sinaptici con celle nella regione di destinazione.

Con l'avvento della optogenetics, l'espressione mirata di cationi canali luce-dipendenti, come Channelrhodopsins (CHRS) fuso con proteine ​​fluorescenti, consente ora di attivazione dei neuroni e loro traiettorie assonale pur consentendo la loro visualizzazione e post-hoc analisi anatomica 1- 4. Perché assoni CHR-esprimono possono essere stimolati anche se isolate dal genitore somata 5, è possibile in fettine di cervello a: 1) valutare ingressi da regioni cerebrali che non erano accessibili con la stimolazione elettrica convenzionale, in quanto tratti di fibre non sono separabili o la traiettoria specifica non è noto; 2) in modo inequivocabile identificare la regione di origine per gli ingressi specifici che sono stati postulate ma non completamente compresi; e 3) studiare la connettività funzionale tra i tipi di cellule definite, sia a livello locale e nelle proiezioni a lungo raggio. A causa di una serie di vantaggi, questa mappatura optogenetic di circuiti in fettine cerebrali è diventato ampiamente utilizzato negli ultimi anni, e una varietà di vettori virali per l'espressione di CHRS fluorescenti-taggato sono prontamente disponibili da fornitori commerciali. Alcuni vantaggi chiave di attivazione optogenetic sopra stimolazione elettrica convenzionale sono danni al tessuto a causa di posizionamento di elettrodi di stimolazione, la specificità della stimolazione fibra, perché la stimolazione elettrica può altresì assumere fibre di passaggio o di altre cellule vicine, e una stimolazione altrettanto rapido e temporalmente precisi. Inoltre, l'iniezione stereotassica di vettori virali può facilmente essere mirati a specifiche aree cerebrali 6 e specifica espressione condizionale o cellula-tipo può essere ottenuto utilizzando l'espressione Cre-dipendente e / o promotori specifici 7. Qui, questa tecnica viene applicata per la mappatura di lungo raggio e circuiti locali nel sistema paura.

L'amigdala è una regione chiave per l'acquisizione e l'espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali 8,9 paura e. Oltre from l'amigdala, la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e l'ippocampo (HC), strutture che sono reciprocamente collegati al amigdala, sono implicati in aspetti di acquisizione, il consolidamento e il recupero di paura e di estinzione ricordi 10,11. Attività in suddivisioni del mPFC sembra giocare un doppio ruolo nel controllare sia alta e bassa la paura afferma 12,13. Questo potrebbe in parte essere mediato da collegamenti diretti da mPFC all'amigdala che avrebbe controllato l'attività e l'uscita amigdala. Pertanto, negli ultimi anni, diversi studi hanno iniziato a ex vivo esperimenti fetta di indagare le interazioni sinaptiche tra afferenze mPFC e cellule bersaglio specifici nell'amigdala 14-17.

Durante l'apprendimento la paura, le informazioni sensoriali sulla stimoli condizionati e incondizionati raggiunge l'amigdala attraverso proiezioni specifiche regioni del talamo e corticali. Plasticità di questi ingressi ai neuroni nella parte laterale (LA) del Basolamigdala ateral (BLA) è un importante meccanismo alla base condizionamento alla paura 9,18. Una crescente evidenza suggerisce che i processi di plastica paralleli nell'amigdala coinvolgono elementi inibitori per il controllo della memoria timore 19. Un gruppo di neuroni inibitori cluster sono i mediale paracapsular intercalate cellule GABAergici (mpITCs), ma la loro connettività e precisa funzione non è completamente compresa 20-22. Qui, la mappatura del circuito optogenetic viene utilizzato per valutare la connettività afferenti ed efferenti di queste cellule e il loro impatto sui neuroni bersaglio nell'amigdala, dimostrando che mpITCs ricevono input sensoriali direttamente dalle stazioni talamici e corticali relè 23. espressione specifica del CHR mpITCs o neuroni BLA permette la mappatura delle interazioni locali, rivelando che mpITCs inibiscono, ma sono anche reciprocamente attivato, BLA neuroni principali, mettendoli in nuovi circuiti inibitori feed-forward e retroazione che controllano efficacemente l'attività BLA23.

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Protocol

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dichiarazione etica: Tutte le procedure sperimentali erano in conformità con la direttiva UE sulla uso di animali nella ricerca e sono stati approvati dalla cura degli animali locali e del Comitato Usa (Regierungspräsidium Tuebingen, stato di Baden-Württemberg, Germania) responsabile per l'Università di Tubinga.

1. procedura di iniezione stereotassica

  1. Preparare strumenti sterili (forbici, bisturi, pinze, trapano, aghi, materiale di sutura) utilizzando uno sterilizzatore. Disporre strumenti sterili e altre soluzioni necessarie e le forniture di chirurgia quali swap sterili di cotone, disinfettante, sterile tampone fosfato (PBS, pH 7,4), e H 2 O 2 su un telo chirurgico sterile.
  2. Tirare micropipette di vetro per iniezioni (Figura 1A, inserto) con 3 mm di larghezza scatola filamento su un microelettrodo orizzontale estrattore secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: Per le iniezioni in profondità, il cono elettrodo dovrebbe essere sufficientementelungo per raggiungere le ventrali maggior parte delle coordinate (circa 5 mm. per le coordinate, vedi 1.10).
  3. Premix 1 ml di soluzione di virus e 0,2 ml di 0,1% soluzione verde veloce in PBS sterile (per una migliore visibilità della soluzione nel pipetta di vetro). Riempire pipette di vetro con la miscela di soluzione di virus e verde veloce con una pipetta microlitro con una punta fine (Figura 1A, nel riquadro).
    Nota: Lavorare con ricombinanti vettori virali adeno-associati (rAAV) è considerato livello di biosicurezza 1 (BSL 1) il lavoro e deve essere eseguita in un BSL 1 laboratorio. rAAVs utilizzati in questo studio (Figura 1C) sono stati: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sierotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (sierotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1A-DIOhChR2 (H134R) -YFP (sierotipo 2/1) 23
  4. Anestetizzare un mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia (isoflurano: 3% di ossigeno per l'induzione).
    Nota: I topi utilizzati in questo studio sono stati 4 -7 settimane di vita e dei seguenti ceppi e genotipi: C57Bl6 / J wild type (esperimento nelle figure 2A e 3A-D); GAD67-GFP 24 (esperimento nelle figure 2B e 3E-H); TAC2-Cre 25 (esperimento nelle figure 2C e 3I-J).
  5. Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi. Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) per la testa rasata utilizzando tamponi di cotone.
  6. Applicare una pomata oculare per evitare l'essiccazione degli occhi durante l'anestesia. Sottocutanea iniettare mouse con analgesici (0,1 ml di 5 mg / soluzione meloxicam basata ml).
  7. Posizionare il mouse nel frame stereotassico (Figura 1A) e mantenere l'anestesia tramite una maschera di anestesia del gas (isoflurano: 2% di ossigeno per la manutenzione). Controllare la profondità dell'anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare.
    Nota: Mantenere condizioni sterili, nonché possibile durante tutta la procedura chirurgica; indossare maschera usa e getta, Go chirurgicawn, e guanti.
  8. Fare incisione cutanea sulla parte superiore della testa con le forbici. Tirare delicatamente la pelle a lato con pinze smussato, fissare con fascette per esporre superficie del cranio, e cranio pulito con H 2 O 2.
  9. Siti di iniezione segno sul cranio con una multa fori marcatori e trapano permanenti di punta per entrambi gli emisferi (Figura 1B). Coordinate per iniezioni in questo studio sono (da Bregma (mm)): mPFC: anteriore 1.9, laterale ± 0.3, 2.1 ventrale; MGM / PIN: posteriore 3.0, laterale ± 1.8, 3.8 ventrale; mpITC / BLA: posteriore 1.45, laterale ± 3,35 e 4,75 ventrale.
  10. Montare pipetta di vetro riempito sul telaio stereotassico collegato ad un dispositivo di iniezione a pressione e portare la pipetta in posizione Bregma.
  11. Rompere la punta della pipetta di vetro con pinza sottile diritto-punta. Fate questo delicatamente per evitare la generazione di aerosol di soluzione virus. Assicurarsi che la punta della pipetta è aperto mediante l'applicazione di un paio di impulsi di pressione e osservando estrusione di gocce di Virusoluzione s.
  12. Vai alle coordinate iniezione desiderati e iniettare la metà del contenuto della pipetta (~ 0,5 ml) utilizzando le seguenti impostazioni del dispositivo di iniezione a pressione: Pressione: 20 psi, durata media di impulso: 30 ms, numero medio di impulsi: 50.
  13. Lasciare pipetta in posizione per ~ 1 min prima lentamente (1 mm / min) richiamo della medesima.
    Nota: Assicurarsi che la pipetta non sia bloccato prima di ripetere procedura con lo stesso pipetta sulla emisfero. In caso di punta bloccato, pulire o rompere punta e la posizione della pipetta zero Bregma di nuovo.
  14. Pulire cranio con PBS (pH 7,4), rimuovere i morsetti, tirare delicatamente la pelle insieme, e suturare l'incisione con sutura singolo pulsante (3 - 4 nodi). Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) intorno alla ferita.
  15. Arrestare il anestesia e non lasciare incustodita del mouse fino a quando è completamente sveglio. Mantenere singola alloggiati o tornare alla compagnia di altri animali solo se pienamente recuperato. Dopo l'intervento, continuerà a monitorare lo stato di salute, e amminiter analgesico se necessario. Seguire le procedure in base alle leggi formulate dal Comitato di cura degli animali e uso locale.

2. Preparazione di acuta fette

  1. Preparare ACSF, soluzione di taglio, strumenti (forbici, bisturi, pinze, spatola, pipetta Pasteur), e blocca agar.
    Nota: 1 L di artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) è richiesto per ogni esperimento, e viene preparata sciogliendo sostanze chimiche nel doppio distillata H 2 O come precedentemente pubblicato con il 16,23. Soluzione di taglio viene preparata completandola 200 ml di ACSF con 0,87 ml di 2 M MgSO 4 soluzione madre.
  2. ACSF Ossigenare e soluzione di taglio durante l'esperimento con 95% O 2 e 5% CO 2.
  3. Profondamente anestetizzare mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia con isoflurano (3% di ossigeno). Controllare la profondità dell'anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare.
  4. Decapitare mouse usando forbici grandi e subito rilassarsitesta in soluzione di taglio ghiacciata.
  5. Aprire il cranio da una singola incisione mediana da caudale a rostrale e spingere delicatamente pezzi di cranio ai lati con pinze. Rapidamente rimuovere cervello sollevando delicatamente fuori cranio con una piccola spatola arrotondata. Tagliare il cervelletto con bisturi. Mettere cervello in soluzione di taglio ghiacciata.
  6. Per i siti di iniezione mPFC: tagliare parte anteriore del cervello (contenente mPFC) con un bisturi e mettere in soluzione di taglio ghiacciata fino affettare.
  7. Rimuovere soluzione di taglio in eccesso con carta da filtro e incollare la parte posteriore del cervello sul palco vibratome.
  8. Per fette amigdala inclinati, incollare il cervello su un taglio di blocco di agar (4%) con un angolo di 35 ° (Figura 1D, al centro). Per fette amigdala coronali, siti di iniezione MGM / PIN e siti di iniezione mPFC, incollare il cervello direttamente sul palco (Figura 1D, a destra ea sinistra). Posizionare un blocco di agar aggiuntivo dietro cervello per la stabilità, mentre affettare.
  9. Place fase in camera di taglio con soluzione di taglio ossigenato ghiacciata che viene mantenuta a 4 ° C utilizzando un gruppo di raffreddamento. Preparare fette acuta dell'amigdala (320 micron) con una lama zaffiro. Mettere le fette in una camera di interfaccia fornito con ACSF ossigenato a temperatura ambiente.
  10. Dopo la preparazione di fette amigdala acute, posizionare la camera di interfaccia a bagnomaria a 36 ° C per recuperare fette per 35 - 45 min. Successivamente, riportare la camera di interfaccia per RT. Per la registrazione da queste fette, procedere con passo 3.2.
  11. Durante l'inizio della fase di 2.10, tagliare delle fette dei siti di iniezione, come descritto in precedenza per le fette amigdala acute (passi 2,8-2,9). Il recupero di fette nel bagnomaria non è necessario qui. Facoltativo: per stimare rapidamente posizione del sito di iniezione, osservare le fette su uno stereoscopio dotato di una lampada fluorescente e appositi set di filtri.
  12. Fissare fette contenenti siti di iniezione per l'analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e submerli ging in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS soluzione O / N. Per l'analisi dei siti di iniezione procedere con passo 4.1.

3. Visualizzazione e stimolazione delle fibre Presinaptico

  1. Preparare microscopio di patch per l'attivazione optogenetic di fibre e cellule:
    1. Centrare il diodo montato emissione luminosa (LED) sul percorso di consegna luce.
    2. Misurare l'intensità della luce LED in corrispondenza del piano focale posteriore e all'uscita di ciascun obiettivo con un misuratore di potenza scelta opportuna lunghezza d'onda di 470 nm.
    3. Calcolare l'intensità della luce in mW / mm 2 e creare una curva di calibrazione (intensità del LED (%) rispetto emissione luminosa (mW / mm 2)) per ciascun obiettivo per valori misurati per 470 nm.
  2. Recuperare una fetta dell'amigdala acuta dalla camera dell'interfaccia e posto nella camera fetta montato sul microscopio verticale dotato di una lampada fluorescente. Fare attenzione a posizionare la fetta in modo tale che il SLICe superficie rivolta verso l'alto nella camera di interfaccia è anche rivolto verso l'alto nella camera di registrazione. Profumato fetta fresca, ASCF ossigenata ad una velocità di 1 - 2 ml / min ad una temperatura di ~ 31 ° C.
  3. Osservare fibre presinaptiche nella fetta utilizzando la lampada fluorescente in combinazione con appositi set di filtri per la proteina fluorescente specifica espresso. Utilizzare obiettivo 5x per ottenere una visione d'insieme (Figura 1E), e 60x oggettiva per la valutazione della densità delle fibre all'interno della zona di destinazione.
    Nota: Per GFP e YFP, utilizzare il filtro impostato "verde" (eccitazione 472/20, divisore di fascio 495, Emissione 490 LP) per mCherry utilizzare il filtro impostato "rosso" (eccitazione 560/40, divisore di fascio 585, Emissione 630/70), come specificato nella tabella materiali / attrezzature.
  4. Aprire o limitare l'apertura nel percorso ottico del microscopio come desiderato per l'esperimento (Figura 2D).
  5. Per ottenere una registrazione patch, riempire una pipetta di patch con una soluzione interna e montare iportaelettrodo n. Applicare una pressione positiva alla pipetta di patch e abbassare lentamente in primo luogo nella soluzione bagno e poi sotto il controllo visivo nella fetta utilizzando il micromanipolatore.
    1. Avvicinatevi al neurone di interessi con la pipetta di patch di lato e in alto. Rilasciare pressione positiva quando la pipetta è sulla superficie della cellula (fossetta visibile sulla superficie cellulare) ed ottenere un "gigaseal" applicando pressione negativa.
    2. Applicare in seguito alla rottura di aspirazione la patch di membrana per ottenere la registrazione a cellula intera. Successivamente, stimolare fibre marcate con LED collegato utilizzando la lunghezza d'onda appropriata per attivare ChR (470 nm) durante la registrazione risposte elettriche dalla cella.
    3. Per la stimolazione sinaptica iniziare con una bassa intensità LED e aumentare fino a raggiungere la ampiezza della corrente sinaptica desiderato. TRIGGER il LED configurando uscite digitali nel software di acquisizione dei dati di controllare i tempi e il polso lunghezza (esempi della Figura3).
      Nota: altri software e / o TTL che generano i dispositivi possono essere utilizzati per attivare LED.
  6. Ripetere stimolazione con diaframma aperto o ristretto (passo 3.4) nel percorso ottico del microscopio come desiderato per la cella successiva registrati e / o in presenza di farmaci specifici.
  7. Dopo la registrazione, correggere le fette per l'analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e sommergendo nel 4% PFA O / N.
  8. Analizzare i dati elettrofisiologici.
    Nota: Usare un software adatto per la visualizzazione dei dati spazzata registrati per ogni singola linea di stimolazione. Quando si analizzano gli effetti delle droghe, utilizzare routine di rilevamento di picco per ottenere andamento nel tempo degli effetti della droga su ampiezze delle correnti sinaptiche per tutti i singoli spazza. Determinare quando l'effetto della droga raggiunge lo stato stazionario. Per preparare le risposte medi rappresentativi per le figure, utilizzare il software per la media ≥10 singoli spazza ogni condizione sperimentale (cf figura 3B-D, FH, J pannello di destra).
    Nota: diversi pacchetti software alternativi possono essere utilizzati per l'analisi dei dati.

4. analisi post-hoc dei siti di iniezione

  1. Lavare le fette di siti di iniezione (dal punto 2.12) e la registrazione siti (se ri-immagini si desidera, dal punto 3.7) per tre volte in PBS. Questo viene fatto ripetutamente sostituendo soluzione PBS fresco su un agitatore rotante per tre volte per 10 min.
  2. Preparare soluzione al 2% agar-agar in PBS, e lasciarlo raffreddare a ~ 65 ° C. Mettere le fette appoggiati sul fondo di un piccolo piatto di 30 millimetri di diametro di Petri, incorporare fette in agar-agar e lasciate raffreddare fino solido.
  3. Incollare un blocco di agar con la fetta o fette incorporato per la fase di un vibratome e mettere in primo piano in camera di taglio con PBS.
  4. La resezione fette a 70 micron di spessore incorporato. Opzionale: Dopo resezione, fette possono essere colorati, cioè con Neurotrace rivelare citoarchitettura (Figura 3A, C), e / o by colorazione immunofluorescenza per YFP o mCherry per amplificare il segnale proveniente dalla proteina di fusione ChR.
  5. fette di montaggio su vetrini e vetrino con mezzi di montaggio. Siti di iniezione Immagine e, se desiderato, anche le porzioni di immagine contenenti fibre nelle aree di proiezione usando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a scansione laser (Figura 2A-C).

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Representative Results

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Questa sezione mostra il flusso di lavoro di un approccio optogenetic ex vivo e risultati rappresentativi di diverse strategie sperimentali per studiare le proprietà fisiologiche delle proiezioni sensoriali e modulatorie a lungo raggio a BLA e neuroni mpITC così come le proprietà di connettività locale fra mpITC e BLA.

Dopo l'iniezione stereotassica del vettore virale selezionato le coordinate desiderate nel cervello del mouse (Figura 1A-C, tempo di espressione virale 2 - 6 settimane, a seconda della sperimentazione), fettine di cervello acute dei siti di iniezione e le aree di proiezione nella amigdala sono preparati l'angolo adatto per esperimenti di patch-clamp e dalla regione del cervello iniettato per l'analisi post-hoc dei siti di iniezione (Figura 1D). Prima di iniziare le registrazioni e la stimolazione optogenetic, cellule fluorescente o pro assonaleproiezioni nella zona di destinazione (amigdala) devono essere controllate sul microscopio in posizione verticale per le registrazioni patch-clamp utilizzando la lampada fluorescente allegata (Figura 1E). Al momento l'ottenimento di una registrazione da una cellula bersaglio putativo nella regione di proiezione della fetta del patch-clamp, viene avviata stimolazione luminosa mentre il punto di tempo, intervallo e durata degli impulsi sono controllati tramite il software di patch che fa scattare il diodo ad emissione luminosa (LED). A seconda della strategia sperimentale (Figura 2A-C, destra) l'apertura nel percorso luce fluorescente o è completamente aperto o limitato (Figura 2D). Pur mantenendo la lunghezza dell'impulso costante e il più breve possibile (idealmente ≤1 msec), intensità di uscita del LED è aumentato lentamente per valutare la cui intensità è necessario per ottenere l'ampiezza desiderata della risposta sinaptica in un particolare esperimento (Figura 2E). Dopo la registrazione, fette amigdala sono post-fisso. Su resezione e facoltativositi di colorazione, di iniezione e di registrazione vengono esposte su un microscopio confocale per verificare posizione di iniezione e di escludere i dati provenienti da iniezioni fuori luogo. Immagini di siti di iniezione e le proiezioni assonale associato nell'amigdala per le tre strategie sperimentali (ingressi mPFC a BLA, ingressi talamo a mpITCs, e l'attivazione mpITC locale) sono mostrati in figura 2A-C.

La figura 3 mostra i risultati rappresentante di registrazione ottenuti da BLA neuroni principali, interneuroni BLA locali e neuroni mpITC che illustrano le proprietà di risposte luce evocata per le diverse strategie sperimentali utilizzati (Figura 3a, E, I). Per individuare i neuroni GABAergici (interneuroni locali e mpITCs) per la registrazione, topi reporter GAD67-GFP sono stati utilizzati 24. Per mPFC e le proiezioni talamo sensoriali, diversi aspetti della trasmissione sinaptica possono essere studiati. La precisione temporale accoltiva- e le proprietà cinetiche delle CHRS utilizzati in questo studio consentono stimolazione affidabile con impulsi accoppiati ad un inter-stimolo intervallo di 50 msec. Questo consente per l'analisi dei rapporti abbinato impulsi (PPR) delle correnti post-sinaptici (PSC), che può essere sia di facilitare o deprimente seconda proiezione e tipo di cellula bersaglio, e servire come indicatori di probabilità di rilascio presinaptico (Figura 3B, F, H) . Inoltre, l'analisi delle latenze sinaptiche permette per la dissezione di diversi componenti di risposta post-sinaptici.

In questo esempio, latenze più lunghe del inibitorio PSC (IPSC) contro eccitatori PSC componente (EPSC) indicano un ingresso disynaptic e monosinaptico, rispettivamente (Figura 3C). In altri casi, un'analisi più approfondita di ulteriori proprietà EPSC quali jitter risposta o il coefficiente di variazione di dimensioni della risposta può essere necessaria per trarre conclusioni sulla sua mono o disynala natura PTIC 17,23. Inoltre, l'applicazione di bloccanti farmacologici per i recettori specifici in grado di identificare la natura del PSC (ad esempio, glutammatergica EPSC e GABAergici IPSC, Figura 3C-D). Come previsto, la componente iniziale di ingresso mPFC era glutamatergica, mentre la componente in ritardo era GABAergico. Il blocco completa sia EPSC e IPSC con il glutammato bloccante dei recettori CNQX sostiene inoltre che l'IPSC è disynaptic. Per indagare la modulazione della trasmissione sinaptica a fibre optogenetically attivati, gli effetti di agonisti e antagonisti per i recettori metabotropici (qui recettori GABA B) in ampiezza e PPR possono essere valutate per valutare le influenze su siti pre e post-sinaptici. In questo esempio, la concomitante diminuzione di ampiezza con un aumento PPR è indicativo di una modulazione presinaptica di fibre di luce-attivato (3G, H). Infine, interazioni locali di cellule dell'amigdala può essere valutata, per esempio,quando i topi che esprimono Cre sotto il controllo del promotore TAC2 25 sono iniettati con una CHR esprime vettore doppio floxed virale (Figura 1C). Perché TAC2 e quindi, CHR è espresso in mpITC e l'amigdala centrale (Figura 2C), attivazione di luce è stata limitata alla mpITC chiudendo il diaframma fluorescente percorso della luce (Figura 2D). In queste condizioni, i potenziali di azione luce evocata può essere raggiunta in mpITCs infetti. Brevi latenza risposte sinaptiche inibitorie del BLA indicano la presenza di un collegamento funzionale tra inibitoria mpITC e BLA neuroni principali.

Figura 1
Figura 1. stereotassica iniezioni, Preparazione di acuta Fette cervello, e la visualizzazione di fibre presinaptici. (A, B) di iniezione stereotassica virus. A) Immagine di topo anestetizzato collocato in una cornice stereotassica con teschio esposto e lapipetta di iniezione. Nel riquadro: Zoom in immagine di pipetta di iniezione riempita con una soluzione di virus mescolato con verde veloce. Barra di scala: 3 mm. (B) Schema di un teschio mouse con posizioni contrassegnate di fori per le diverse aree di iniezione. (C) Scheme mostrando diversi costrutti virali utilizzati in questo studio. Grigio scuro: sequenza del promotore; blu: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); verde / rosso: proteina fluorescente. Tempo di espressione era 2 settimane per proiezioni amigdala locali e 4 - 6 settimane per proiezioni da mPFC e MGM / PIN. (D) Preparazione di fette di cervello acute: Schema che mostra il posizionamento di cervello di topo sul palco affettatrice per ottenere fette da diverse aree di iniezione e di proiezione. (E) Visualizzazione di fibre in fettine di cervello acuto da un mouse GAD67-GFP iniettato con virus ChR2-mCherry in MGM / PIN. Le immagini sono prese sul microscopio cerotto in posizione verticale con diversi set di filtri: espressione GAD67-GFP, medie; fibre MGM / PIN etichettato con mCHerry, a destra. barra della scala: 200 micron. mPFC, corteccia prefrontale mediale; mpITC, mediale paracapsular cellule intercalate; BLA, basolaterale; MGM Grand, mediale nucleo genicolato, parte mediale; PIN, posteriore intralaminare nucleo del talamo; LA, amigdala laterale; BA, amigdala basale; CeA, nucleo centrale dell'amigdala. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. siti di iniezione, Aree di proiezione, e optogenetic stimolazione di proiezioni assonale. (AC) immagini confocale di siti di iniezione rappresentativi e le aree di proiezione del BLA, e gli schemi delle strategie sperimentali. (A) A sinistra: mPFC sito di iniezione in un mouse C57Bl / 6 macchiata di Neurotrace. barra della scala:500 micron. Medio: le proiezioni del BLA corrispondente in una fetta amigdala inclinato. barra della scala: 200 micron. A destra: Schema di campo tutta l'illuminazione di proiezioni mPFC e la registrazione del neurone del BLA. (B) A sinistra: MGM / PIN sito di iniezione in un mouse GAD67-GFP. barra della scala: 500 micron. Medio: proiezioni corrispondenti a mpITC e LA di una fetta amigdala coronale. barra della scala: 200 micron. A destra: Schema di campo tutta l'illuminazione di proiezioni MGM / PIN e la registrazione di un neurone mpITC. (C) A sinistra: l'espressione locale di ChR2-YFP in una Neurotrace macchiato fetta amigdala di un mouse TAC2-Cre. barra della scala: 200 micron. Nel riquadro: Zoom in di mpITCs esprimono ChR2-YFP. barra della scala: 20 micron. A destra: Schema di illuminazione ristretta del cluster mpITC e la registrazione di un neurone BLA. (D) Foto di registrazione da camera durante il parto luce e l'immagine dei neuroni in fettine di cervello acuto (gruppo mpITC) in un mouse GAD67-GFP con aper aperte e ristrettetura. barra della scala: 30 micron. (E) le correnti post-sinaptiche eccitatori (EPSCs) evocati da diverse intensità LED (in alto) e la trama del potere luce contro evocati EPSC ampiezza (in basso) da un neurone rappresentante mpITC su attivazione optogenetic di fibre provenienti da MGM / PIN. Barra di scala: 100 Pa / 10 msec.
Nota:. Figura 2A viene modificato da riferimento # 16 e Figura 2C da riferimento # 23 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Risultati esemplare dal optogenetic attivazione del Long Range e proiezioni locali. (A) Schema della strategia sperimentale per (BD). (B) EPSCs rappresentativi rilevati da un neurone principale BLA eBLA interneurone dopo stimolazione optogenetic paired-pulse (50 msec inter-stimolo-intervallo) di fibre da mPFC suscitando accoppiato facilitazione del polso e la depressione polso abbinato, rispettivamente. Barra di scala: 100 Pa / 25 msec. (C) l'attivazione optogenetic di fibre provenienti da mPFC suscita feed-forward inibizione. Sinistra: Rappresentante EPSC (a -70 mV) e la corrente post-sinaptica inibitoria (IPSC, a 0 mV) in un neurone principale BLA. L'IPSC ha una più lunga latenza sinaptica rispetto al EPSC. Barre di scala: 200 Pa / 10 msec e 200 Pa / 2 msec. A destra: luce evocata bifasico EPSC / sequenza IPSC (a -50 mV) viene bloccata da antagonista AMPA / kainato CNQX (10 micron), che supporta ulteriormente la natura disynaptic del IPSC. Barra di scala: 50 pA / 5 msec. (D) Effetti del successivo blocco di EPSC / sequenza IPSC (a -50 mV) da parte del Cl - antagonista Picrotoxin (PTX, 100 micron) e PTX + CNQX. L'IPSC è bloccato da PTX e per il restante EPSC da CNQX. Barre di scala: 50 Pa / 5 msec. (E) Schema della strategia sperimentale per (FH). F) EPSCs rappresentativi rilevati da un mpITC e un neurone principale BLA su optogenetic stimolazione accoppiato impulsi di fibre provenienti da MGM / PIN. Barra di scala: 50 pA / 20 msec. (G) EPSCs in un altro neurone mpITC sono bloccati dal bloccante dei canali del sodio Tetrodotoxina (TTX, 0.5 micron), che indica che essi dipendono dalle attività dei canali del sodio. Barra di scala: 50 pA / 20 msec. (H) gli ingressi talamiche ai neuroni mpITC sono modulati da recettori presinaptici GABA B. EPSCs sotto condizione di controllo, riduzione EPSC ampiezza e concomitante aumento del rapporto di impulso accoppiato durante l'applicazione del agonisti GABA B Baclofen (2 mM), e recupero di sia in ampiezza iniziale razione impulsi accoppiato upon co-applicazione del GABA B antagonista CGP55845 (10 pM). Questi cambiamenti sono indicativi di una modulazione presinaptica da recettori GABA B. bar Scala: 50 pA / 20 msec. (I) Schema della strategia sperimentale (J). (J) Light-evocati potenziali d'azione registrati da un ChR2-YFP che esprimono mpITC neurone. IPSCs luce evocata registrati da un neurone principale BLA a differenti potenziali di partecipazione (-90, -70, -50, -20, e 0 mV) invertire tutto il potenziale di equilibrio calcolato per Cl -. Barre di scala: 20 mV / 100 msec e 10 pA / 10 msec. Nota:. Figura 3B-D viene modificato da Riferimento # 16, e la Figura 3H e J di riferimento # 23 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Questo protocollo descrive un metodo per ex vivo indagini optogenetic dei circuiti neurali e la connettività locale che può essere facilmente implementato sulla maggior parte, se non tutti, in posizione verticale fetta configurazioni di registrazione patch-clamp dotandoli di un ~ 470 LED al porto luce epifluorescenza nm. Uno dei principali vantaggi della stimolazione optogenetic di proiezioni assonale in fette è che permette l'attivazione e ricerca di proprietà di connessioni non accessibili con stimolazione elettrica convenzionale specifico, poiché i tratti di fibre corrispondenti non erano noti, non chiaramente definiti, o meno conservate in una sola fetta cervello. Come esempio relativo tasto per circuiti paura, è illustrato come questo può essere applicato per analizzare le proprietà di input mPFC all'amigdala.

Anche nei casi in cui la stimolazione del tratto di fibra elettrica è stato ampiamente utilizzato in studi precedenti, questi tratti spesso portano le fibre provenienti da diverse regioni d'origine. Ad esempio, nei circuiti collegati temere apprendimento, proiezioni da diversi nuclei talamici o regioni corticali sensoriali corrono mescolati tra gli capsula interna ed esterna, rispettivamente. Il vantaggio della stimolazione optogenetic è che permette l'attivazione selettiva di un sottoinsieme di fibre provenienti da una regione definita. Questo è illustrato per gli ingressi del talamo specifici da PIN e MGM alle cellule intercalate e le cellule principali amigdala laterale. Inoltre, i problemi derivanti con stimolazione elettrica, cioè, l'attivazione di altre fibre di passaggio o cellule in prossimità dell'elettrodo stimolante, che possono rendere le connessioni locali nella zona di destinazione possono essere superati. Tuttavia, mentre la stimolazione optogenetic è altrettanto rapida di stimolazione elettrica, ci possono essere limitazioni per quanto riguarda la frequenza di stimolazione che può essere applicata in modo attendibile. Questo dipende inattivazione e deinactivation cinetiche e della variante di ChR che viene utilizzato, 4 nonché expression livelli e metodi, e metodi di stimolazione luminosa 26.

Quando si utilizza un LED montato alla porta fluorescenza per stimolazione luminosa, tipicamente l'intero campo di vista di un dato obiettivo è illuminato, con conseguente attivazione di tutte le fibre o le celle nel campo e all'interno di una certa profondità. Questo può solo parzialmente essere limitato a una regione più piccola o un insieme di cellule marcate (in questo esempio, il mpITC) utilizzando un'apertura nel percorso luce fluorescente 23,27. Con LED, potere della luce non è un problema, come i LED blu ad alta potenza sono ora disponibili da molti produttori. Tuttavia, gli spettri di emissione hanno valori massimi mezzo a tutta larghezza di diverse decine di nanometri. Pertanto, i LED pongono limitazioni quando uno stimolo spazialmente precisi per la mappatura subcellulare di connettività e / o la stimolazione monocromatica sono desiderati. Entrambi possono essere migliorata utilizzando laser blu come sorgenti luminose, di solito in combinazione con configurazioni più sofisticate che consentono di catramegeting e / o la scansione del fascio in piccole aree e profondità dei tessuti definiti (ad esempio, vedere 28).

Con l'ex vivo approccio optogenetic qui descritto, diverse proprietà di trasmissione sinaptica possono essere studiati. Per valutare monosynapticity della componente primi sinaptica risposta, un'analisi approfondita delle latenze e la loro jitter, così come risposta di ampiezza varianza deve essere utilizzato su un campione rappresentativo di neuroni registrati (ad esempio, vedere 16,17,23). Nei casi in cui l'attivazione di attività di rete può svolgere un ruolo, il metodo di scelta è per isolare il componente monosinaptico diretta mediante l'applicazione combinata di tetrodotossina (TTX) per bloccare potenziali d'azione in combinazione con il K + antagonista 4-aminopiridina (4- AP) per prevenire ripolarizzazione 14,28,29. I recettori che mediano componenti mono e disynaptic di ingressi possono essere identificati utilizzando bloccanti farmacologici. Furthermore, è possibile studiare aspetti della modulazione presinaptica di ingressi optogenetically attivati ​​nell'amigdala 23,30. Un potenziale avvertimento è che ChR2 abbia qualche permeabilità calcio 1,4 e la sua attivazione in fibre presinaptici e terminali è stato suggerito di alterare probabilità di rilascio da vari meccanismi 26,31. Tuttavia, diversi studi, tra cui esempi mostrati espressione ChR2 qui impiegato con successo per identificare input-e indirizzare le differenze specifiche per cellulari in rapporti abbinato impulsi nell'amigdala e in altre aree del cervello 16,23,26,32 e la modulazione inoltre dimostrato di probabilità di rilascio per attivazione di vie di segnalazione specifici terminali presinaptici che non è stato preclusi da ChR attivazione 23,30. Un ulteriore supporto deriva da dati in ippocampo e cervelletto, dimostrando che con il metodo di espressione ChR appropriato e tecnica di stimolazione luminosa, aspetti fisiologici, tra cui l'efficacia di rilascio e di fedeltà otrasmissione sinaptica f può essere studiata in modo affidabile 26. Infine, l'attivazione della fibra optogenetic è stato anche utilizzato con successo per applicare protocolli di stimolazione che inducono sinaptica 31,33,34 plasticità.

Diversi aspetti sono fondamentali per il successo di questo metodo. Uno è la precisione del targeting stereotassica di vettori virali. Pertanto, è utile per valutare rapidamente posizione del sito di iniezione prima di ottenere registrazioni e quindi eseguire un'analisi più dettagliata post-hoc. Oltre alla precisione spaziale, la vitalità dei neuroni nel sito di iniezione è un fattore determinante per un esperimento di successo e dipende dalla tecnica di iniezione. L'opzione presentato, utilizzando elettrodi in vetro lunghi e sottili-conico, serve a questo scopo ben sia superficiale e aree cerebrali profonde, ma può avere lo svantaggio che la conicità è molto flessibile. Un'alternativa è quella di utilizzare siringhe microlitro specialmente sviluppati per la consegna stereotassica in neuroscienze (neuro-syringes) con aghi più rigide che possono dispensare piccoli volumi. La specificità di colpire ChR-espressione di tipi cellulari definiti e regioni può essere ulteriormente migliorata mediante espressione condizionale 7, per esempio con il Cre sistema come illustrato per le cellule dell'amigdala intercalato. Ciò consente anche l'uso di promotori forti in vettori virali Cre-dipendenti.

Un altro aspetto critico è la scelta del vettore virale. Per esprimere ChR, virus ricombinanti adeno-associato (rAAVs) sono stati utilizzati, che hanno il vantaggio di essere un livello di biosicurezza 1 vettori rispetto ad altri sistemi virali popolari. rAAVs sono state utilizzate per qualche tempo e hanno generalmente vettori sicuri e affidabili con buona tropismo neurali e poco o nessun potenziale immunogenico, ma il loro volume di imballaggio è limitato (circa. 4-5 kb) 35. In questi specifici esperimenti, i sierotipi 2/9 e 2/1 sono stati utilizzati per l'espressione ubiquitaria e condizionale, rispettivamente. In accordo con la letteratura, lasierotipi SE trasdurre cellule nella regione di destinazione, ma non sembrano essere ripreso da assoni a retrogrado cellule etichetta, a differenza di sierotipi 2/5 e 2/6 36,37. Tuttavia, gli esperimenti iniziali dovrebbero escludere che ci siano corpi cellulari CHR-etichettati in aree sporgenti al sito di iniezione, che è particolarmente importante quando si studiano le regioni del cervello collegate reciprocamente quali mPFC e l'amigdala. Diversi studi recenti hanno confrontato l'efficacia di sierotipi rAAV in diverse aree cerebrali in ratti e topi 36,38,39. Un tema che emerge è che i sierotipi più recenti (ad esempio, 2/1, 2/8 e 2/9) sono generalmente più efficiente rispetto al 2/2 sierotipo originale. Anche di nota, espressione rAAV-mediata di ChR, a differenza di altri metodi, non ha causato effetti negativi sulla cellule che esprimono o assoni etichettati 40. Il tempo necessario per ottenere espressione attivazione fibra efficace ex vivo sembra dipendere dalla distanza di proiezione studiato. Qui e coerente con la litetura, per l'etichettatura e l'attivazione di collegamenti a lungo raggio nel topo (mPFC e input sensoriali), un tempo espressione di 4 - 8 settimane è necessario, mentre per studiare la connettività locale nell'amigdala, tempi espressione più brevi di 2 - 3 settimane sono sufficienti 14-17,23,30,34.

Per la registrazione delle risposte optogenetically-indotte nella zona bersaglio, due fattori sono fondamentali: 1) la fetta cerebrale acuto deve essere di buona qualità e 2) una notevole quantità di fibre marcate vitali richiede di essere conservato. La qualità di fette può essere migliorata usando lame zaffiro affettare. Conservazione degli assoni e quindi, le dimensioni e la stabilità delle risposte luce può essere migliorata tagliando fette ad un certo angolo come illustrato per proiezioni mPFC-amigdala (Figura 1D e 2A) 16,34. Tuttavia, questo dipende fortemente l'orientamento afferents della regione di destinazione e dovrà essere determinata per ciascuna combinazione di proiezione e target regione. A questo proposito, analisi post-hoc di proiezioni della regione bersaglio può essere utile. Per migliorare la rilevazione di fibre e sbiancamento aggirare che possono essersi verificati durante la stimolazione fetta, immunocolorazione contro il tag fluorescenti sulla proteina di fusione ChR può essere impiegato.

In generale, questo metodo di mappatura circuito optogenetic recentemente non solo stata applicata a temere circuiti, ma molti altri sistemi nel cervello. In futuro, il targeting di subnuclei e specifici tipi cellulari mediante la combinazione di una serie crescente di linee di topi geneticamente modificati e vettori virali condizionali fornirà una comprensione ancora più dettagliata della diversità funzionali proprietà sinaptiche dei circuiti locali ea lungo termine specifici. Inoltre, immunomarcatura post-hoc di ChR fluorescenti-taggato in connessioni funzionali indagati potrebbe essere combinato con l'analisi ultrastrutturale (vale a dire, con metodi microscopio elettronico) per fornire approfondimenti di mor precisaproprietà morfologiche delle sinapsi in precedenza.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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<em>Ex Vivo</em> optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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