Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Оптогенетика подходы широко используются для манипулирования нейронной активности и оценивать последствия для функционирования мозга. Здесь методика изложена , что при экспрессии в естественных условиях оптического активатора Channelrhodopsin, позволяет экс естественных условиях анализа синаптических свойств конкретного дальнего радиуса действия и локальных нейронных связей в цепях страха , связанных с .

Abstract

Оптогенетика подходы в настоящее время широко используется для изучения функции нейронных популяций и схем путем объединения целевых экспрессии легких активированных белков и последующей манипуляции нейронной активности светом. Channelrhodopsins () являются ХР света селекцией катионообменной каналы и когда слитые с флуоресцентным белком их выражение позволяет для визуализации и одновременной активации специфических типов клеток и их аксонов проекции в определенных областях мозга. С помощью стереотаксической инъекции вирусных векторов, CHR слитые белки могут быть конститутивной или условно выражается в специфических клетках определенной области мозга, и их аксонов проекции могут впоследствии быть изучены анатомически и функционально с помощью экс естественных условиях оптогенетика активации в срезах мозга. Это особенно важно, когда с целью понять синаптические свойства соединений, которые не могут быть решены с помощью обычных электрических подходов стимуляции, или при определении нового AFFEаренда и подключение эфферентной, который ранее был мало изучен. Вот, несколько примеров показывают, как этот метод может быть применен для исследования этих вопросов к выяснению цепи страха, связанных в миндалине. Миндалина является ключевым регионом для приобретения и выражения страха и хранения страха и эмоциональных воспоминаний. Многие линии доказательств указывают на то, что медиальная префронтальная кора головного мозга (MPFC) участвует в различных аспектах приобретения страха и исчезновения, но его точное подключение с миндалине только начинает понимать. Во- первых, показано , как экс виво оптогенетика активации может быть использован для изучения аспектов синаптической связи между MPFC афферентов и клеток - мишеней в базолатеральной миндалине (BLA). Кроме того, показано , как это экс виво оптогенетика подход может быть применен для оценки новых моделей подключения , с помощью группы ГАМКергических нейронов в миндалине, то paracapsular интеркалированная кластера клеток (mpITC), в качестве примера.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Точные инструменты для визуализации и одновременной активации специфических связей между областями мозга и определенными типами нейронов становятся все более важными для понимания функциональной связности основные функции мозга здоровых и болезненных состояний. В идеале, это влечет за собой физиологическое исследование точных синаптических свойств, с которыми выявлены нейроны общаются. Это особенно верно в отношении связей между областей мозга, которые не могут храниться в одном срезе острого мозга. В прошлом это было в значительной степени достигнуто в отдельных экспериментах. С одной стороны, нейронные трассеры впрыскивается в естественных условиях, были использованы в сочетании с последующим светом или электронно - микроскопического анализа пред- и постсинаптического партнеров. С другой стороны, когда волоконно-трактов из региона происхождения сохраняются и доступны при приготовлении слайсов, электростимуляция использовалась для оценки синаптические механизмы связи с клетками в целевом регионе,

С появлением оптогенетика, целевое выражение легких селекцией катион-каналы, такие как Channelrhodopsins (ХР) , слитого с флуоресцентными белками, теперь позволяет активацию нейронов и их аксонов траекторий позволяя при этом для их визуализации и ретроспективном анатомического анализа 1- 4. Поскольку CHR-экспрессирующие аксоны могут стимулироваться даже когда отделено от родительского somata 5, можно в мозговых срезах: 1) оценить исходные данные из областей мозга , которые не были доступны с обычной электрической стимуляции, так как волокна тракты не являются разделяемыми или конкретная траектория не известно; 2) однозначно определить область происхождения для конкретных входов, которые были постулируется, но не вполне понятных; и 3) исследовать функциональную связь между определенными типами клеток, как локально, так и в долгосрочных прогнозов. Из-за ряда преимуществ, это оптогенетика отображение схем в срезах мозга становится широкимLY используется в последние годы, и различные вирусные векторы для экспрессии флуоресцентно-меченый ХР легко доступны от коммерческих поставщиков. Некоторые ключевые преимущества оптогенетика активации по сравнению с обычными электрической стимуляции не являются повреждения ткани вследствие размещения стимуляции электродов, специфичность стимуляции волокон, потому что электрическая стимуляция может также набрать волокон прохода или других соседних ячеек, и столь же быстрым и во времени точной стимуляции. Кроме того, стереотаксической инъекции вирусных векторов легко могут быть направлены на конкретные области мозга 6 и условной или камерного типа конкретное выражение может быть достигнуто с помощью Cre-зависимую экспрессию и / или специфические промоторы 7. Здесь этот метод применяется для отображения дальнего радиуса действия и локальных схем в системе страха.

Миндалина является ключевым регионом для приобретения и выражения страха и хранения страха и эмоциональных воспоминаний 8,9. Помимо сюдам миндалины, медиальная префронтальная кора головного мозга (MPFC) и гиппокамп (HC), структуры, которые взаимно соединены с миндалине, участвуют в аспектах приобретения, консолидации и поиска страха и исчезновения воспоминаний 10,11. Деятельность в подразделениях MPFC - видимому, играет двойную роль в регулировании как высокого и низкого страха заявляет 12,13. Это может быть частично опосредовано прямыми связями с MPFC к миндалине, которая будет контролировать активность миндалины и выход. Таким образом, в последние годы, некоторые исследования начались в естественных условиях экспериментов бывших срезов для исследования синаптических взаимодействий между MPFC афферентов и специфических клеток - мишеней в миндалине 14-17.

Во время обучения страха, сенсорная информация об условных и безусловных раздражителей достигает миндалины с помощью проекций из специфических таламических и корковых областей. Пластичность этих входов нейронов в боковой части (LA) от basolateral миндалине (БЛА) является важным механизмом , лежащим страх кондиционирования 9,18. Увеличение данные свидетельствуют о том, что параллельные пластические процессы в миндалине включают ингибирующие элементы для управления памятью страха 19. Группа кластерной тормозных нейронов являются ГАМКергических медиальной paracapsular интеркалированного клетки (mpITCs), но их точная связь и функция не вполне понятно , 20-22. Здесь отображение оптогенетика схема используется для оценки афферентные и эфферентные соединения этих клеток и их воздействие на целевые нейроны в мозжечковой миндалине, демонстрируя , что mpITCs получают прямой сенсорный вход от таламуса и коркового ретрансляционных станций 23. Конкретное выражение ПГО в mpITCs или Bla нейронов позволяет отображение локальных взаимодействий, показывая, что mpITCs подавляют, но и взаимно активируются, Bla главных нейронов, помещая их в новые прямой подачи и обратной ингибирующих цепей, которые эффективно контролируют активность BLA23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Заявление по этике: Все экспериментальные процедуры были в соответствии с директивой ЕС по использованию животных в научных исследованиях и были одобрены местным уходу и использованию животных комитета (Regierungspräsidium Тюбинген, земля Баден-Вюртемберг, Германия), ответственного за Университета Тюбингена.

1. Стереотактическая Процедура Инъекции

  1. Подготовьте стерильные инструменты (ножницы, скальпели, зажимы, сверла, иглы, шовный материал), используя стерилизатор. Устройте стерильные инструменты и другие необходимые решения и хирургические принадлежности , такие как стерильные ватные свопы, дезинфицирующим, стерильного фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4) и H 2 O 2 на стерильной хирургической простыне.
  2. Потянуть стеклянные микропипетки для инъекций (рис 1А, вставка) с использованием широкой коробки нити 3 мм на горизонтальную микроэлектродом съемника в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Для получения глубоких инъекций, электрод конусности должен быть достаточнодолго, чтобы достичь вентральной большинство координат (около 5 мм;. для координат, см 1.10).
  3. Премикс 1 мкл раствора вируса и 0,2 мкл 0,1% быстрого зеленого раствора в стерильной PBS (для лучшей видимости раствора в стеклянной пипетки). Заполните стеклянные пипетки смесью раствора вируса и быстрого зеленого с использованием микролитре пипетки с тонким кончиком (рис 1А, вставка).
    Примечание: Работа с рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (Раав) считается уровень биологической безопасности 1 (BSL 1) работа и должна выполняться в BSL 1 лаборатории. rAAVs , используемые в данном исследовании (рис 1C) были: 1) MPFC: Раав-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (серотип 2/9) 16; 2) МГМ / PIN: Раав-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (серотип 2/9) 23; 3) mpITC / БЛА: Раав-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (серотип 2/1) 23
  4. Обезболить мышь, используя небольшое животное анестезии машина (Isoflurane: 3% кислорода для индукции).
    Примечание: Мыши, используемые в данном исследовании, были 4 -7 недель , и из следующих штаммов и генотипов: C57BL6 / J дикого типа (эксперимент на фиг.2А и 3А-D); GAD67-GFP , 24 (эксперимент на фигурах 2В и 3E-H); Tac2-Cre 25 (эксперимент на фигурах 2С и 3i-J).
  5. Бритье головы между ушами и глазами. Применение дезинфицирующего средства (провидон-йода на основе) к бритой голове с помощью ватного тампона.
  6. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание глаза во время анестезии. Подкожно вводят мышь с обезболивающим (мелоксикам основе, 0,1 мл 5 мг / мл раствора).
  7. Поместите мышь в стереотаксической рамы (Рисунок 1А) и поддержания анестезии с помощью противогаза анестезии (Isoflurane: 2% в кислороде для технического обслуживания). Проверьте анестезии глубину, используя снятие конечности рефлекс перед продолжением.
    Примечание: Поддержание стерильных условий, а также возможно в течение всей хирургической процедуры; носить одноразовые маски для лица, хирургические идутWn, и перчатки.
  8. Сделайте разрез кожи на верхней части головы с помощью ножниц. Осторожно потяните кожу в сторону , используя тупой пинцет, зафиксировать с помощью зажимов подвергать поверхность черепа, а чистый череп с H 2 O 2.
  9. Места инъекций Все на черепе с помощью тонкого наконечника перманентным маркером и просверлить отверстия для обоих полушарий (рис. 1В) Координаты для инъекций в данном исследовании (от брегмы (мм)): MPFC: 1.9 передней, боковой ± 0,3, вентральный 2,1; МГМ / PIN: задний 3,0, боковая ± 1,8, вентральный 3,8; mpITC / БЛА: задний 1,45, боковая ± 3,35 и 4,75 вентральной.
  10. Установите заполненный стеклянной пипетки на стереотаксической рамы, соединенного с инъекционной давления устройства и довести пипетку в положение темени.
  11. Оторвать кончик стеклянной пипетки с использованием тонких прямой кончик пинцетом. Делайте это осторожно, чтобы предотвратить аэрозольный поколение раствора вируса. Убедитесь, что наконечник пипетки открыт путем применения несколько импульсов давления и наблюдая за выдавливание капли Вируs решение.
  12. Перейти к требуемым координатам впрыска и ввести половину содержимого пипетки (~ 0,5 мкл), используя следующие настройки на устройстве впрыска под давлением: Давление: 20 фунтов на квадратный дюйм средняя длительность импульса: 30 мс, среднее число импульсов: 50.
  13. Оставьте пипеткой на месте в течение ~ 1 мин, прежде чем медленно (1 мм / мин) его втягивания.
    Примечание: Убедитесь, что пипетка не блокируется перед повторением процедуры с той же пипеткой на другом полушарии. В случае заблокированного наконечника, очистите или прекращаться наконечник и нулевое положение пипетки на брегмы снова.
  14. Чистый череп с PBS (рН 7,4), снимите зажимы, осторожно потяните кожу вместе, и сшивать разрез с индивидуальной кнопкой шовного (3 - 4 узла). Применение дезинфицирующего средства (провидон-йод), основанный вокруг раны.
  15. Прекратить анестезию и не оставляйте без присмотра мышь, пока не будет полностью просыпаются. Держите одного Размещенный или вернуться к компании других животных только тогда, когда он полностью выздоровел. В послеоперационном периоде продолжают следить за состоянием здоровья, и Adminisтер анальгезирующим действием, если это необходимо. Следуйте процедурам в соответствии с правилами, выдвинутый местным уходу и использованию животных комитетом.

2. Приготовление острого Ломтики

  1. Подготовка ACSF, резка решение, инструменты (ножницы, скальпель, пинцет, шпатель, пипетки Пастера), и агар блоков.
    Примечание: 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) требуется в эксперименте, и получают путем растворения химических веществ в бидистиллированной H 2 O , как ранее опубликованных 16,23. Режущий раствор готовят путем дополнения 200 мл ACSF с 0,87 мл 2 М MgSO 4 маточного раствора.
  2. Кислородсодержащих ACSF и режущая раствор в течение всего эксперимента с 95% O 2 и 5% CO 2.
  3. Глубоко обезболить мышь с помощью небольшого животного анестезии машину, используя изофлуран (3% кислорода). Проверьте анестезии глубину, используя снятие конечности рефлекс перед продолжением.
  4. Обезглавьте мышь, используя большие ножницы и сразу же охладитьголова в ледяном растворе резки.
  5. Открытый череп одного срединный разрез от хвостового к ростральной и осторожно надавите куски черепа к сторонам с помощью щипцов. Быстро удалить мозг, осторожно подняв его из черепа, используя небольшое округлое шпателя. Отрежьте мозжечка с скальпелем. Поместите мозг в ледяном растворе резки.
  6. Для участков инъекции MPFC: отрезать переднюю часть мозга (содержащего MPFC), используя скальпель и поставить в ледяном растворе резки до нарезки.
  7. Удалите излишки раствора для резки с фильтровальной бумагой и клеем заднюю часть головного мозга на сцену vibratome.
  8. Для наклонных срезов миндалины, клей мозг на агаровой блок (4%) срезают на 35 ° угол (рис 1D, средний). Для корональных миндалины ломтиками, инъекции сайтов МГМ / ПИН и инъекции сайтов MPFC, клей мозг непосредственно на стадии (Рисунок 1D, слева и справа). Поместите дополнительный агар блок позади мозга для обеспечения стабильности в то время как нарезка.
  9. Placе этап в режущую камеру с охлажденным льдом насыщенным кислородом раствором резания, который поддерживают при температуре 4 ° С с помощью охлаждающего устройства. Приготовьте острые кусочки миндалине (320 мкм) с использованием сапфирового лезвия. Поместите ломтики в интерфейс камеры, поставляемой с окисленной ACSF при комнатной температуре.
  10. После приготовления острых миндалины ломтиками, поместить интерфейс камеры в водяной бане при 36 ° C, чтобы восстановить ломтики в течение 35 - 45 мин. Затем верните интерфейс камеры до комнатной температуры. Для записи с этих срезов, переходите к шагу 3.2.
  11. Во время начала шага 2.10, вырезать кусочки участков инъекции, как описано выше для острых миндалины срезов (шаги 2.8 - 2.9). Восстановление срезов в водяную не требуется здесь. Необязательно: Для быстрого определения местоположения в месте инъекции, наблюдать срезы на стереоскоп, снабженный флуоресцентной лампой и соответствующих наборов фильтров.
  12. Fix ломтики, содержащие инъекции сайты для ретроспективном анализа путем прослаивая их между двумя фильтровальной бумаги и submerрежимных их в 4% параформальдегида (PFA) в PBS раствор O / N. Для анализа участков инъекции переходите к шагу 4.1.

3. Визуализация и стимуляция пресинаптических волокон

  1. Подготовьте патч-микроскоп для оптогенетика активации волокон и клеток:
    1. Сосредоточьте установлен светоизлучающий диод (LED) на световом пути доставки.
    2. Измерение интенсивности света СИД на задней фокальной плоскости и на выходе каждой из задач с помощью измерителя мощности Выбор соответствующей длиной волны 470 нм.
    3. Рассчитать интенсивность света в мВт / мм 2 и создать калибровочной кривой (LED интенсивность (%) в зависимости от светового потока (мВт / мм 2)) для каждой цели для значений , измеренных для 470 нм.
  2. Получить острый миндалины кусочек из интерфейса камеры и места в срезе камере, установленной на прямой микроскоп, снабженный флуоресцентной лампой. Позаботьтесь, чтобы поместить кусочек такой, что SLICе поверхность была обращена вверх в интерфейсе камеры также была обращена вверх в записи камеры. Заливать ломтик свежей, насыщенной кислородом ASCF со скоростью 1 - 2 мл / мин при температуре ~ 31 ° C.
  3. Обратите внимание пресинаптических волокон в срезе, используя люминесцентную лампу в комбинации с соответствующими наборами фильтров для конкретного флуоресцентного белка, экспрессируемого. Использование 5x цели для получения обзора (рис 1E) и 60x цели для оценки плотности волокон в пределах целевой области.
    Примечание: Для получения GFP и YFP, использование фильтра устанавливается "зеленый" (возбуждение 472/20, светоделитель 495, эмиссия 490 LP) для mCherry использовать набор фильтров "красный" (возбуждение 560/40, светоделитель 585, эмиссия 630/70), как указано в таблице материалов / оборудования.
  4. Открыть или ограничить отверстие в световом пути микроскопа , как требуется для эксперимента (рис 2D).
  5. Чтобы получить запись патч, заполнить патч пипетку с внутренним решением и смонтировать ян держатель электрода. Применить положительное давление на патч пипетки и медленно опустите его сначала в раствор ванны, а затем под визуальным контролем в срезе с помощью микроманипулятора.
    1. Подход нейрон интересов с исправлениями пипеткой со стороны и сверху. Освободить положительное давление, когда пипетка находится на поверхности клетки (впадина видимой на поверхности клетки) и получить "gigaseal" с помощью отрицательного давления.
    2. Применить дальнейшее всасывание к разрыву мембраны патч, чтобы получить запись целой клетки. В дальнейшем, стимулировать меченые волокна с подключенным светодиодом с использованием соответствующей длины волны для активации Chr (470 нм) во время записи электрических ответов из клетки.
    3. Для синаптической стимуляции начать с низкой интенсивностью светодиода и увеличить до желаемого синаптической амплитуда тока не будет достигнута. Спусковой крючок LED путем настройки цифровых выходов в программном обеспечении сбора данных для управления временем и длительность импульса (примеры на рисунке3).
      Примечание: другое программное обеспечение и / или TTL-генерирующие устройства могут быть использованы для запуска LED.
  6. Повторное возбуждение с открытым или ограниченным отверстием (этап 3.4) в микроскопе светового пути, как требуется для следующей записанной ячейки и / или в присутствии специфических препаратов.
  7. После записи, фиксируют срезы для ретроспективном анализа путем прослаивая их между двумя фильтровальной бумаги и погружая их в 4% PFA O / N.
  8. Анализ электрофизиологических данных.
    Примечание: Используйте соответствующее программное обеспечение для визуализации данных записанных развертки для каждого отдельного стимуляции в автономном режиме. При анализе воздействия наркотиков, использование пиковых процедур обнаружения для получения временной ход действия лекарственного средства на синаптических амплитуды тока для всех отдельных разверток. Определите, когда действие препарата достигает устойчивого состояния. Для получения репрезентативных средних ответов на чертежах, используют программное обеспечение для средних ≥ 10 отдельных взмахов в экспериментальных условиях (ср Рисунок 3B-D, FH, J правая панель).
    Примечание: несколько альтернативных пакетов программного обеспечения могут быть использованы для анализа данных.

4. ретроспективном анализ Инъекции сайтов

  1. Промыть срезы участков инъекции (со стадии 2.12) и записи сайтов (если повторная визуализация желательно, начиная с шага 3.7) три раза в PBS. Это делается путем многократного замены раствора со свежим PBS на ротационном вибраторе три раза в течение 10 мин.
  2. Приготовьте 2% агар-агар раствор в PBS, и дайте ему остыть до ~ 65 ° C. Место ломтики плашмя на дно небольшого 30 мм чашках Петри диаметром, встраивать ломтики в агар-агар, и пусть она остынет до твердого продукта.
  3. Клей агар блок со встроенным срезе или ломтиков на стадии vibratome и поместите этап в режущую камеру с PBS.
  4. Резекция встроенные срезы толщиной 70 мкм. Дополнительно: После резекции, ломтики могут быть окрашены, то есть, с Neurotrace выявить цитоархитектуры (Фигура 3А, С), и / или бY иммунофлуоресценции окрашивание на YFP или mCherry для усиления сигнала от гибридного белка Chr.
  5. Mount ломтика на слайдах и покровное с монтажными средствами массовой информации. Инжекционные изображения сайтов и, при желании, также изображения кусочки , содержащие волокна в области проекции с помощью флуоресцентного микроскопа или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Фиг.2А-С).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом разделе показан рабочий процесс ех естественных условиях оптогенетика подхода и представительных результатов различных экспериментальных стратегий , чтобы исследовать физиологические свойства сенсорных и модуляторными долгосрочных прогнозов в BLA и mpITC нейронов, а также свойств локальной связности между mpITC и BLA.

После того, как стереотаксической инъекции выбранного вирусного вектора в желаемые координаты в мозг мыши (Фиг.1А-С, вирусный время выражение 2 - 6 недель, в зависимости от эксперимента), острые мозговые срезы участков инъекции и проекционных областей в миндалине подготовлены под соответствующим углом для пэтч-кламп экспериментов и из нагнетаемого области мозга для ретроспективном анализе участков инъекции (рис 1D). Перед началом записи и стимуляции оптогенетика, флуоресцентно меченых клеток или аксонов пропроекциям в целевой области (миндалины) должны быть проверены на прямой микроскоп для патч-зажим записи с помощью прилагаемый люминесцентную лампу (рис 1E). При получении патч-зажим записи от мнимого клетки-мишени в проекционной области среза, световая стимуляция начинается в то время как временная точка, интервал и длительность импульса управляются с помощью программного обеспечения патч, который вызывает светоизлучающий диод (LED). В зависимости от экспериментальной стратегии (Фиг.2А-С, справа) отверстие в люминесцентной пути света либо полностью открыт или ограничено (рис 2D). Сохраняя длительность импульса постоянной и как можно более коротким ( в идеале ≤1 мс), интенсивность выходного LED медленно повышают , чтобы оценить интенсивность которого требуется для достижения желаемой амплитуду синаптического ответа в конкретном эксперименте (рис 2E). После записи, мозжечковая миндалина ломтики фиксировали. По желанию и резекцииОкрашивание, инъекционные и регистрации сайтов изображаются на конфокальной микроскопии, чтобы проверить место впрыска и исключить данные из неуместными инъекций. Изображения участков инъекции и связанные с ними аксонов проекции в миндалину для трех экспериментальных стратегий (MPFC входы BLA, таламуса входы для mpITCs и локальной активации mpITC) показаны на рисунке 2А-С.

Рисунок 3 показывает репрезентативные результаты записи , полученные от Bla основных нейронов, местных интернейронов BLA и mpITC нейроны , иллюстрирующих свойства световых вызвали ответы для различных экспериментальных стратегий , используемых (рис 3A, E, I). Для целевой ГАМКергических нейронов (локальных интернейронов и mpITCs) для записи, GAD67-GFP мышей репортер использовали 24. Для MPFC и сенсорных таламуса выступов, могут быть изучены некоторые аспекты синаптической передачи. Временная точность переменного токаактиваций и кинетические свойства ХР, используемых в данном исследовании, позволяют создавать надежные стимуляции с парными импульсами при интер-стимула интервалом 50 мс. Это позволяет проводить анализ коэффициентов парных импульсов (ППР) постсинаптических токов (ЭСК), которые могут быть либо облегчение или угнетающим в зависимости от проекции и типа клеток - мишеней, а также служат индикаторами вероятности пресинаптического высвобождения (рис 3B, F, H) , Кроме того, анализ синаптических латентности позволяет рассечения различных постсинаптических компонентов реагирования.

В этом примере, большее время ожидания ингибирующего PSC (IPSC) в сравнении с возбуждающим PSC компонента (EPSC) указывают на disynaptic и моносинаптических вход соответственно (фиг.3С). В других случаях, более тщательный анализ дополнительных свойств EPSC, таких как джиттер ответа или коэффициент дисперсии размера ответа может потребоваться, чтобы сделать выводы о его моно- или disynaptic природа 17,23. Кроме того, применение фармакологических блокаторов для специфических рецепторов может идентифицировать природу ЧОК (т.е. глутаматергическая EPSC и ГАМК IPSC, рис 3C-D). Как и ожидалось, в начале компоненты входного MPFC был глутаматергическая, в то время как в конце компонент был ГАМК. Полный блок обоих EPSC и IPSC с блокатор рецепторов глутамата CNQX также поддерживает, что IPSC является disynaptic. Для исследования модуляции синаптической передачи на optogenetically активированных волокон, эффекты агонистов и антагонистов метаботропных рецепторов (здесь ГАМК B рецепторы) по амплитуде и ППР могут быть оценены для оценки влияния на пре- и постсинаптические сайтов. В этом примере, сопутствующее уменьшение амплитуды с увеличением ППР свидетельствует о пресинаптической модуляции света активированных волокон (3G, Н). И, наконец, локальные взаимодействия клеток в миндалине можно оценить, например,когда мыши , которые экспрессируют Cre под контролем промотора Tac2 25 вводят с двойным floxed , выражающей ЧР вирусного вектора (рис 1C). Поскольку Tac2 и , таким образом, выражается ЧР в mpITC и центральной миндалине (рис 2C), свет активации была ограничена mpITC путем закрытия флуоресцентного света путь диафрагмы (рис 2D). В этих условиях, легкие вызванные потенциалы действия могут быть выявлены в инфицированных mpITCs. Короткие задержки ингибирующие синаптические реакции в BLA указывают на наличие функциональной связи между ингибиторной mpITC и Bla основных нейронов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Стереотаксические Инъекции, Приготовление острого мозга Ломтики и визуализации пресинаптических волокон. (A, B) стереотаксической инъекции вируса. A) Изображение наркозом мыши помещают в стереотаксической раме с черепом воздействию иинъекции пипетка. Врезка: Увеличение изображения инъекции пипетки, заполненной раствором вируса, смешанного с быстрым зеленым. Шкала бар: 3 мм. (B) Схема черепа мыши с выраженными позициями отверстий для различных областей инъекций. (С) Схема , показывающая различные вирусные конструкции , используемые в данном исследовании. Темно-серый: последовательность промотора; синий: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); зеленый / красный: флуоресцентный белок. Время Выражение было 2 недели для локальных проекций миндалины и 4 - 6 недель для проекций от MPFC и МГМ / PIN-код. (Г) Получение острых срезов головного мозга: Схема , показывающая расположение мозга мыши на этапе слайсера для получения срезов из различных инъекций и проекционных областей. (E) Визуализация волокон в острых срезов мозга от GAD67 в-GFP мышей вводили вирус ChR2-mCherry в МГМ / PIN - код. Фотографии принимаются на вертикальном патч микроскопа с различными наборами фильтров: выражение GAD67-GFP, средние; МГМ / PIN волокна помечены мКлHerry, правильно. Шкала бар: 200 мкм. MPFC, медиальной префронтальной коры головного мозга; mpITC, медиальная paracapsular интеркалирован- клетки; БЛА, базолатеральная миндалина; МГМ, медиальная коленчатые ядро, медиальная часть; PIN-код, задняя интраламинарных ядра таламуса; LA, боковая миндалина; BA, базальная миндалина; CEA, центральное ядро миндалины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Инъекции сайтов, проекционные районах, а также оптогенетика Стимуляция аксонов проекциях. (AC) конфокальной образы репрезентативных участков нагнетательных и проекционных зон в BLA и схемы экспериментальных стратегий. (A) Слева: место инъекции MPFC в C57BL / 6 мышей , окрашенном Neurotrace. Шкала бар:500 мкм. Средний: соответствующие проекции в BLA в наклонном срезе миндалины. Шкала бар: 200 мкм. Справа: Схема всего поля освещения MPFC проекций и записи нейрон в BLA. (B) Слева: МГМ / PIN инъекции сайта в GAD67-GFP мыши. Шкала бар: 500 мкм. Средний: соответствующие проекции в mpITC и LA коронального среза миндалины. Шкала бар: 200 мкм. Справа: Схема всего поля освещения МГМ / PIN-проекций и запись на нейрон mpITC. (C) Слева: Местное выражение ChR2-YFP в Neurotrace окрашенных миндалины срез мыши Tac2-Cre. Шкала бар: 200 мкм. Врезка: Увеличить из mpITCs, выражающих ChR2-YFP. Шкала бар: 20 мкм. Справа: Схема ограниченного освещения кластера mpITC и записи нейроне BLA. (D) Фотографии записи камеры во время света и доставки изображения нейронов в острых срезов головного мозга (mpITC кластера) в GAD67-GFP мыши с открытой и ограниченной Аперратура. Шкала бар: 30 мкм. (E) Возбуждающие постсинаптические токи (EPSCs) , вызываемые различной интенсивности светодиодов (сверху) и участком световой мощности по сравнению с вызывали EPSC амплитуду (снизу) из репрезентативной mpITC нейроне при оптогенетика активации волокон из МГМ / PIN - кода. Шкала бар: 100 пА / 10 мс.
Примечание:. Рисунок 2A изменяется из источника № 16 и рис 2C из источника № 23 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Типичные Результаты оптогенетика Активация дальнего радиуса действия и локальных проекций. (А) Схема экспериментальной стратегии (BD). (B) Представитель EPSCs , записанные с главного нейрона BLA иБЛА интернейрон при оптогенетика стимуляции парных импульсов (50 мсек между раздражителем-интервала) волокон из MPFC выявляя в паре облегчения импульсов и парного импульсов депрессии, соответственно. Шкала бар: 100 пА / 25 мс. (C) оптогенетика активация волокон из MPFC вызывает торможение подачи вперед. Слева: Представитель EPSC (при -70 мВ) и ингибирующий постсинаптический ток (IPSC, при 0 мВ) в главном нейроне BLA. IPSC имеет более длинную синаптическую задержку по сравнению с EPSC. Масштабные бары: 200 пА / 10 мс и 200 пА / 2 мс. Справа: Свет вызывал двухфазные EPSC / последовательность IPSC (при -50 мВ) блокируется антагонистом АМРА / каинатным CNQX (10 мкм), дополнительно поддерживая disynaptic характер IPSC. Шкала бар: 50 пА / 5 мс. (D) Эффекты последующего блока EPSC / последовательности IPSC (при -50 мВ) на Cl - канал блокатор пикротоксином (PTX, 100 мкМ) и PTX + CNQX. IPSC блокируется PTX, а остальные EPSC по CNQX. Шкала баров: 50 пА / 5 мс. (Е) Схема экспериментальной стратегии (FH). F) Представитель EPSCs, записанные от mpITC и главного нейрона BLA при оптогенетика парных импульсов стимуляции волокон из МГМ / PIN-кода. Шкала бар: 50 пА / 20 мс. (G) EPSCs в другом нейроне mpITC блокируются натриевого канала блокатор тетродотоксин (TTX, 0,5 мкМ), что указывает , что они зависят от натриевого канала активности. Шкала бар: 50 пА / 20 мс. (H) таламуса входы mpITC нейроны модулируются пресинаптических рецепторов GABA B. EPSCs при условии управления, снижение EPSC амплитуды и сопутствующее увеличение парного скважности при применении ГАМК B агониста Баклофен (2 мкМ), и восстановление как амплитуды , так и начальной парного импульса пайку при совместном применении ГАМК B антагониста CGP55845 (10 мкМ). Эти изменения свидетельствуют о пресинаптической модуляции рецепторов GABA B. Шкала бар: 50 пА / 20 мс, (I) Схема экспериментальной стратегии (J). (J) Свет-вызванные потенциалы действия , записанные с ChR2-YFP , выражающие mpITC нейрон. Свет-вызванные ИПСК , записанные с главного нейрона BLA при различных потенциалах (-90 холдинговых, -70, -50, -20 и 0 мВ) обратный вокруг рассчитанного равновесного потенциала для Cl -. Шкала баров: 20 мВ / 100 мс и 10 пА / 10 мс. Примечание:. Рисунок 3B-D изменяется от ссылочного # 16, а на рис 3Н и J из источника № 23 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол описывает метод экс естественных условиях оптогенетика исследования нейронных цепей и локальной связи , которые могут быть легко реализованы на большинстве, если не все, в вертикальном положении ломтика записи патч-зажим расстановок, оснастив их с ~ 470 нм LED на эпифлуоресцентной света порт. Основное преимущество оптогенетика стимуляции аксонов проекций в срезах является то, что она позволяет специфической активации и исследования свойств соединений, которые не были доступны с обычной электрической стимуляции, так как соответствующие тракты волокна не были известны, четко не определены, или не сохраняется в один срез мозга. В качестве ключевого примера, имеющих значение для страха цепей, то показано, как это может быть применен к рассекать свойств входов MPFC к миндалине.

Даже в тех случаях, когда электрическая стимуляция волокон тракта широко используемых в предыдущих исследованиях, эти участки часто носят волокна из различных регионов происхождения, Например, в схемах, связанных страх обучения, прогнозы от различных сенсорных ядра таламуса или коры головного мозга запустить приобщены через внутренние и внешние капсулы, соответственно. Преимущество оптогенетика стимуляции является то, что она позволяет выполнять выборочное включение подмножества волокон из определенного региона. Это проиллюстрировано на конкретных таламуса входов от PIN-кода и МГМ до интеркалированных клеток и боковой миндалины главных клеток. Кроме того, проблемы , возникающие с электрической стимуляцией, то есть, активация других волокон прохода или клеток в непосредственной близости от раздражающего электрода , который может принимать локальные соединения в целевой области могут быть преодолены. Тем не менее, в то время как оптогенетика стимуляция столь же быстрым, как электрическое возбуждение, могут быть ограничения относительно частоты стимуляции, которые могут быть надежно применяться. Это зависит от инактивации и deinactivation кинетики и варианта ХР, который используется, 4, а также expressioУровни п и методы, а также легкие способы стимуляции 26.

При использовании светодиода, установленный на порт флуоресценции для световой стимуляции, как правило, все поле зрения данной цели освещается, что приводит к активации всех волокон или ячеек в области и в пределах определенной глубины. Это может лишь частично быть ограничено меньшей области или набора меченых клеток (в данном примере, mpITC) , используя отверстие в флуоресцентного пути 23,27 света. С помощью светодиодов, сила света не является проблемой, так как высокая мощность синие светодиоды теперь доступны от многих производителей. Однако спектры излучения имеют полную ширину половины максимальных значений нескольких десятков нанометров. Таким образом, светодиоды создают ограничения, когда пространственно-либо точной стимуляции для отображения внутриклеточной связности и / или монохроматического стимуляции желательны. Оба они могут быть улучшены с помощью синих лазеров в качестве источников света, как правило, в сочетании с более сложными установками, которые позволяют деготьадресности и / или сканирование луча на небольших участках и определенные глубины ткани (например, см 28).

С экс естественных оптогенетика подход , описанный здесь, некоторые свойства синаптической передачи могут быть изучены. Для оценки monosynapticity раннего синаптической компонента реакции, тщательного анализа латентных и их джиттера, а также амплитудной дисперсии следует использовать на репрезентативной выборке зарегистрированных нейронов (например, см 16,17,23). В тех случаях , когда активация сетевой активности может играть определенную роль, методом выбора является выделение прямого моносинаптических компонента путем применения комбинации тетродотоксин (ТТХ) , чтобы блокировать потенциалы действия в сочетании с K + канала блокатор 4-аминопиридин (4- AP) для предотвращения реполяризации 14,28,29. Рецепторы, опосредующие моно- и disynaptic компоненты входов могут быть идентифицированы с использованием фармакологических блокаторов. Furthermorе, можно изучить аспекты пресинаптической модуляции optogenetically-активированных входов в миндалине 23,30. Потенциальный нюанс в том , что ChR2 имеет некоторую проницаемость кальция 1,4 и его активации в пресинаптических волокон и терминалов было предложено изменить вероятность выхода с помощью различных механизмов 26,31. Тем не менее, несколько исследований , в том числе примеров , показанных здесь успешно применялся также выражение ChR2 для идентификации input- и клетки - мишени специфические различия в соотношениях парных импульсов в миндалине и других областях мозга 16,23,26,32 и , кроме того , продемонстрировали модуляции вероятности высвобождения путем активации специфических сигнальных путей в пресинаптических терминалах , которые не исключающих активацией 23,30 ХР. Дальнейшая поддержка исходит от данных в гиппокампе и мозжечке, показывая, что с соответствующим методом экспрессии и легкой ХР методики стимуляции, физиологические аспекты, включая эффективность высвобождения и верности Oе синаптической передачи может быть достоверно изучено 26. И, наконец, оптогенетика активации волокна также успешно используется для применения протоколов стимуляции , которые вызывают синаптической пластичности 31,33,34.

Некоторые аспекты имеют решающее значение для успеха этого метода. Одним из них является точность стереотаксической нацеливания вирусных векторов. Поэтому, полезно быстро оценить расположение места инъекции до получения записей, а затем выполнить более точный-Hoc последующий анализ. В дополнение к пространственной точности, жизнеспособность нейронов в месте инъекции является основным фактором, определяющим для успешного эксперимента и зависит от техники инъекции. Представленный вариант, используя длинные и тонкие-коническая стеклянные электроды, этой цели служит хорошо как поверхностных и более глубоких областей мозга, но может иметь тот недостаток, что конусность является очень гибким. В качестве альтернативы можно использовать микролитра шприцы, специально разработанная для стереотаксической доставки в нейрологии (нейро-х годовyringes) с более жесткими иглами, что может обойтись небольшими объемами. Специфика ориентации CHR-выражение для определенных типов и областей клеток могут быть дополнительно улучшены с помощью условного выражения 7, например , с CRE-системой , как показано на миндалины интеркалированного клеток. Это также позволяет использовать сильных промоторов в Cre-зависимых вирусных векторов.

Другим важным аспектом является выбор вирусного вектора. Чтобы выразить CHR, использовали рекомбинантный адено-ассоциированные вирусы (rAAVs), которые имеют преимущество быть уровень биологической безопасности 1 векторов по сравнению с другими популярными вирусных систем. rAAVs были использованы в течение некоторого времени , и , как правило , безопасные и надежные векторы с хорошей нервной тропизма и мало или вообще не иммуногенный потенциал, но их объем упаковки ограничен (ок. 4-5 кб) 35. В этих конкретных экспериментах, серотипов 2/9 и 2/1 были использованы для повсеместного и условного выражения, соответственно. В соответствии с литературой, тоSE серотипов трансдукции клеток в целевом регионе, но , похоже , не поглощаться аксонов ретроградно этикетки клетки, в отличие от серотипов и 2/6 2/5 36,37. Тем не менее, первоначальные эксперименты следует исключать, что существуют CHR-меченные клеточные тела в областях, выступающими в месте инъекции, что особенно важно при изучении совмещенных связанных областей мозга, таких как MPFC и миндалине. Несколько недавних исследований по сравнению эффективности Раав серотипов в различных областях головного мозга у крыс и мышей 36,38,39. Возникающий темой является то , что новые серотипов (например, 2/1, 2/8 и 2/9) , как правило , более эффективны , чем первоначальный 2/2 серотипа. Следует также отметить, Раав-опосредованной экспрессии CHR, в отличие от других методов, не вызывают вредные воздействия на клетках , экспрессирующих или меченых аксонов 40. Требуемое время выражение для достижения эффективной активации волокна ех естественных условиях , как представляется , зависит от расстояния проекции исследуемого. Здесь и в соответствии с облегченнойратура, для маркировки и активации соединений дальнего радиуса действия у мышей (MPFC и сенсорные входы), при времени экспрессии 4 - 8 недель требуется, в то время как для изучения локального соединения в миндалине, более короткое время экспрессии 2 - 3 недель достаточной 14-17,23,30,34.

Для записи optogenetically-ответов в вызываемых целевой области, два фактора имеют решающее значение: 1) срез острый мозг должен быть хорошего качества и 2) значительное количество жизнеспособных меченых волокон должна быть сохранена. Качество срезов может быть улучшено с помощью сапфировых лезвия для резки. Сохранение аксонов и , следовательно, размер и стабильность световых реакций могут быть улучшены за счет сокращения ломтиков под определенным углом , как показано на MPFC-миндалины проекций (рис 1D и 2A) , 16,34. Тем не менее, это сильно зависит от ориентации афферентов в целевой области и должны быть определены для каждой комбинации области проекции и таrget область. В связи с этим, апостериорных анализ проекций в целевой области может быть полезным. Для улучшения обнаружения волокон и перехитрить отбеливания, которые могли иметь место во время стимуляции среза, иммунным против флуоресцентной метки на слитого белка может быть ХР работают.

В целом этот метод картирования оптогенетика замыкания в последнее время не только были применены к страху схем, но и многие другие системы в головном мозге. В будущем, адресности subnuclei и специфических типов клеток путем объединения все большее множество генетически модифицированных мышей линий и условных вирусных векторов обеспечит еще более детальное представление о разнообразии функциональных синаптических свойств конкретных схем локального и дальнего радиуса действия. Кроме того, ретроспективном иммуномечение флуоресцентно-меченого в исследованных ЧР функциональных соединений можно комбинировать с ультраструктурным анализа (т.е. с использованием электронно - микроскопических методов) , чтобы дать представление о точном морphological свойства ранее активированных синапсов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex Vivo</em> оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter