Summary
כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים.
Introduction
Kinesin-1 הוא חלבון מנוע שמתווך תחבורת האנטרוגרד של המטענים שלה 1,2. זהו heterotetramer של שתי יחידות המשנה של Kinesin אור שרשרת 1 (KLC1) ושתי יחידות משנה של שרשרות כבדות Kinesin (KHCs). KIF5B 1, KHC, מכיל תחום רכב בבית שלה N-terminal, אשר hydrolyzes ATP ו ממיר את האנרגיה הכימית לאנרגיה מכנית לתנועה לאורך microtubules. באזור C-terminal שלה מכיל את תחום dimerization כי אינטראקציה עם KLC1, אשר מקשר עם מטענים. Kinesin-1 משלוחי מטענים כגון שלפוחית, אברונים mRNAs 3,4. לאחרונה, KIF5B הוצגה להובלת גורם שעתוק גרעיני c-myc השפלה proteosomal בציטופלסמה 5. שלוש מתודולוגיות (מעכב כימי, siRNA / shRNA ו מוטציה שלילית דומיננטית) שמשו לעכב פונקצית Kinesin-1. כולם המושרה צבירה של c-myc בציטופלסמה. לחישוב על פי השיטה האחרון, c-myc הושפע רק על ידי negat הדומיננטיive מוטציה של KIF5B, אבל לא על ידי זה של חלבון אחר מנוע קשור KIF5A, הדבר המצביע כי המוטציה לא להשפעות כלליות על הרכיבים התאיים (כמו שיבוש microtubule) או על הצטברות חלבון. המוטציה השלילית הדומיננטית של KIF5B גם לא השפיעה גורם שעתוק אחר, דבר המצביע על כך זה לא להשפעות כלליות על גורמי שעתוק. במקום זאת, הוא טוען כי המוטציה השלילית הדומיננטית מפעילה השפעות ספציפיות על המטענים שלה.
שימוש מוטציות שליליות דומיננטיות נפוץ בתחום חלבוני מנוע. מוטציות motorless דומה kinesins ו myosins שימשו בעבר. הם שימשו בעיקר כדי להדגים את ההשפעות של מוטציות על localizations subcellular של מטענים שלהם או על תפקודים תאיים 6-12. פחות דגש הושם על הקשר המרחבי בין מוטנטים המטענים המושפעים מהם. עם זאת, בכמה מקרים, המוטציות נצפו לשתף למקם עם ca שלהם6,10 rgos.
האינטראקציה בין KIF5B והחלבונים הקשורים אליו אושרה בעבר על ידי שמרי in vivo assay השני היברידי מבחני הנפתח ביוכימיות כגון שיתוף immunoprecipitation וב מבחני נפתח במבחנת 13-16. במאמר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשיטה חזותי נוסף מתואר לזהות חלבוני מטען KIF5B. השיטה עושה שימוש מוטצית KIF5B motorless שפועלת מוטציה שלילית דומיננטית. גוגל מאגד בציטופלסמה ומשרת צבירה של המטענים שלה.
התיוג של wild-type ו מוטציה KIF5B motorless עם חלבון פלואורסצנטי tdTomato 17 מאפשרת הדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבוני KIF5B מתויגים יכולים להיות שותף הביע עם חלבון מועמד התמזג חלבון פלואורסצנטי שונה עם תכונות ספקטרליות מופרדות כראוי מתג KIF5B. החלבונים מתויגים הם נצפו ישירות בתאים חייםתחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אינדוקציה של אגרגציה של החלבונים המועמדים על ידי מוטצית KIF5B motorless תאשר כי חלבון המועמד הוא מטען in vivo של KIF5B. יתר על כן, חלבוני KIF5B מתויג tdTomato יכולים להתבטא לבד בתאים ללמוד והשפיעו על חלבוני מטען אנדוגני. מאוחר יותר, מיקרוסקופיה immunofluorescence מתנהלת שבו תאי transfected הם קבועים מוכתם נוגדן ספציפי נגד חלבון מועמד אנדוגני, ואחריו נוגדנים משני מתאימים מצומדות עם פלורסנט לצבוע. במקרה זה, חלבון מועמד אנדוגני ברמה הפיזיולוגית שלו נלמד. מוטציות motorless דומות חלבוני מנועים אחרים יכולות להיות מוכן לזהות המטענים שלהם.
Protocol
שיבוט 1. של wild-type-tagged tdTomato ו Motorless KIF5B חלבונים
- הגבר את cDNAs עבור wild-type האדם וחלבונים KIF5B motorless באמצעות פריימרים בטבלה 1, DNA פולימרז תקי (5 יחידות עבור 100 μl), תמהיל dNTP (2 מ"מ לכל deoxynucleotide) חיץ 10X שלה במשך 30 מחזורים. כל מחזור מורכב צעד denaturation (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), צעד חישול (45 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ו צעד ארכה (72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות).
- חלץ את מוצר ה- DNA מוגבר עם נפח שווה של פנול / כלורופורם (1: 1).
הערה: פנול הוא דליק ועלול לגרום לכוויות. כלורופורם מהווים סכנה. יש להימנע ממגע ישיר עם אותם ולהשתמש בהם תחת במנדף כימי. לחלופין, מוצרי ה- PCR יכול להיות מטוהר על ידי ערכות שונות.- ספין על 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. מעבירים את הפתרון מימית לצינור חדש ולחלץ עם נפח שווה של כלורופורם.
- לְסוֹבֵבב 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 0.5 דקות. מעביר את הפתרון מימי לצינור חדש.
- מערבבים את בתמיסה מימית עם נפח לעשירית 3 M Na-אצטט ושני כרכים של אתנול אבסולוטי.
- ספין על 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון המימי.
- שטפו את הכדור DNA עם שתי נפח של אתנול 75%. מחק את פתרון המימי ואוויר יבש גלולת DNA בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. Resuspend גלולה DNA ב -34 מים μl.
- תקציר המוצרים המוגברים נפח הסופי של 40 μl עם הגבלת אנזימי סאלי (10 יחידות) ו BamHI (10 יחידות) ו -4 μl של חיץ 10X שלהם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי שעות. פתור את המוצרים מתעכל ג'ל agarose (1.0% ב 100 V) המכיל (מ"ל 0.2 מיקרוגרם /) ethidium ברומיד.
הערה: ברומיד Ethidium הוא mutagen חזק והוא יכול להיספג דרך העור. לכן, חשוב להימנע ממגע ישיר או עקיף wה- i ethidium ברומיד. - חותכים את הערוצים המתאימים לניקוי לפי עמודות. לשקול את הג'ל agarose המכיל את קטע DNA. ואז לפזר אותו למאגר solubilization (300 μl עבור 0.1 גרם) ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות.
- מוסיפים את פתרון הביא לעמודה ספין ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 5 שניות. מחק את הזרימה דרך.
- לשטוף את העמודה עם חיץ solubilization 0.5 מ"ל על ידי חזרה על שלב 1.5. לשטוף את העמודה שוב עם חיץ 0.75 מ"ל לשטוף על ידי חזרה על שלב 1.5. ספין בעמודה למשך 2 דקות כדי להיפטר למאגר לשטוף הנותרים.
- Elute שבר DNA עם 50 מים μl ידי חזרה צעד 1.5. להעריך את הריכוז של קטע DNA על ידי הפעלת aliquot של זה נגד סולם גודל ה- DNA ג'ל agarose (1.0% ב 100 V) המכיל ברומיד ethidium (0.2 מיקרוגרם / מ"ל).
- ולקשור את המוצרים מטוהרים (כ -100 ng) עם וקטור ptdTomato-C1 17 (כ -100 ng) מתעכל בעבר עם הדואר באותו הגבלה אנזימים 10 μl באמצעות האנזים T4 DNA (2,000 יחידות) ו 1 μl 10X חיץ קשירת בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות.
הערה: סוג-בר מוטציה motorless מכיל חומצות אמינו מ 2 כדי 963 ו 584 כדי 963, בהתאמה. בעבר, מוטצית KIF5B motorless גדולה שמשה לזיהוי תפקידיו 9. מוטצית KIF5B motorless קטנה שמשה המחקרים הנוכחיים להגדיל את רמות הביטוי שלה.
2. מיקרוסקופי Immunofluorescence
- עבור תאים חיים או דימות פלואורסצנטי עקיף עם הגדלה או מתחת 40X, זרע 0.2-0.3 מיליון תאים הלה ב 1 מ"ל בינוני שלם [בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS)] בכל טוב של צלחת שש היטב. לגדול ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- עבור מחקרים immunofluorescence עקיף עם בהגדלה מעל 40X, לשטוף כוסות כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ; 1.5 עובי) בקצרה אתנול אבסולוטי ואוויר-לייבש אותםהבארות של צלחת שש היטב, בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום.
- זרע 0.2-0.3 מיליון תאים ב 1 מ"ל להשלים בינוני DMEM בכל טוב של צלחת שש היטב.
- הכנת קומפלקס Transfection
- למחרת, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, לדלל 0.6 מיקרוגרם (סה"כ) של פלסמיד ביטוי wild-type-tagged tdTomato או KIF5B motorless בנוכחות או בהיעדר פלסמיד ביטוי חלבון מועמד מטענים (pTagCFP-c-myc 5 ) עם המדיום transfection 0.1 מ"ל צינור 1.6 מ"ל microcentrifuge.
הערה: וקטור pTagCFP-c-myc מבטא את c-myc-tagged TagCFP. - להוסיף 1.8 μl של מגיב transfection עד בינוני 0.1 מ"ל transfection ב עוד צינור 1.6 מ"ל microcentrifuge. בדרך כלל, להכין תערובת אב של מגיב transfection מדולל מספיק 12 דגימות.
- דגירה במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים את מגיב transfection 0.1 מ"ל מדולל אל DNAs 0.1 מ"ל מדולל. מִיx את התוכן על ידי היפוך הצינורות. ספין צינורות במשך 5 שניות ב microcentrifuge.
- דגירה במשך 45 דקות, בטמפרטורת החדר.
- למחרת, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, לדלל 0.6 מיקרוגרם (סה"כ) של פלסמיד ביטוי wild-type-tagged tdTomato או KIF5B motorless בנוכחות או בהיעדר פלסמיד ביטוי חלבון מועמד מטענים (pTagCFP-c-myc 5 ) עם המדיום transfection 0.1 מ"ל צינור 1.6 מ"ל microcentrifuge.
- כביסה של תאים
- לשטוף שלוש פעמי התאים שנזרעו עם בופר פוספט (PBS) במהלך תקופת הדגירה של ההיווצרות של מתחם transfection.
- החלף את המדיום של תאים זורעים בכל טוב עם 0.8 מ"ל בינוני transfection מחומם מראש. החזר את הצלחות אל האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
- Transfection של תאים
- לאחר דגירה של 45 דקות, להוסיף 0.2 מ"ל של המתחם מגיב DNA / transfection (מוכן בשלב 2.3) dropwise היטב כל הצלחת.
- Rock the צלחת 6 היטב בעדינות במשך 5 שניות, לפני שהם מוחזרים החממה ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר 6-8 שעות, להחליף בינוני עם מדיום DMEM המלא.
- עבור דימות פלואורסצנטי Live- תא 18
- לאחר דגירה 16 שעות של נוספיםt 37 ° C, להוסיף את הכתם intercalating DNA Hoechst 33342 למדיום לריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
הערה: Hoechst 33342 הוא צבע intercalating תא חדיר, DNA כי כתמי גרעין התא. - דגירת תאי transfected במשך 10 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס לפני לבחון אותם על מנת לתת ביטוי חלבוני ניאון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 40X. הסטים מסנן DAPI, CFP, FITC ו Cy3 הם (ננומטר Ex350 / Em460 ננומטר), (ננומטר Ex436 / Em480 ננומטר), (ננומטר Ex470 / Em525 ננומטר) ו- (ננומטר Ex545 / Em605 ננומטר), בהתאמה.
הערה: אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש.
- לאחר דגירה 16 שעות של נוספיםt 37 ° C, להוסיף את הכתם intercalating DNA Hoechst 33342 למדיום לריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
3. מחקרי Immunofluorescence עקיפים
- הכנת פתרון Paraformaldehyde
- לשקול אבקת paraformaldehyde (4 גרם לכל 100 מ"ל PBS) ולהוסיף אותו PBS.
הערה: Paraformaldehyde הוא מוצק דליק וכן hazar הסרטן פוטנציאליד. זה מעצבן את העיניים, דרכי הנשימה והעור. לכן, חשוב להימנע ממגע עם או שאיפה של paraformaldehyde. - הוספת NaOH לפתרון (150 μl 10 N NaOH / 100 מ"ל).
- שמור את הפתרון על 37 42 ° C במשך 2-3 שעות עם רעד מדי פעם.
- התאם ל- pH 7.0 ידי הוספת חומצה אצטית קרחונית לפתרון (כ -75 μl / 100 מ"ל) לאחר אבקת paraformaldehyde נמס.
- לשקול אבקת paraformaldehyde (4 גרם לכל 100 מ"ל PBS) ולהוסיף אותו PBS.
- יעד חלבונים מכתים
- לאחר דגירה נוספת עבור 16 שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים transfected בטמפרטורת החדר פעם עם PBS על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות.
- תקן את התאים עם 1 מ"ל של שהוכן זה עתה, פתרון paraformaldehyde 4% בכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- שוטפים את התאים עם PBS פעם על ידי מתערבל במשך 5 שניות צלחת שש היטב. מחק את הפתרון.
- דגירה התאים עם 1 מ"ל של 0.1% Triton-X 100 (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. detergent Triton-X 100 יהיה permeabilize קרום תא כדי לאפשר גישה של נוגדני המטרות התאיות שלהם.
- שוטפים את התאים עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה.
- דגירה התאים עם 1 מ"ל של נוגדנים ראשוניים (נוגדן ארנבת c-myc או נוגדן עכבר p53; 0.1 מיקרוגרם / מ"ל) בתוך FBS 10% בפתרון PBS בטמפרטורת החדר על ידי נדנדה עבור 4 שעות.
- לשטוף עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה.
- דגירה עם 1 מ"ל של נוגדנים משני ניאון מצומדות צבע (נוגדן 488 מצומדות נגד ארנב או אנטי עכבר IgG אלקסה פלואוריד; 0.5 מיקרוגרם / מ"ל) ב 10% FBS ב PBS בטמפרטורת החדר בחושך ידי נדנדה עבור 2 שעות.
- לשטוף עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה.
- גרעיני מכתים שמה
- החל 10 μl של פתרון גובר על כל שקופית מיקרוסקופ. הר כל זכוכית מכסה על הפתרון גובר על שקופיות מיקרוסקופ.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה האפל.
- חותם את הקצוות של משקפי הכיסוי עם לק. מניחים בחושך בתוך במנדף לילה להסיר את האדים לק.
- למחרת, לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרה 40X. הסטים מסנן DAPI, CFP, FITC ו Cy3 הם (ננומטר Ex350 / Em460 ננומטר), (ננומטר Ex436 / Em480 ננומטר), (ננומטר Ex470 / Em525 ננומטר) ו- (ננומטר Ex545 / Em605 ננומטר), בהתאמה.
Representative Results
אקסוגני הביע KIF5B wild-type הופיע בצורה הומוגנית בציטופלסמה, בעוד c-myc הופיע בעיקר בגרעין (איור 1 א). עם זאת, מוטציה KIF5B motorless יצרו אגרגטים ב (איור 1 א) בציטופלסמה. אגרגציה של KIF5B motorless המושרה צבירה של c-myc. אחוז התאים המבטאים מצטברים TagCFP מתויג c-myc ב התאים המבטאים KIF5B wild-type היה נמוך. עם זאת, זה היה משמעותית גבוה יותר כאשר KIF5B motorless היה שיתוף הביע (איור 1 א). שיתוף לוקליזציה שנצפה KIF5B מוטציה עם c-myc (איור 1) עולה כי KIF5B מסדיר את לוקליזציה subcellular של c-myc ו c-myc הוא מטען של Kinesin-1. בקרות שליליות שבו המבנים התבטאו לבד כלולים ב- הפאנל התחתון של איור 1A. התוצאות מראות כי אין דרך לדמם משמעותי emissio הקרינהn. KIF5B motorless הנגרמת גם אגרגציה של c-myc אנדוגני (איור 1B) ואת p53 גורם שעתוק (איור 2), המציין כי c-myc ו- p53 הם המטענים של Kinesin-1 ו KIF5B מסדיר את לוקליזציה subcellular של שני חלבונים אנדוגניים. יחד עם התוצאות כי מעכב Kinesin-1 עלה lactone בנגל (RBL) 20 גורם להיווצרות מינים משקל מולקולרי גבוה הן c-myc ו- p53 5, p53 עשוי מטען של Kinesin-1. מעניין לציין כי p53 גורם שעתוק הגרעיני, כמו c-myc, מיוצא גם מהגרעין אל הציטופלסמה שפל proteasomal 21,22. התנועה של גורמי שעתוק על ידי KIF5B מופיע להיות ספציפי כי הביטוי של מוטציה KIF5B motorless לא השפיע על לוקליזציה subcellular c-Fos או לגרום לו לצבור (איור 3). הנתונים לעיל מוכיחים כי methoד מועסק בפרסום זה מאפשר זיהוי-הסגולי הגבוהה של מטעני Kinesin-1. אסטרטגיה דומה ניתן להחיל חלבוני מנועים אחרים גם כן.
איור 1: הביטוי של מוטציה KIF5B motorless גורם צבירה c-myc בציטופלסמה (א) תאים הלה היו transfected עם tdTomato מתויג wild-type (WT) KIF5B (אדום) ו TagCFP מתויג c-myc (כחול).. tdTomato מתויג WT KIF5B הופיע בעיקר בציטופלסמה, בעוד TagCFP מתויג c-myc הופיע בעיקר בגרעין. עם זאת, מוטציה KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרו אגרגטים filamentous או punctate בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless המושרה צבירה של c-myc. KIF5B המוטציה ו c-myc השותף המקומי יחד (ורוד). אחוזים של תאים (%) המציין אגרגטים של CFP-c-myc (%) מוצגים. התוצאות מוצגות כפיממוצע ± סטיית תקן (N = 3). בקרות שליליות עם ביטוי של חלבוני KIF5B tdTomato מתויג או TagCFP מתויג c-myc יחד עם וקטורים ריקים (V) מוצגות בפנל התחתון. (ב) תוצאות דומות התקבלו עם c-myc אנדוגני (ירוק) כאשר tdTomato מתויג WT או חלבונים KIF5B motorless (אדום) באו לידי ביטוי. מוטצית KIF5B motorless מתויגת tdTomato יצרה אגרגטים בציטופלסמה מושרה אגרגציה של c-myc אנדוגני. שני סוגי אגרגטים שותף מקומי יחד בציטופלסמה (כתום). הגרעינים הוכתמו לצבוע Hoechst 33342 או DAPI. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הביטוי של מוטצית KIF5B motorless גורם צבירת p53 אנדוגני tהוא בציטופלסמה. בתאים הלה, wild-type אקסוגניים-tagged tdTomato (WT) KIF5B (אדום) הופיע בעיקר בציטופלסמה, בעוד p53 אנדוגני (ירוק) הופיע בעיקר בגרעין. לעומת זאת, מוטצית KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרה אגרגטים בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless המושרה צבירה של p53, וכתוצאה מכך את שיתוף לוקליזציה של KIF5B ו- p53 בציטופלסמה (צהוב). הניסוי בוצע שלוש פעמים. הגרעינים הוכתמו DAPI לצבוע. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. הביטוי של מוטציה KIF5B motorless לא לגרום צבירה של c-Fos בציטופלסמה tdTomato מתויג wild-type (WT) KIF5B (אדום) הופיע בעיקר בציטופלסמה של תאי הלה, תוך EGFP-ג-Fos (ירוק) הופיע בעיקר בגרעין. נהפוך הוא, מוטציה KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרו אגרגטים בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless לא להשרות את ההצטברות של c-Fos. הניסוי בוצע ארבע פעמים. הגרעינים של תאים הוכתמו DAPI לצבוע. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פריימר הגב, המשותף | 5'-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 " |
| פריימר wild-type KIF5B קדימה | 5'- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 " |
| פריימר motorless KIF5B קדימה | 5'- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 " |
: לשמור-together.within-page = "1"> טבלה 1: רצפים פריימר עבור שיבוט wild-type וחלבונים KIF5B motorless.
Discussion
השיטה המתוארת מנצלת את המאפיינים של מוטצית KIF5B motorless, אשר חסרה את היכולת לנוע לאורך microtubules, אך שומרת לעצמה את היכולת ליצור דימרים עם KIF5B wild-type, ובכך לאפשר את חלבון tetrameric לקיים אינטראקציה עם אותם חלבוני המטען כמו wild-type KIF5B. KIF5B Motorless, ולכן, משמש מוטציה וצורות שליליות דומיננטיות mislocalized אגרגטים עם המטענים שלה. שיטה זו מוכחת לזהות את המטען Kinesin-1 c-myc (איור 1) 5. במאמר זה, באותו מוטציה KIF5B motorless שימש לזיהוי p53 כעוד מטען הפוטנציאל של Kinesin-1 (איור 2). זה מראה כי המתודולוגיה אינו ריאלי לזהות מטענים אחרים של Kinesin-1. יתר על כן, את הספציפיות של המוטציה מסופקת על ידי חוסר ההשפעה של המוטציה על חלבון הבקרה השלילי c-Fos (איור 3).
בפרוטוקול זה, tdTomato מתויג-טאי ברPE או חלבון KIF5B motorless הוא coexpressed עם חלבון אחר מטען מועמד חלבון מתויג ניאון. במקרה זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי Live- תא הדמיה מבוצעים. ההיווצרות של אגרגטים ניתן לייחס ידי הדמית זמן לשגות. לחלופין, חלבון מתויג tdTomato מתבטא לבד ואת חלבון מטען המועמד ברמות הפיזיולוגיות שלה היא דמיינה ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עקיפה באמצעות נוגדנים ספציפיים. TdTomato חלבון פלואורסצנטי נבחר הבהירות שלה בצילום 17. אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש.
מוטצית KIF5B motorless יוצרת דימרים עם KIF5B wild-type stoichiometrically. לכן, חשוב להביע כמות מספקת של מוטצית KIF5B motorless ליצירת דימרים עם עמיתו wild-type כדי לעכב את התפקיד וכדי ליצור אגרגטים. כדי לטפל בבעיה זו, אופטימיזציה של expression של מוטציה motorless חיוני. זו מושג באמצעות מוטצית motorless קטנה המכילה את תחום dimerization. בנוסף, אופטימיזציה של מגיב ופרוטוקול transfection המתאימים גם הכרחית. משך הדגירה של תאים הלה עם מגיב DNA / transfection היה מותאם בתאים הלה לביטוי של חלבונים אקסוגני כדאיות התא. משך הדגירה ייתכן שיהיה צורך מותאם במיוחד שורות תאים אחרות.
לקבלה בהגדלה בין 4X ל 40X, לא משקפי כיסוי נדרשים. תאים יכול להיבחן ישירות במי קידוחים. לכן, במקרה זה, הפרוטוקול הוא זול ונוח. לקבלה בהגדלה מעל 40X, תאים גדל על משקפי כיסוי הבארות, לאחר מכתים, הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ לבדיקה תחת מטרות-טבילת שמן.
תצפית של אגרגטים של חלבון KIF5B motorless היא מוגבלת על ידי גודל של הציטופלסמה. נקל לזהות אתאגרגטים בתאי יונקים רבים. עם זאת, הוא יחסית קשה להתבונן המצרפים בתאים עצביים כאשר היקף בציטופלסמה קטן סביב הגרעינים והן neurites.
הפרוטוקול משמש כדי להראות את הקשר בין KIF5B והמטענים שלה בנוסף שמרי in vivo השנייה היברידי מבחני נפתח ביוכימיים 13-16. כל אלה מבחני לקבוע את הקשר בתנאים פיזיים שונים ותוצאותיהם יכולים להשלים אחד את השני. יתר על כן, היתרון של assay הקרינה הזאת על מבחני אחרים היא שזה יכול להראות את הסדרת לוקליזציה subcellular של מטענים ידי KIF5B (איורים 1 ו -2).
הפרוטוקול אינו מוגבל KIF5B וניתן להשתמש בו כדי לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים, כגון כמה מנועי kinesin אחרים 3 וחלק מנועי השרירן 23,24 בשימוש בתחבורה תאית של מטענים 3. חלבונים המנועים אלה מכילים גם תחומי מנוע לתנועה לאורך microtubules עבור מנועי kinesin ו microfilaments עבור מנועי שרירן, ומגזרי סליל מפותלים עבור oligomerization. רובם יוצרים homodimers 3,23. לכן, אסטרטגיה דומה ניתן ליישם אותם על ידי יצירת המוטציות השליליות הדומיננטיות motorless שלהם לזהות המטענים שלהם.
Disclosures
פרסום והפקה וגישה חופשית של מאמר זה הוא שילם על ידי רוש.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
| formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
| Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
| PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
| PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
| BamHI | New England Biolab | R0136 | |
| SalI | New England Biolab | R0138 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
| Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
| p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
| fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
| computer software for imaging | cellSens |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Yu, Y., Feng, Y. M. The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy. Cancer. 116, 5150-5160 (2010).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Lee, C. M. Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm. Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).
- Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles. Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).
- Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1. J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).
- Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules. Biol Cell. 106, 57-71 (2014).
- Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels. Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).
- Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3. Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).
- Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments. Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).
- Zadeh, A. D., et al. Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel. J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).
- Su, Y. Y., et al. KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8. J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).
- Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B. . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).
- Cho, K. I., et al. Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function. Traffic. 8, 1722-1735 (2007).
- Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B. Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).
- Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening. Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).
- Zhang, Y., Xiong, Y. Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF. Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).
- Michael, D., Oren, M. The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system. Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).
- Kneussel, M., Wagner, W. Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics. Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).
- Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells. J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).
