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Neuroscience

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

abordagens optogenética são amplamente utilizados para manipular a atividade neural e avaliar as consequências para o funcionamento do cérebro. Aqui, uma técnica que é descrita por expressão in vivo do activador channelrodopsina óptico, permite a análise ex vivo de propriedades sinápticos de longo alcance específico e conexões neurais locais em circuitos relacionados com o medo.

Abstract

optogenetic abordagens são agora amplamente utilizados para estudar a função de populações neurais e circuitos através da combinação de expressão de proteínas alvo activado por luz e subsequente manipulação da actividade neuronal pela luz. Channelrhodopsins (CHRS) são-canais de catiões de luz fechado e quando fundida com uma proteína fluorescente sua expressão permite a visualização e a activação simultânea de tipos específicos de células e as suas projecções axonais em áreas definidas do cérebro. Através de injecção estereotáxica de vectores virais, as proteínas de fusão CHR pode ser expresso constitutivamente ou condicionalmente em células específicas de uma região do cérebro definido, e as suas projecções axonais pode subsequentemente ser estudados anatomicamente e funcionalmente através da activação optogenetic ex vivo em fatias de cérebro. Isto é de particular importância quando se pretende entender propriedades sinápticas de ligações que não podem ser abordados com as abordagens de estimulação elétrica convencional, ou na identificação de romance affealuguel e conectividade eferente que anteriormente foi mal compreendida. Aqui, alguns exemplos ilustram como esta técnica pode ser aplicada para investigar estas perguntas para elucidar circuitos relacionados com o medo na amígdala. A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais. Muitas linhas de evidência sugerem que o córtex pré-frontal medial (mPFC) participa em diferentes aspectos da aquisição medo e extinção, mas a sua conectividade preciso com a amígdala está apenas começando a ser entendida. Em primeiro lugar, é mostrado como a activação ex vivo optogenetic pode ser usado para estudar os aspectos da comunicação sináptica entre os aferentes mPFC e células-alvo na amígdala basolateral (BLA). Além disso, está ilustrado que como esta abordagem ex vivo optogenetic podem ser aplicadas para avaliar novos padrões de conectividade utilizando um grupo de neurónios GABAérgicos na amígdala, o cluster paracapsular célula intercalada (mpITC), como um exemplo.

Introduction

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ferramentas precisas para visualização e ativação simultânea de conexões específicas entre áreas do cérebro e tipos específicos de neurônios estão se tornando mais importante para entender as conectividade funcional subjacentes função cerebral e doença estados saudáveis. Idealmente, isso implica investigação fisiológica das propriedades sinápticos precisos com que identificaram os neurônios se comunicam. Isto é particularmente verdadeiro para as ligações entre as áreas do cérebro que não podem ser conservados em uma única fatia cerebral aguda. No passado, isto foi largamente conseguido em experiências separadas. Por um lado, marcadores neurais injectados in vivo, foram empregues combinada com luz ou subsequente análise microscópica de electrões de parceiros de pré- e pós-sinápticos. Por outro lado, quando a partir de feixes de fibras da região de origem são preservados e acessíveis na preparação fatia, estimulação eléctrica tem sido utilizada para avaliar os mecanismos de comunicação com células sinápticas na região alvo.

Com o advento de Optogenetics, a expressão específica de canais de catiões de luz fechado, tais como Channelrhodopsins (CHRS) fundida com proteínas fluorescentes, permite agora que a activação de neurónios e as suas trajectórias de axonais embora permitindo a sua visualização e post-hoc de análise anatómica 1- 4. Porque axônios ChR expressam pode ser estimulada mesmo quando separado do somata pai 5, é possível, em fatias de cérebro para: 1) avaliar entradas de regiões do cérebro que não eram acessíveis com estimulação elétrica convencional, porque tratos de fibras não são separáveis ​​ou a trajetória específica não é conhecida; 2) inequivocamente identificar a região de origem para entradas específicas que foram postuladas, mas incompletamente compreendida; e 3) investigar a conectividade funcional entre tipos celulares definidos, tanto a nível local e nas projeções de longo alcance. Devido a um certo número de vantagens, este mapeamento optogenetic de circuitos em fatias de cérebro tornou-se largamenteLY utilizado nos últimos anos e uma variedade de vectores virais para expressão de chrs marcadas com fluorescência estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Algumas das principais vantagens da ativação optogenetic sobre estimulação elétrica convencional não são danos ao tecido devido à colocação de eletrodos de estimulação, a especificidade da estimulação da fibra, porque a estimulação elétrica pode também recrutar fibras de passagem ou outras células vizinhas, e um estímulo igualmente rápida e temporalmente preciso. Além disso, a injecção estereotáxica de vectores virais pode ser facilmente orientada para áreas específicas do cérebro 6 e expressão específica condicional ou tipo de célula pode ser conseguido usando expressão de Cre-dependente e / ou promotores específicos 7. Aqui, esta técnica é aplicada para o mapeamento de longo alcance e circuitos locais no sistema de medo.

A amígdala é uma região-chave para a aquisição e expressão do medo, e armazenamento de medo e memórias emocionais 8,9. Além froestou a amígdala, o córtex pré-frontal medial (mPFC) e hipocampo (HC), estruturas que são mutuamente ligadas à amígdala, estão implicadas nos aspectos de aquisição, consolidação e recuperação de medo e extinção memórias 10,11. Actividade em subdivisões do mPFC parece desempenhar um papel duplo no controle de alta e baixa medo afirma 12,13. Isso pode em parte ser mediada por conexões diretas de mPFC para a amígdala que controlaria atividade da amígdala e saída. Por isso, nos últimos anos, vários estudos começaram em ex vivo experimentos fatia para investigar as interações sinápticas entre aferentes mPFC e células-alvo específicos na amígdala 14-17.

Durante a aprendizagem medo, a informação sensorial sobre os estímulos condicionado e incondicionado atinge a amígdala através de projeções de regiões do tálamo e córtex específicos. Plasticidade destes insumos aos neurônios na parte lateral (LA) da basolamígdala ateral (BLA) é um importante mecanismo subjacente medo condicionado 9,18. Evidências crescentes sugerem que os processos de plástico paralelas na amígdala envolvem elementos inibitórios para controlar memória do medo 19. Um grupo de neurônios inibitórios em cluster são os GABAérgicos paracapsular intercalados células mediais (mpITCs), mas a sua conectividade e função precisa não é completamente compreendida 20-22. Aqui, o mapeamento do circuito optogenética é utilizado para avaliar aferentes e eferentes conectividade dessas células e seu impacto sobre os neurônios-alvo na amígdala, demonstrando que mpITCs recebe entrada sensorial direta de estações retransmissoras talâmicos e corticais 23. expressão específica do ChR em mpITCs ou neurônios BLA permite o mapeamento das interações locais, revelando que mpITCs inibir, mas também são mutuamente ativado por, BLA principais neurônios, colocando-os em circuitos inibitórios feed-forward e feedback novos que controlam eficazmente a atividade BLA23.

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Protocol

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declaração de ética: Todos os procedimentos experimentais foram de acordo com a directiva da UE sobre a utilização de animais em pesquisa e foram aprovados pelo Animal Care local e Comitê de Uso (Regierungspräsidium Tuebingen, estado de Baden-Württemberg, Alemanha), responsável pela Universidade de Tübingen.

1. Processo de injeção estereotáxica

  1. Preparar as ferramentas estéreis (tesouras, bisturis, pinças, perfuração, agulhas, material de sutura), utilizando um esterilizador. Providenciar ferramentas estéreis e soluções necessárias outras fontes e cirurgia, tais como permutas estéreis algodão, desinfectante, estéril tamponada de fosfato salino (PBS, pH 7,4) e H 2 O 2 em uma cobertura cirúrgica estéril.
  2. Puxar as micropipetas de vidro para injectáveis ​​(Figura 1A, inserir) utilizando a 3 mm de largura de filamentos caixa em um microeléctrodo horizontal puxador de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Para injecções profundas, a conicidade eléctrodo deve ser suficientementetempo para atingir as ventrais maioria das coordenadas (aproximadamente 5 mm;. para coordenadas, ver 1.10).
  3. Pré-mistura 1 ml de solução de vírus e 0,2 ul de solução verde rápido 0,1% em PBS estéril (para melhor visibilidade da solução na pipeta de vidro). Preencha pipetas de vidro com uma mistura de solução de vírus e verde rápido usando uma pipeta de microlitro com uma ponta fina (Figura 1A, inserir).
    Nota: Trabalhar com adeno-associados vectores virais recombinantes (rAAV) é considerado um nível de segurança biológica (BSL 1) de trabalho e tem de ser realizado num laboratório BSL 1. rAAVs utilizados neste estudo (Figura 1C) foram: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sorotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-Cagh-ChR2 (H134R) -mCherry (sorotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotipo 2/1) 23
  4. Anestesiar um rato usando um pequeno aparelho de anestesia de animais (isoflurano: 3% em oxigênio para a indução).
    Nota: Os ratos utilizados neste estudo foram 4 -7 semanas de idade e uma das seguintes estirpes e genótipos: C57BL6 / J tipo selvagem (experiência nas Figuras 2A e 3A-D); GAD67 GFP-24 (experiência nas Figuras 2B e 3E-H); TAC2-Cre 25 (experimento nas Figuras 2C e 3I-J).
  5. Raspar a cabeça entre as orelhas e os olhos. Aplicar desinfectante (providone de iodo-base) para a cabeça raspada usando cotonetes.
  6. Aplique uma pomada para evitar a secagem dos olhos durante a anestesia. Injectar subcutaneamente rato com analgésico (, 0,1 ml de 5 mg de solução de base de meloxicam / ml).
  7. Coloque rato na moldura estereotáxica (Figura 1A) e manter a anestesia através de uma máscara de anestesia de gás (isoflurano: 2% em oxigénio para manutenção). Verifique a profundidade da anestesia usando reflexo de retirada do membro antes de continuar.
    Nota: Manter condições estéreis, bem como possível durante todo o procedimento cirúrgico; usar máscara descartável, go cirúrgicaWN e luvas.
  8. Faça incisão na pele em cima da cabeça com uma tesoura. Com cuidado, puxe a pele para o lado usando uma pinça sem corte, fixe com grampos para expor a superfície do crânio, e crânio limpo com H 2 O 2.
  9. Locais de injecção marca no crânio usando uma multa buracos ponta do marcador e perfuração permanentes para ambos os hemisférios (Figura 1B). Coordenadas para injeções neste estudo são (da bregma (mm)): mPFC: anterior 1.9, lateral ± 0,3, ventral 2.1; MGM / PIN: posterior 3.0, lateral ± 1,8, ventral 3,8; mpITC / BLA: 1,45 posterior, lateral ± 3,35, 4,75 e ventral.
  10. Montar pipeta de vidro cheio sobre a armação estereotáxica ligado a um dispositivo de injecção e a pressão para trazer a posição da pipeta bregma.
  11. Quebre a ponta da pipeta de vidro usando pinça fina reta de ponta. Faça isso com cuidado para evitar a geração de aerossol de solução de vírus. Certifique-se a ponta da pipeta é aberta através da aplicação de alguns pulsos de pressão e observando extrusão de gotas de virusolução s.
  12. Ir para as coordenadas de injeção desejados e injetar metade do conteúdo da pipeta (~ 0,5 mL) utilizando as seguintes definições no dispositivo de injeção de pressão: Pressão: 20 psi, duração média de pulso: 30 ms, o número médio de pulsos: 50.
  13. Deixar no lugar pipeta para ~ 1 min antes de se lentamente (1 mm / min) retirá-los.
    Nota: Certifique-se de pipeta não está bloqueada antes de repetir o procedimento com o mesmo pipeta sobre outro hemisfério. Em caso de ponta bloqueado, limpa ou quebrar ponta ea posição da pipeta zero no bregma novamente.
  14. crânio limpo com PBS (pH 7,4), remova grampos, puxe a pele juntos, e suturar a incisão com sutura botão individual (3 - 4 nós). Aplicar desinfectante (providona-iodo com base) em torno da ferida.
  15. Pare a anestesia e não deixar o mouse sem vigilância até que esteja totalmente acordado. Mantenha única alojados ou retornar à companhia de outros animais apenas quando estiver totalmente recuperado. No pós-operatório, continuar a monitorizar o estado de saúde, e adminisTer analgésico, se necessário. Siga os procedimentos de acordo com as regras apresentadas pelo Comitê Animal Care e Use o local.

2. Preparação de fatias aguda

  1. Prepare ACSF, solução de corte, ferramentas (tesouras, bisturi, pinças, espátula, Pasteur pipeta) e blocos de agar.
    Nota: 1 L de fluido cérebro-espinal artificial (ACSF) é necessária por experiência, e é preparado por dissolução de produtos químicos em bidestilada H2O como publicado anteriormente 16,23. Solução de corte é preparado suplementando 200 ml de ACSF com 0,87 ml de uma solução M de estoque 2 MgSO4.
  2. ACSF oxigenado e solução de corte ao longo da experiência, com 95% de O2 e 5% de CO 2.
  3. Profundamente anestesiar rato usando um pequeno aparelho de anestesia animal utilizando isoflurano (3% em oxigênio). Verifique a profundidade da anestesia usando reflexo de retirada do membro antes de continuar.
  4. Decapitar rato usando tesouras grandes e chill imediatamentecabeça na solução de corte gelada.
  5. Abrir crânio por uma única incisão na linha média do caudal a rostral e empurre pedaços de crânio para os lados usando uma pinça. Rapidamente remover cérebro, levantando-o suavemente para fora do crânio usando uma pequena espátula arredondado. Cortar cerebelo com bisturi. Coloque cerebral em solução de corte gelada.
  6. Para locais de injecção mPFC: cortar parte anterior do cérebro (contendo mPFC) utilizando um bisturi e colocados em solução de corte gelada até cortar.
  7. Remover solução de corte o excesso com um papel de filtro e cola na parte posterior do cérebro para o palco vibratome.
  8. Para fatias amígdala inclinadas, cole o cérebro em um corte do bloco de ágar (4%) em um ângulo de 35 ° (Figura 1D, no meio). Para fatias amígdala coronais, locais de injecção MGM / PIN e locais de injecção mPFC, cole o cérebro diretamente no palco (Figura 1D, esquerda e direita). Coloque um bloco de agar adicional por trás do cérebro para a estabilidade, enquanto cortando.
  9. Placfase E em corte da câmara de corte com uma solução oxigenado gelado que é mantida a 4 ° C utilizando uma unidade de arrefecimento. Prepare fatias agudas da amígdala (320 microns) usando uma lâmina de safira. Coloque fatias numa câmara de interface fornecido com ACSF oxigenado à TA.
  10. Após a preparação de fatias agudas amígdala, colocar a câmara de interface num banho de água a 36 ° C para recuperar fatias por 35 - 45 min. Subsequentemente, voltar a câmara de interface para a TA. Para gravar a partir dessas fatias, prossiga com o passo 3.2.
  11. Durante o início da etapa 2.10, cortar fatias dos locais de injecção como descrito antes para fatias amígdala agudas (passos 2,8-2,9). Recuperação de fatias no banho de água não é necessária aqui. Opcional: Para estimar rapidamente local no local da injecção, observe fatias em um estereoscópio equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros adequados.
  12. Fix fatias contendo locais de injecção para análise post-hoc por intercalando-os entre dois papéis de filtro e submerging-los em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS solução O / N. Para a análise de locais de injecção continue com o passo 4.1.

3. Visualização e estimulação de fibras pré-sinápticos

  1. Prepare microscópio patch para activação optogenetic de fibras e células:
    1. Centralize o diodo emissor de montada (LED) para a via de entrega de luz.
    2. Medir a intensidade da luz de LED no plano focal posterior e na saída de cada objectivo com um medidor de potência escolher o comprimento de onda de 470 nm adequado.
    3. Calcule a intensidade da luz em mW / mm 2 e criar uma curva de calibração (intensidade LED (%) versus saída de luz (mW / mm 2)) para cada objetivo para valores medidos para 470 nm de comprimento.
  2. Recuperar uma fatia amígdala aguda a partir da câmara de interface e o local na câmara de fatia montado no microscópio vertical equipado com uma lâmpada fluorescente. Tome cuidado para posicionar a fatia de modo que a slice a superfície voltada para cima na câmara de interface também é voltada para cima na câmara de gravação. Perfundir fatia com ASCF fresco, oxigenado a uma taxa de 1-2 ml / min a uma temperatura de ~ 31 ° C.
  3. Observe fibras pré-sinápticos na fatia usando a lâmpada fluorescente em combinação com filtros adequados para a proteína fluorescente específico expresso. Use objectivo 5x obter uma visão geral (Figura 1E), e 60x objectivo para a avaliação de densidade de fibras dentro da área alvo.
    Nota: Para GFP e YFP, o uso de filtro definir "verde" (Excitação 472/20, Refletor 495, Emissão 490 LP) para mCherry usar filtro definido "vermelho" (Excitação 560/40, Refletor 585, Emissão 630/70), conforme especificado na tabela de materiais / equipamentos.
  4. Abrir ou restringir a abertura no percurso de luz do microscópio como desejado para a experiência (Figura 2D).
  5. Para obter uma gravação de remendo, preencher uma pipeta de patch com uma solução interna e montar isuporte do eletrodo n. Aplique uma pressão positiva para a pipeta patch e abaixe lentamente pela primeira vez na solução do banho e depois sob controle visual na fatia usando o micromanipulador.
    1. Aproxime-se do neurônio de interesse com a pipeta patch a partir do lado e superior. Libertar a pressão positiva quando a pipeta está na superfície da célula (covinha visível na superfície da célula) e obter um "gigaseal" por aplicação de pressão negativa.
    2. Aplicar mais sucção à ruptura do remendo de membrana para se obter a gravação de célula inteira. Posteriormente, estimular fibras marcadas com o LED ligado usando o comprimento de onda apropriado para ativar Chr (470 nm) durante a gravação de respostas elétricas da célula.
    3. Para a estimulação sináptica começar com uma intensidade do LED de baixo e aumentar até a amplitude da corrente sináptica desejada seja atingida. Acionar o LED, configurando saídas digitais no software de aquisição de dados para controlar o comprimento de tempo e pulso (exemplos na Figura3).
      Nota: Outras software e / ou TTL de geração de dispositivos podem ser usados ​​para acionar LED.
  6. Repita estimulação com abertura aberta ou restrita (passo 3.4) na via de luz do microscópio como desejado para a célula seguinte gravada e / ou na presença de fármacos específicos.
  7. Após a gravação, corrigir fatias para análise post-hoc por intercalando-os entre dois papéis de filtro e submergindo-os em 4% PFA O / N.
  8. Analisar dados eletrofisiológicos.
    Nota: Use o software adequado para visualizar os dados de varredura registrados para cada estímulo indivíduo offline. Quando a análise dos efeitos de drogas, utilizar rotinas de detecção de pico para obter a evolução no tempo do efeito do fármaco em amplitudes de corrente sinápticas para todos os varrimentos individuais. Determinar quando o efeito da droga atinge o estado estacionário. Para preparar respostas médios representativos de figuras, usar o software para médias ≥10 varreduras individuais por condição experimental (cf Figura 3B-D, FH, J painel da direita).
    Nota: várias alternativas pacotes de software pode ser utilizado para a análise de dados.

4. análise post-hoc de locais de injecção

  1. Lavar as fatias de locais de injecção (do passo 2.12) e registo dos sítios (se re-imagem é desejada, a partir do passo 3,7) três vezes em PBS. Isto é feito através da substituição de uma solução várias vezes com PBS fresco num agitador rotativo três vezes durante 10 min.
  2. Preparar a solução de agar-agar a 2% em PBS, e deixe esfriar para ~ 65 ° C. Coloque as fatias planas na parte inferior de um pequeno prato de 30 milímetros de diâmetro petri, incorporar fatias em ágar-ágar e deixe esfriar até sólido.
  3. Cole um bloco de agar com uma fatia ou fatias incorporado ao palco de um vibratome e coloque estágio no corte de câmara com PBS.
  4. Ressecção fatias a 70 mm de espessura incorporado. Opcional: Após a ressecção, fatias podem ser coradas, ou seja, com Neurotrace para revelar citoarquitetura (Figura 3A, C), e / ou bimunofluorescência y para YFP ou mCherry para aumentar o sinal da proteína de fusão Chr.
  5. fatias de montagem em lâminas e lamela com meios de montagem. Locais de injecção imagem e, se desejado, também as fatias de imagem contendo fibras nas áreas de projecção utilizando um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal de laser de varrimento (Figura 2A-C).

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Representative Results

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Esta seção mostra o fluxo de trabalho de uma abordagem ex vivo optogenética e resultados representativos de diferentes estratégias experimentais para investigar as propriedades fisiológicas das projeções sensoriais e moduladores de longo alcance para BLA e neurônios mpITC bem como propriedades de conectividade local entre mpITC e BLA.

Após a injecção estereotáxica de o vector viral seleccionado nas coordenadas desejadas no cérebro do rato (Figura 1A-C, o tempo de expressão viral 2 - 6 semanas, dependendo da experiência), fatias cerebrais agudas dos locais de injecção e áreas de projecção na amígdala são preparadas no ângulo apropriado para as experiências de patch-clamp e da região cerebral injectado para análise post-hoc de locais de injecção (Figura 1D). Antes de iniciar a estimulação e gravações optogenetic, as células marcadas com fluorescência ou Pro axonalinjeções na área alvo (amígdala) deve ser verificado no microscópio vertical para gravações de patch-clamp usando a lâmpada fluorescente ligada (Figura 1E). Após a obtenção de um registo de uma célula alvo putativo na região de projecção da fatia de patch-clamp, a estimulação luminosa é iniciada enquanto ponto de tempo, o intervalo, e duração dos impulsos são controladas através do software patch que provoca o díodo emissor de luz (LED). Dependendo da estratégia experimental (Figura 2A-C, à direita) a abertura no percurso de luz fluorescente ou é completamente aberta ou limitado (Figura 2D). Embora mantendo o comprimento do impulso constante e tão curto quanto possível (idealmente ≤1 mseg), a intensidade do LED de saída é aumentada lentamente para avaliar a intensidade que é necessário para alcançar a desejada amplitude da resposta sináptica numa determinada experiência (Figura 2E). Após a gravação, fatias amígdala são pós-fixadas. Após a ressecção e opcionallocais de coloração, de injeção e de gravação são gravadas em um microscópio confocal para verificar a localização de injecção e excluir os dados de injecções mal posicionadas. Imagens de locais de injecção e as projeções axonal associados na amígdala para as três estratégias experimentais (entradas mPFC para BLA, entradas do tálamo para mpITCs e ativação mpITC local) são mostrados na Figura 2A-C.

A Figura 3 mostra resultados representativos obtidos a partir de gravação BLA principais neurónios, BLA interneurónios locais e neurónios mpITC ilustrando as propriedades de respostas evocadas luz para as diferentes estratégias experimentais utilizadas (Figura 3A, E, I). Para direcionar neurônios GABAérgicos (interneurônios locais e mpITCs) para gravação, os ratos repórter GAD67-GFP foram usados ​​24. Para CPFm e projecções talâmicos sensoriais, pode ser estudados vários aspectos da transmissão sináptica. A precisão temporal da corrente alternadavação e as propriedades cinéticas das chrs utilizados neste estudo permitir a estimulação de confiança com pulsos emparelhados a um inter-estímulos-intervalo de 50 mseg. Isto permite a análise de rácios por pulsos emparelhados (PPR) de correntes pós-sináptico (PSCs), que pode ser facilitar ou deprimente dependendo projecção e tipo de célula alvo, e servem como indicadores de probabilidade de libertação pré-sináptica (Figura 3B, F, H) . Além disso, a análise das latências sinápticas permite a dissecção de diferentes componentes da resposta pós-sináptica.

Neste exemplo, maior tempo de latência do CPS inibidora (IPSC) versus PSC excitatório componente (EPSC) indicam uma entrada disynaptic e monossináptico, respectivamente (Figura 3C). Em outros casos, uma análise mais aprofundada das propriedades adicionais EPSC tais como jitter resposta ou o coeficiente de variação do tamanho da resposta pode ser necessária para tirar conclusões sobre o seu mono ou disynanatureza ptic 17,23. Além disso, a aplicação de bloqueadores farmacológicos para os receptores específicos pode identificar a natureza das unidades (ou seja, EPSC glutamatérgica e gabaérgica IPSC, Figura 3C-D). Como esperado, a componente precoce de entrada CPFm foi glutamatérgico, enquanto que o componente final foi GABAérgica. O bloco completa de ambos EPSC e IPSC com o bloqueador do receptor de glutamato CNQX suporta ainda que a IPSC é disynaptic. Para investigar a modulação da transmissão sináptica em fibras optogenetically activados, os efeitos de agonistas e antagonistas para receptores metabotrópicos (receptores aqui GABAB) em amplitude e PPR podem ser avaliados para avaliar as influências sobre locais pré e pós-sinápticos. Neste exemplo, a diminuição concomitante da amplitude com um aumento da PPR é indicativo de uma modulação pré-sináptica de fibras activado pela luz (3G, H). Finalmente, as interacções locais de células na amígdala pode ser avaliada, por exemplo,quando os ratos que expressam CRE sob o controlo do promotor TAC2 25 são injectados com um vector viral que expressa ChR duplo floxed (Figura 1C). Porque TAC2 e, assim, a Chr é expresso em mpITC e amígdala central (Figura 2C), a activação da luz estava restrita à mpITC fechando a abertura de percurso de luz fluorescente (Figura 2D). Sob estas condições, os potenciais de acção evocado-luz pode ser atingida em mpITCs infectados. Curtas respostas sinápticas inibidoras latência no BLA indicar a presença de uma ligação funcional entre o inibidor e mpITC BLA principais neurónios.

figura 1
Figura 1. estereotáxicas Injeções Preparação de aguda fatias do cérebro do e visualização de fibras pré-sinápticos. (A, B) de injecção de vírus estereotáxica. A) Imagem de rato anestesiado colocado em um quadro estereotáxico com crânio exposta eapipeta de injecção. Detalhe: Zoom no quadro de pipeta de injeção preenchido com solução de vírus misturado com verde rápido. Barra de escala: 3 mm. (B) Esquema de um crânio mouse com posições marcadas de furos para diferentes áreas de injeção. (C) Esquema mostrando diferentes construções virais utilizados neste estudo. cinza escuro: sequência do promotor; azul: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); verde / vermelho: proteína fluorescente. Período de expressão foi de 2 semanas para as projeções da amígdala locais e 4 - 6 semanas para projeções de mPFC e MGM / PIN. (D) Preparação de fatias cerebrais agudas: Esquema mostrando a colocação do cérebro do rato no palco slicer para a obtenção de fatias de diferentes áreas de injeção e de projeção. (E) Visualização de fibras em fatias cerebrais agudos de um rato GAD67-GFP injetado com o vírus ChR2-mCherry no MGM / PIN. As fotografias são tiradas no microscópio remendo na posição vertical com diferentes conjuntos de filtros: Expressão GAD67-GFP, médio; fibras MGM / PIN marcado com mCherry, certo. Barra de escala: 200? m. mPFC, córtex pré-frontal medial; mpITC, células intercaladas paracapsular medial; BLA, a amígdala basolateral; MGM, núcleo geniculado medial, parte medial; PIN, posterior intralaminar núcleo talâmico; LA, a amígdala lateral; BA, a amígdala basal; CeA, núcleo central da amígdala. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Locais de Injeção, Áreas de projeção e optogenética Estimulação das Projeções axonais. (AC) imagens Confocal de locais de injecção representativos e áreas de projeção do BLA, e esquemas de estratégias experimentais. (A) Esquerda: local da injecção mPFC em um rato C57BL / 6 coradas com Neurotrace. Barra de escala:500 um. Médio: projeções no BLA correspondente em uma fatia amígdala inclinada. Barra de escala: 200? m. Direita: Esquema de toda iluminação de campo de projeções mPFC e gravação do neurônio na BLA. (B) À esquerda: no local da injecção MGM / PIN em um rato GAD67-GFP. Barra de escala: 500? m. Médio: projeções correspondente em mpITC e LA de uma fatia amígdala coronal. Barra de escala: 200? m. Direita: Esquema de toda iluminação de campo de projeções MGM / PIN e gravação de um neurônio mpITC. (C) Esquerda: Expressão local de ChR2-YFP em uma Neurotrace manchado fatia amígdala de um rato TAC2-Cre. Barra de escala: 200? m. Detalhe: Zoom in de mpITCs expressando ChR2-YFP. Barra de escala: 20 ^ m. Direita: Esquema da iluminação restrita do cluster mpITC ea gravação de um neurônio BLA. (D) Fotos de gravação da câmara durante o parto luz e imagem de neurônios em fatias de cérebro aguda (grupo mpITC) em um rato GAD67-GFP com aper aberto e restritotura. Barra de escala: 30 ^ m. (E) correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) evocadas por diferentes intensidades de LED (superior) e lote de potência de luz contra evocado EPSC amplitude (inferior) a partir de um neurônio mpITC representante na ativação optogenetic de fibras da MGM / PIN. Barra de escala: 100 PA / 10 ms.
Nota:. Figura 2A é modificada a partir de referência # 16 e Figura 2C da referência # 23 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Exemplos de resultados de optogenética A ativação de longo alcance e as projeções locais. (A) Esquema da estratégia experimental para (BD). (B) EPSCS representante inscrito a partir de um neurônio principais BLA eBLA interneurônio sobre optogenetic A estimulação por pulsos emparelhados (50 ms inter-estímulo-intervalo) de fibras de mPFC provocando emparelhado facilitação de pulso e depressão pulso emparelhado, respectivamente. Barra de escala: 100 PA / 25 ms. (C) a ativação optogenética de fibras de mPFC provoca inibição feed-forward. Esquerda: Representante EPSC (-70 mV) e corrente de pós-sináptico inibitório (IPSC, a 0 mV) em um principal neurônio BLA. A IPSC tem uma latência sináptica mais em comparação com o EPSC. Barras de escala: 200 PA / 10 ms e 200 PA / 2 ms. Direita: Luz evocado sequência bifásica EPSC / IPSC (a -50 mV) é bloqueada pelo antagonista do AMPA / cainato CNQX (10 uM), apoiando ainda mais a natureza do disynaptic IPSC. Barra de escala: 50 pA / 5 ms. (D) efeitos do bloco subsequente de EPSC sequência / IPSC (a -50 mV) pelo Cl - bloqueador do canal de Picrotoxina (PTX, 100? M) e PTX + CNQX. A IPSC é bloqueada por PTX eo EPSC restante, CNQX. Barras de escala: 50 PA / 5 ms. (E) Esquema da estratégia experimental para (FH). F) EPSCS representante inscrito a partir de um mpITC e um dos principais neurônio BLA sobre optogenetic A estimulação por pulsos emparelhados de fibras da MGM / PIN. Barra de escala: 50 PA / 20 ms. (G) em EPSCS outro neurónio mpITC são bloqueados pelo bloqueador de canal de sódio A tetrodotoxina (TTX, 0,5 ^ M), indicando que são dependentes da actividade do canal de sódio. Barra de escala: 50 PA / 20 ms. (H) entradas talâmicos para neurônios mpITC são modulados por receptores pré-sinápticos GABA B. EPSCS sob condição de controlo, redução de EPSC amplitude e concomitante aumento na razão de pulso emparelhado durante a aplicação do agonista de GABA B baclofeno (2 | iM), e a recuperação de amplitude e inicial ração de pulso emparelhado com a co-aplicação do CGP55845 antagonista de GABA B (10 uM). Estas alterações são indicativos de uma modulação pré-sináptica por receptores GABAB. Barra de escala: 50 PA / 20 ms. (I) Esquema da estratégia experimental para (J). (J) Light-potenciais evocados de ação gravadas a partir de um ChR2-YFP expressando mpITC neurônio. IPSCs de luz evocada gravadas a partir de um principal neurônio BLA em diferentes potenciais de retenção (-90, -70, -50, -20 e 0 mV) reverter em torno do potencial de equilíbrio calculada para Cl -. Barras de escala: 20 mV / 100 ms e 10 pA / 10 ms. Nota:. Figura 3B-D é modificado a partir de Referência nº 16, e na Figura 3H e J da referência # 23 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Este protocolo descreve um método para ex vivo investigação optogenetic dos circuitos neurais e conectividade local que pode ser facilmente implementados na maioria, se não todos, verticais fatia de gravação de patch-clamp setups, equipando-os com um ~ 470 LED no porto luz epifluorescência nm. Uma grande vantagem da estimulação optogenetic de projecções axonais em fatias é que ele permite a activação e a investigação das propriedades de ligações que não eram acessíveis com estimulação eléctrica convencional específica, porque os feixes de fibras correspondentes não eram conhecidos, não claramente definido, ou não conservados em uma única fatia do cérebro. Como exemplo chave relevante para os circuitos de medo, é ilustrado como este pode ser aplicado para dissecar propriedades de entradas mPFC para a amígdala.

Mesmo nos casos em que a estimulação elétrica de fibra trato tem sido amplamente utilizados em estudos anteriores, esses tratos muitas vezes carregam fibras de diferentes regiões de origem. Por exemplo, em circuitos relacionados com o medo de aprendizagem, as projecções de diferentes núcleos talâmicos ou corticais sensoriais regiões funcionamento misturados através das cápsulas internas e externas, respectivamente. A vantagem da estimulação optogenetic é que ele permite a activação selectiva de um subconjunto de fibras a partir de uma região definida. Isto é ilustrado por insumos talâmicas específicas de PIN e MGM para células intercaladas e células principais amígdala lateral. Além disso, os problemas que surgem com a estimulação eléctrica, isto é, a activação de outras fibras da passagem ou as células na vizinhança do eléctrodo estimulante que podem fazer ligações locais na zona alvo podem ser superados. No entanto, enquanto a estimulação optogenética é igualmente rápida como a estimulação elétrica, pode haver limitações quanto à frequência de estimulação que pode ser aplicada de forma confiável. Isto depende de inactivação e deinactivation cinética e da variante de RHC que está a ser utilizado, 4, bem como expression níveis e métodos, e métodos de estimulação de luz 26.

Quando se utiliza um diodo emissor de luz montado na porta de fluorescência para a estimulação pela luz, normalmente todo o campo de visão de um dado objectivo é iluminado, resultando na activação de todas as fibras ou células no campo e dentro de uma determinada profundidade. Isto pode ser apenas parcialmente restringida a uma região mais pequena ou conjunto de células marcadas (neste exemplo, o mpITC) utilizando uma abertura no caminho da luz fluorescente 23,27. Com LEDs, potência de luz não é um problema, como de alta potência LEDs azuis estão agora disponíveis a partir de muitos fabricantes. No entanto, os espectros de emissão têm valores metade do valor máximo de largura total de várias dezenas de nanómetros. Portanto, LEDs apresentam limitações quando um estímulo espacialmente preciso para mapeamento subcelular de conectividade e / ou estimulação monocromática são desejados. Tanto pode ser melhorada pela utilização de laser azul como fontes de luz, normalmente em combinação com configurações mais sofisticadas que permitem alcatrãogeting e / ou varredura do feixe em pequenas áreas e profundidades de tecido definidos (por exemplo, ver 28).

Com a abordagem ex vivo optogenetic descrito aqui, várias propriedades de transmissão sináptica pode ser estudada. Para avaliar monosynapticity do componente início sináptica resposta, análise minuciosa das latências e sua instabilidade, bem como variância amplitude da resposta deve ser usado em uma amostra representativa de neurônios registrados (por exemplo, ver 16,17,23). Nos casos em que a activação da actividade de rede podem desempenhar um papel, o método de escolha é isolar o componente monossináptico directa através da aplicação de uma combinação de tetrodotoxina (TTX) para bloquear os potenciais de acção em combinação com o bloqueador do canal de K + 4-aminopiridina (4- AP) para evitar a repolarização 14,28,29. Os receptores que medeiam componentes mono- e disynaptic de entradas podem ser identificados utilizando bloqueadores farmacológicas. Furthermore, é possível estudar os aspectos de modulação pré-sináptica de entradas optogenetically ativados na amígdala 23,30. Uma advertência potencial é que tem algum ChR2 1,4 permeabilidade ao cálcio e a sua activação em fibras pré-sinápticas e terminais tem sido sugerido para alterar a probabilidade de libertação por vários mecanismos 26,31. No entanto, vários estudos, incluindo exemplos mostrados expressão ChR2 aqui empregada com sucesso para identificar input- e alvo diferenças específicas de células em proporções por pulsos emparelhados na amígdala e outras áreas do cérebro 16,23,26,32 e modulação, além disso, demonstrou de probabilidade de libertação pela activação de vias de sinalização específicas em terminais pré-sinápticos que não foi impossibilitada pela activação ChR 23,30. Um apoio adicional vem de dados no hipocampo e cerebelo, mostrando que com o método de expressão ChR adequado e técnica de estimulação de luz, aspectos fisiológicos incluindo a eficácia de liberação e fidelidade of transmissão sináptica podem ser estudados de forma fiável 26. Finalmente, a activação de fibra optogenetic também tem sido utilizada com sucesso para aplicar protocolos de estimulação que induzem 31,33,34 plasticidade sináptica.

Vários aspectos são críticos para o sucesso deste método. Uma delas é a precisão da segmentação estereotáxica de vetores virais. Portanto, é útil para uma avaliação rápida localização local da injeção antes de obter gravações e, em seguida, realizar uma análise mais detalhada post-hoc. Além de precisão espacial, a viabilidade dos neurónios no local da injecção é um factor determinante para uma experiência de sucesso e depende da técnica de injecção. A opção apresentada, utilizando eléctrodos de vidro longas e finas-cónica, serve para este fim bem para ambas as áreas do cérebro mais profundas e superficiais, mas podem ter a desvantagem de que o cone é muito flexível. Uma alternativa é usar seringas de microlitros especialmente desenvolvidos para entrega estereotáxica em neurociência (neuro-syringes) com agulhas mais rígidas que pode dispensar pequenos volumes. A especificidade de direccionamento CHR-expressão de tipos de células e regiões definidas podem ser ainda melhorada usando expressão condicional 7, por exemplo com o sistema Cre-como ilustrado por células intercaladas amígdala. Isto também permite a utilização de promotores fortes em vectores virais Cre-dependentes.

Outro aspecto crítico é a escolha do vector viral. Para expressar CDH, vírus adeno-associados recombinantes (rAAVs) foram usadas que tem a vantagem de ser um nível de segurança biológica 1 vectores em comparação com outros sistemas virais populares. rAAVs ter sido utilizado durante algum tempo e são geralmente vectores seguros e fiáveis ​​com boa tropismo neural e pouco ou nenhum potencial imunogénico, mas o seu volume de embalagem é limitada (aprox. 4-5 kb) 35. Nestas experiências específicas, os sorotipos 09/02 e 01/02 foram utilizados para expressão ubíqua e condicional, respectivamente. De acordo com a literatura, osorotipos si transdução de células na região do alvo, mas não parecem estar ocupado por axônios para retrogradamente células rótulo, ao contrário sorotipos 2/5 e 2/6 36,37. No entanto, as experiências iniciais é de excluir que existam corpos celulares CHR-rotulados em áreas salientes no local da injecção, que é especialmente importante quando se estuda regiões do cérebro ligadas reciprocamente como mPFC e amígdala. Vários estudos recentes em comparação eficácia dos sorotipos rAAV em diferentes áreas do cérebro em ratos e ratinhos 36,38,39. Um tema emergente é que os serotipos mais recentes (por exemplo, 2/1, 2/8 e 2/9) são geralmente mais eficientes do que o 02/02 serotipo originais. Também digno de nota, a expressão de rAAV mediada por CDH, em contraste com outros métodos, não têm efeitos nocivos sobre as células ou axónios marcados 40 expressando. A expressão tempo necessário para atingir a activação ex vivo eficaz fibra parece depender da distância da saliência estudada. Aqui e consistente com o Literatura, para a rotulagem ea ativação de conexões de longo alcance no ratinho (mPFC e entradas sensoriais), um tempo de expressão de 4 - 8 semanas é necessário, enquanto que para estudar a conectividade local na amígdala, os tempos de expressão mais curtas de 2 - 3 semanas são suficiente 14-17,23,30,34.

Para a gravação de respostas optogenetically-induzidos na área alvo, dois fatores são fundamentais: 1) a fatia cerebral aguda precisa ser de boa qualidade e 2) uma quantidade substancial de fibras marcadas viáveis ​​precisa ser preservado. A qualidade das fatias pode ser melhorada pela utilização de lâminas de safira para fatiar. Preservação dos axónios e, assim, o tamanho e a estabilidade das respostas de luz pode ser melhorada através do corte fatias para um certo ângulo, como ilustrado por projecções CPFm-amígdala (Figura 1D e 2A) 16,34. No entanto, isto depende fortemente da orientação dos aferentes na região alvo e terá de ser determinada para cada combinação de área de projecção e TArget região. A este respeito, a análise post-hoc de projecções na região alvo pode ser útil. Para melhorar a detecção de fibras e de branqueamento contornar que pode ter ocorrido durante a estimulação fatia, imunocoloração contra o marcador fluorescente na proteína de fusão pode ser empregue ChR.

Em geral, este método de mapeamento circuito optogenetic tem recentemente sido aplicado não só a temer circuitos, mas muitos outros sistemas no cérebro. No futuro, a segmentação de subnúcleos e tipos celulares específicos através da combinação de uma crescente variedade de linhas de ratinhos geneticamente modificadas e vectores virais condicionais irá proporcionar uma compreensão mais detalhada da diversidade de propriedades funcionais de circuitos sinápticos alcance local e de longa específicos. Além disso, imunomarcação post-hoc de ChR fluorescente-marcadas em ligações funcionais investigados poderiam ser combinadas com a análise ultra-estrutural (ou seja, utilização de métodos de microscopia eletrônica) para fornecer insights sobre mor precisaPropriedades fológico de sinapses previamente ativados.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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<em>Ex Vivo</em> optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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