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Biology

Kinesin-1 cargos के पहचान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Published: February 14, 2016 doi: 10.3791/53632
Automatic Translation
1
1Department of Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

इधर, एक प्रोटोकॉल kinesin-1 cargos की पहचान के लिए प्रस्तुत किया है। Kinesin -1 भारी श्रृंखला (KIF5B) के एक motorless उत्परिवर्ती कोशिका द्रव्य में समुच्चय और उसके cargos के एकत्रीकरण लाती है। दोनों समुच्चय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत पता चला रहे हैं। एक समान रणनीति अन्य मोटर प्रोटीन की पहचान करने के लिए cargos नियोजित किया जा सकता।

Introduction

Kinesin-1 एक मोटर प्रोटीन है कि इसकी cargos 1,2 के अग्रगामी परिवहन मध्यस्थता करता है। यह kinesin प्रकाश श्रृंखला 1 (KLC1) और kinesin भारी जंजीरों की दो यूनिटों (KHCs) की दो यूनिटों की एक heterotetramer है। KIF5B 1, एक केएचसी, इसकी एन टर्मिनल, जो एटीपी hydrolyzes और सूक्ष्मनलिकाएं साथ आंदोलन के लिए यांत्रिक ऊर्जा को रासायनिक ऊर्जा धर्मान्तरित पर एक मोटर डोमेन होते हैं। इसका सी टर्मिनल क्षेत्र dimerization डोमेन कि KLC1, जो cargos के साथ सहयोगियों के साथ सूचना का आदान प्रदान होता है। Kinesin-1 ऐसे पुटिकाओं, अंगों और mRNAs 3,4 के रूप में cargos transports। हाल ही में, KIF5B कोशिका द्रव्य 5 में proteosomal गिरावट के लिए परमाणु प्रतिलेखन कारक सी-MYC परिवहन करने के लिए दिखाया गया था। तीन तरीके (रासायनिक अवरोध, siRNA / shRNA और प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती) को बाधित करने के लिए kinesin -1 समारोह इस्तेमाल किया गया। वे सभी कोशिका द्रव्य में सी-MYC के एकत्रीकरण प्रेरित किया। पिछले कार्यप्रणाली के लिए सी-MYC केवल प्रमुख negat से प्रभावित थाKIF5B के उत्परिवर्ती ive, लेकिन नहीं एक अन्य संबंधित KIF5A मोटर प्रोटीन की है कि द्वारा, सुझाव है कि उत्परिवर्ती जनरल (microtubule व्यवधान की तरह) intracellular घटकों पर प्रभाव या प्रोटीन एकत्रीकरण पर लागू नहीं होता है। KIF5B के प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती भी एक और प्रतिलेखन कारक प्रभावित नहीं किया है, सुझाव है कि यह प्रतिलेखन कारक पर सामान्य प्रभाव डालती नहीं है। दरअसल, यह पता चलता है कि प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती अपने cargos पर विशेष प्रभाव डाल रही है।

प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट का उपयोग मोटर प्रोटीन के क्षेत्र में आम है। kinesins और myosins की इसी motorless म्यूटेंट पहले से इस्तेमाल किया गया। वे मुख्य रूप से उनकी cargos के subcellular स्थानीयकरण पर या सेलुलर कार्यों 6-12 पर म्यूटेंट के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कम जोर म्यूटेंट और cargos उनके द्वारा प्रभावित बीच स्थानिक संबंधों पर रखा गया था। हालांकि, कुछ घटनाओं में, म्यूटेंट उनकी सीए के साथ सह स्थानीय बनाना मनाया गयाrgos 6,10।

KIF5B और उसके संबंधित प्रोटीन के बीच बातचीत के पहले इन विवो खमीर दो संकर परख और इस तरह के सह immunoprecipitation के रूप में और इन विट्रो पुल से नीचे assays 13-16 में जैव रासायनिक पुल से नीचे assays के द्वारा पुष्टि की गई। इस अनुच्छेद में, एक अतिरिक्त दृश्य विधि का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी KIF5B कार्गो प्रोटीन की पहचान करने में वर्णित है। विधि एक motorless KIF5B उत्परिवर्ती कि एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती के रूप में कार्य का उपयोग करता है। यह कोशिका द्रव्य में समुच्चय और उसके cargos के एकत्रीकरण लाती है।

जंगली प्रकार और tdTomato 17 फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ motorless KIF5B उत्परिवर्ती की टैगिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उनके दृश्य सक्षम बनाता है। टैग किए गए KIF5B प्रोटीन एक उम्मीदवार प्रोटीन वर्णक्रमीय गुण को उपयुक्त KIF5B टैग से अलग के साथ एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए के साथ सह व्यक्त किया जा सकता है। टैग प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में सीधे मनाया जाता हैप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत। Motorless KIF5B उत्परिवर्ती द्वारा उम्मीदवार प्रोटीन के एकत्रीकरण की प्रेरण की पुष्टि करेगा कि उम्मीदवार प्रोटीन KIF5B का इन विवो माल है। इसके अलावा, tdTomato टैग KIF5B प्रोटीन अंतर्जात कार्गो प्रोटीन पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं में अकेले व्यक्त किया जा सकता। बाद में, immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का आयोजन किया जाता है जिसमें ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं तय की और अंतर्जात उम्मीदवार प्रोटीन के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ संयुग्मित एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया। इस मामले में, अपनी शारीरिक स्तर पर अंतर्जात उम्मीदवार प्रोटीन का अध्ययन किया जाता है। अन्य मोटर प्रोटीन की इसी motorless म्यूटेंट उनकी cargos की पहचान करने के लिए तैयार किया जा सकता है।

Protocol

1. tdTomato टैग जंगली प्रकार और Motorless KIF5B प्रोटीन की क्लोनिंग

  1. मानव जंगली प्रकार और motorless KIF5B प्रोटीन तालिका 1 में प्राइमरों का उपयोग के लिए cDNAs बढ़ाना, Taq डीएनए पोलीमरेज़ (100 μl के लिए 5 इकाइयों), dNTP मिश्रण (2 प्रत्येक deoxynucleotide के लिए MM) और 30 चक्र के लिए अपने बफर 10X। प्रत्येक चक्र एक विकृतीकरण कदम (30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस), एक annealing कदम (30 सेकंड के लिए 45 डिग्री सेल्सियस) और एक विस्तार कदम (3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) के होते हैं।
  2. फिनोल / क्लोरोफॉर्म के बराबर मात्रा के साथ प्रवर्धित डीएनए उत्पाद निकालें (1: 1)।
    नोट: फिनोल दहनशील है और जलने का कारण बन सकता है। क्लोरोफॉर्म खतरनाक है। उन लोगों के साथ सीधे संपर्क से बचें और एक रासायनिक धूआं हुड के तहत उन्हें इस्तेमाल करते हैं। वैकल्पिक रूप से, पीसीआर उत्पादों को विभिन्न किट द्वारा शुद्ध किया जा सकता है।
    1. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में 18,000 XG पर स्पिन। एक नया ट्यूब जलीय समाधान स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा के साथ निकाल सकते हैं।
    2. स्पिन0.5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में 18,000 XG पर। एक नया ट्यूब जलीय समाधान स्थानांतरण।
    3. 3 एम ना-एसीटेट का दसवां मात्रा और पूर्ण इथेनॉल के दो संस्करणों के साथ जलीय घोल मिलाएं।
    4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में 18,000 XG पर स्पिन। जलीय समाधान त्यागें।
    5. 75% इथेनॉल के दो मात्रा के साथ डीएनए गोली धो लें। जलीय समाधान त्यागें और एयर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए गोली सूखी। 34 μl पानी में डीएनए गोली Resuspend।
  3. प्रतिबंध के साथ 40 μl के अंतिम मात्रा में परिलक्षित उत्पादों डाइजेस्ट sali (10 इकाइयों) और BamHI (10 इकाइयों) और दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उनकी 10X बफर के 4 μl एंजाइमों। एक agarose जेल में पचा उत्पादों (100 वी पर 1.0%) ethidium ब्रोमाइड (0.2 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त संकल्प।
    नोट: ethidium ब्रोमाइड एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है और त्वचा के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है। इसलिए, यह प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष संपर्क w से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैith ethidium ब्रोमाइड।
  4. कॉलम द्वारा शुद्धि के लिए सही बैंड बाहर कट। agarose डीएनए टुकड़ा युक्त जेल वजन। तब के बारे में 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर solubilization बफर (0.1 ग्राम के लिए 300 μl) में भंग।
  5. 5 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में एक कॉलम और स्पिन के परिणामस्वरूप समाधान जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  6. 1.5 कदम दोहरा द्वारा 0.5 मिलीलीटर solubilization बफर के साथ स्तंभ धो लें। 1.5 कदम दोहरा द्वारा 0.75 मिलीलीटर धो बफर के साथ फिर से स्तंभ धो लें। के लिए 2 मिनट शेष धो बफर से छुटकारा पाने के लिए स्तंभ स्पिन।
  7. 1.5 कदम दोहरा द्वारा 50 μl पानी के साथ डीएनए टुकड़ा Elute। एक agarose जेल (100 वी पर 1.0%) ethidium ब्रोमाइड (0.2 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त एक डीएनए आकार सीढ़ी के खिलाफ यह की एक विभाज्य चलाने के द्वारा डीएनए टुकड़ा की एकाग्रता का अनुमान है।
  8. PtdTomato-C1 वेक्टर 17 (लगभग 100 एनजी) पहले वीं के साथ पचा साथ शुद्ध उत्पादों (लगभग 100 एनजी) ligateई ही प्रतिबंध 16 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर टी -4 डीएनए ligase (2,000 इकाइयों) और 1 μl 10X बंधाव बफर का उपयोग 10 μl में एंजाइमों।
    नोट: जंगली प्रकार और motorless उत्परिवर्ती 2 से 963 और 584-963 के लिए अमीनो एसिड, क्रमशः में शामिल है। इससे पहले, एक बड़ा motorless KIF5B उत्परिवर्ती अपने कार्य 9 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक छोटे motorless KIF5B उत्परिवर्ती वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था इसकी अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाने के लिए।

2. immunofluorescence माइक्रोस्कोपी

  1. रहते सेल या कम से या 40X नीचे बढ़ाई साथ अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग, के लिए 1 एमएल पूरा मध्यम में .2-0,300,000 हेला कोशिकाओं बीज [Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ (DMEM) (एफबीएस)] एक के प्रत्येक कुएं में छह अच्छी तरह से थाली। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें।
  2. 40X ऊपर आवर्धन के साथ अप्रत्यक्ष immunofluorescence अध्ययन, कवर चश्मे धोने के लिए, पूर्ण इथेनॉल संक्षेप में और (18 मिमी x 18 मिमी मोटाई 1.5) उन में हवा सूखीएक छह अच्छी तरह से थाली के कुओं, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर संक्रमण से बचने के लिए।
    1. बीज .2-0,300,000 1 में कोशिकाओं को एक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में DMEM मध्यम पूरा मिलीलीटर।
  3. अभिकर्मक जटिल की तैयारी
    1. (PTagCFP-C-MYC 5 अगले दिन, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, पतला 0.6 माइक्रोग्राम प्रति एक मालवाहक उम्मीदवार प्रोटीन के लिए उपस्थिति या एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के अभाव में tdTomato टैग जंगली प्रकार या motorless KIF5B के लिए प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की (कुल) ) एक 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 0.1 मिलीलीटर अभिकर्मक माध्यम के साथ।
      नोट: वेक्टर pTagCFP-C-MYC TagCFP टैग सी-MYC व्यक्त करता है।
    2. एक और 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 0.1 मिलीलीटर अभिकर्मक मध्यम करने के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.8 μl जोड़ें। आमतौर पर, पतला अभिकर्मक अभिकर्मक 12 नमूने के लिए पर्याप्त के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    3. 5 मिनट के लिए सेते हैं, कमरे के तापमान पर।
    4. पतला 0.1 मिलीलीटर DNAs को पतला 0.1 मिलीलीटर अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें। Miनलियों inverting द्वारा एक्स सामग्री। एक microcentrifuge में 5 सेकंड के लिए ट्यूब स्पिन।
    5. 45 मिनट के लिए सेते हैं, कमरे के तापमान पर।
  4. प्रकोष्ठों की धुलाई
    1. अभिकर्मक जटिल के गठन के लिए ऊष्मायन अवधि के दौरान वरीयता प्राप्त कोशिकाओं फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार धोएं।
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के माध्यम से बदलें 0.8 मिलीलीटर पूर्व गर्म अभिकर्मक मध्यम। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें।
  5. कोशिकाओं के अभिकर्मक
    1. 45 मिनट की ऊष्मायन के बाद, थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर (2.3 कदम में तैयार) dropwise के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. 5 सेकंड के लिए धीरे 6 अच्छी तरह से थाली रॉक, इससे पहले कि वे 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर को लौट रहे हैं।
    3. 6-8 घंटे के बाद, पूरा DMEM माध्यम के साथ मध्यम जगह।
  6. लाइव सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग 18
    1. ऊष्मायन के एक एक अतिरिक्त 16 घंटे के बादटी 37 डिग्री सेल्सियस, 1 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए माध्यम के लिए डीएनए intercalating दाग Hoechst 33342 जोड़ें।
      नोट: 33342 Hoechst एक सेल पारगम्य, डीएनए intercalating डाई कि सेल नाभिक दाग है।
    2. उन्हें एक 40x उद्देश्य का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए की जांच से पहले 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को सेते हैं। DAPI, CFP, FITC और Cy3 के लिए फिल्टर सेट, क्रमशः (Ex350 एनएम / Em460 एनएम), (Ex436 एनएम / Em480 एनएम), (Ex470 एनएम / Em525 एनएम) और (Ex545 एनएम / Em605 एनएम)।
      नोट: पृष्ठभूमि पूरा DMEM माध्यम के ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण अधिक है, फिनोल लाल के बिना मध्यम प्रयोग किया जाता है।

3. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के लिए

  1. Paraformaldehyde समाधान की तैयारी
    1. paraformaldehyde पाउडर (100 मिलीलीटर प्रति पीबीएस 4 जी) वजन और पीबीएस में जोड़ें।
      नोट: Paraformaldehyde एक ज्वलनशील ठोस और एक संभावित कैंसर Hazar हैघ। यह आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा परेशान। इसलिए, यह paraformaldehyde के साथ संपर्क या साँस लेना से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. समाधान (150 μl 10 एन NaOH / 100 एमएल) के लिए NaOH जोड़ें।
    3. कभी-कभी झटकों के साथ 2-3 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 पर समाधान रखें।
    4. paraformaldehyde पाउडर के बाद समाधान के बारे में (75 μl / 100 एमएल) के लिए हिमनदों एसिटिक एसिड जोड़ने भंग कर रहा है से 7.0 पीएच को समायोजित करें।
  2. लक्ष्य प्रोटीन धुंधला
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए आगे ऊष्मायन के बाद, 5 सेकंड के लिए छह अच्छी तरह से थाली घूमता द्वारा पीबीएस के साथ एक बार कमरे के तापमान पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं धो लें।
    2. अच्छी तरह से प्रति हौसले से तैयार, 4% paraformaldehyde समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. एक बार 5 सेकंड छह अच्छी तरह से थाली के लिए घूमता द्वारा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। समाधान त्यागें।
    4. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.1% ट्राइटन एक्स 100 (पीबीएस में) के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। Detergent ट्राइटन एक्स 100 कोशिका झिल्ली permeabilize होगा उनके intracellular लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति।
    5. 5 सेकंड प्रत्येक समय के लिए छह अच्छी तरह से थाली घूमता द्वारा चार बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। प्रत्येक धोने के बाद समाधान त्यागें।
    6. 4 घंटे के लिए कमाल से कमरे के तापमान पर पीबीएस समाधान में एक 10% FBS में, (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल सी-MYC खरगोश एंटीबॉडी या P53 माउस एंटीबॉडी) प्राथमिक एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
    7. 5 सेकंड प्रत्येक समय के लिए छह अच्छी तरह से थाली घूमता द्वारा पीबीएस के साथ धोने चार बार। प्रत्येक धोने के बाद समाधान त्यागें।
    8. 2 घंटे के लिए कमाल से अंधेरे में कमरे के तापमान पर पीबीएस में 10% FBS में; (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित विरोधी खरगोश या विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी) फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर के साथ सेते हैं।
    9. 5 सेकंड प्रत्येक समय के लिए छह अच्छी तरह से थाली घूमता द्वारा पीबीएस के साथ धोने चार बार। प्रत्येक धोने के बाद समाधान त्यागें।
  3. परमाणु धुंधला और बढ़ते
      नोट: DAPI एक डीएनए intercalating डाई कि सेल नाभिक दाग है।
    1. प्रत्येक खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ते समाधान के 10 μl लागू करें। एक खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ते समाधान पर एक कांच कवर माउंट।
    2. अंधेरे में रात भर कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. नेल पॉलिश के साथ कवर चश्मे के किनारों को सील। एक धूआं हुड के अंदर अंधेरे में रात भर की जगह नेल पॉलिश धुएं हटा दें।
  4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 19
    1. अगले दिन, एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की जांच। DAPI, CFP, FITC और Cy3 के लिए फिल्टर सेट, क्रमशः (Ex350 एनएम / Em460 एनएम), (Ex436 एनएम / Em480 एनएम), (Ex470 एनएम / Em525 एनएम) और (Ex545 एनएम / Em605 एनएम)।

Representative Results

Exogenously जंगली प्रकार KIF5B, कोशिका द्रव्य में समान रूप से दिखाई दिया, जबकि सी-MYC नाभिक (चित्रा 1 ए) में मुख्य रूप से दिखाई दिया व्यक्त किया। हालांकि, motorless KIF5B उत्परिवर्ती गठन कोशिका द्रव्य (चित्रा 1 ए) में समुच्चय। motorless KIF5B का एकत्रीकरण सी-MYC के एकत्रीकरण प्रेरित किया। कोशिकाओं का प्रतिशत कोशिकाओं जंगली प्रकार KIF5B को व्यक्त करने में TagCFP टैग सी-MYC एकत्रित व्यक्त कम था। हालांकि, यह काफी अधिक है जब motorless KIF5B था सह व्यक्त (चित्रा 1 ए) था। (चित्रा 1) सी-MYC साथ उत्परिवर्ती KIF5B का मनाया सह स्थानीयकरण पता चलता है कि KIF5B सी-MYC की subcellular स्थानीयकरण नियंत्रित करता है और सी-MYC kinesin-1 के एक मालवाहक है। नकारात्मक नियंत्रण जिसमें निर्माणों अकेले व्यक्त किया गया चित्रा 1 ए के निचले पैनल में शामिल किए गए हैं। परिणाम बताते हैं प्रतिदीप्ति emissio का कोई महत्वपूर्ण खून के माध्यम से वहाँ गया था किएन। Motorless KIF5B भी अंतर्जात सी-MYC (चित्रा 1 बी) और प्रतिलेखन कारक P53 (चित्रा 2) के एकत्रीकरण प्रेरित है कि यह दर्शाता है सी-MYC और p53 दोनों kinesin-1 की cargos कर रहे हैं और दोनों KIF5B अंतर्जात प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण नियंत्रित करता है। साथ में परिणाम है कि kinesin-1 अवरोध दोनों सी-MYC और P53 5 के लिए बंगाल लैक्टोन (आरबीएल) उच्च आणविक भार प्रजातियों में से 20 लाती गठन के साथ गुलाब, P53 संभावना kinesin-1 के एक मालवाहक है। यह ध्यान रखें कि परमाणु प्रतिलेखन कारक P53, सी-MYC तरह, यह भी नाभिक से कोशिका द्रव्य को proteasomal गिरावट 21,22 के लिए निर्यात किया जाता है दिलचस्प है। KIF5B द्वारा प्रतिलेखन कारक के आंदोलन में विशिष्ट होने की वजह motorless KIF5B उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति subcellular स्थानीयकरण सी-Fos को प्रभावित नहीं किया है या यह कुल करने के लिए कारण (चित्रा 3) प्रकट होता है। उपरोक्त डेटा metho है कि प्रदर्शनइस प्रकाशन में कार्यरत डी kinesin-1 cargos के उच्च विशिष्टता की पहचान के लिए अनुमति देता है। इसी तरह की एक रणनीति के रूप में अच्छी तरह से अन्य मोटर प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: motorless KIF5B उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति कोशिका द्रव्य में सी-MYC एकत्रीकरण लाती है (ए) हेला कोशिकाओं tdTomato टैग जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) KIF5B (लाल) और TagCFP टैग सी-MYC (नीला) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे।। tdTomato टैग गुम्मट KIF5B जबकि TagCFP टैग सी-MYC नाभिक में मुख्य रूप से दिखाई दिया, कोशिका द्रव्य में मुख्य रूप से दिखाई दिया। हालांकि, tdTomato टैग motorless KIF5B उत्परिवर्ती (लाल) कोशिका द्रव्य में filamentous या कबरा समुच्चय का गठन किया। motorless KIF5B की अभिव्यक्ति सी-MYC के एकत्रीकरण प्रेरित किया। उत्परिवर्ती KIF5B और सी-MYC सह स्थानीय एक साथ (गुलाबी)। कोशिकाओं (%) सीएफपी-C-MYC (%) का समुच्चय के प्रतिशत का संकेत दिखाए जाते हैं। परिणाम के रूप में दिखाया जाता है± एसडी (एन = 3) मतलब है। tdTomato टैग KIF5B प्रोटीन या खाली वैक्टर (वी) के साथ-साथ TagCFP टैग सी-MYC की अभिव्यक्ति के साथ नकारात्मक नियंत्रण कम पैनल में दिखाया जाता है। (बी) इसी तरह के परिणाम अंतर्जात सी-MYC (हरा) जब tdTomato टैग गुम्मट या motorless KIF5B प्रोटीन (लाल) के साथ व्यक्त किया गया प्राप्त किया गया। tdTomato टैग motorless KIF5B उत्परिवर्ती गठन कोशिका द्रव्य में समुच्चय और प्रेरित अंतर्जात सी-MYC के एकत्रीकरण। समुच्चय के दोनों प्रकार के कोशिका द्रव्य (नारंगी) में एक साथ सह-स्थानीयकृत। नाभिक डाई Hoechst 33342 या DAPI के साथ दाग रहे थे। पैमाने पर पट्टी; 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: motorless KIF5B उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति लाती टी में अंतर्जात P53 एकत्रीकरणवह कोशिका द्रव्य। हेला कोशिकाओं में, बहिर्जात tdTomato टैग जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) KIF5B (लाल), कोशिका द्रव्य में मुख्य रूप से दिखाई दिया जबकि अंतर्जात P53 (हरा) नाभिक में मुख्य रूप से दिखाई दिया। इसके विपरीत, tdTomato टैग motorless KIF5B उत्परिवर्ती (लाल) का गठन कोशिका द्रव्य में समुच्चय। motorless KIF5B की अभिव्यक्ति P53 के एकत्रीकरण प्रेरित, कोशिका द्रव्य (पीला) में KIF5B के सह स्थानीयकरण और p53 में जिसके परिणामस्वरूप। तीन बार प्रयोग किया गया था। नाभिक डाई DAPI के साथ दाग रहे थे। पैमाने पर पट्टी; 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Motorless KIF5B उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति कोशिका द्रव्य में सी-Fos के एकत्रीकरण प्रेरित नहीं करता tdTomato टैग जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) KIF5B (लाल) दिखाई दियामुख्य रूप से हेला कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य, जबकि EGFP-C-Fos (हरा) नाभिक में मुख्य रूप से दिखाई दिया है। इसके विपरीत, tdTomato टैग motorless KIF5B उत्परिवर्ती (लाल) का गठन कोशिका द्रव्य में समुच्चय। motorless KIF5B की अभिव्यक्ति सी-Fos के एकत्रीकरण के लिए प्रेरित नहीं किया। प्रयोग में चार बार प्रदर्शन किया गया था। कोशिकाओं के नाभिक डाई DAPI के साथ दाग रहे थे। पैमाने पर पट्टी; 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आम रिवर्स प्राइमर 5'-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC -3 '
जंगली प्रकार KIF5B आगे प्राइमर 5'- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT -3 '
motorless KIF5B आगे प्राइमर 5'- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC -3 '

तालिका 1: जंगली प्रकार और motorless KIF5B प्रोटीन क्लोनिंग के लिए प्राइमर दृश्यों।

Discussion

विधि वर्णित motorless KIF5B उत्परिवर्ती, जो सूक्ष्मनलिकाएं साथ स्थानांतरित करने की क्षमता का अभाव है के गुणों का इस्तेमाल करता है, लेकिन जंगली प्रकार KIF5B साथ dimers के लिए फार्म और, इस प्रकार की अनुमति ही कार्गो प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता को बरकरार रखे हुए tetrameric प्रोटीन जंगली प्रकार KIF5B के रूप में। Motorless KIF5B, इसलिए, एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती रूपों और mislocalized अपने cargos के साथ समुच्चय के रूप में कार्य करता है। इस विधि (चित्रा 1) 5 kinesin-1 मालवाहक सी-MYC की पहचान करने के लिए साबित हो रहा है। इस लेख में, एक ही motorless KIF5B उत्परिवर्ती kinesin-1 का एक और संभावित माल (चित्रा 2) के रूप में P53 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इससे पता चलता है कि कार्यप्रणाली kinesin-1 के अन्य cargos की पहचान करने के लिए संभव है। इसके अलावा, उत्परिवर्ती की विशिष्टता नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन सी-Fos (चित्रा 3) पर उत्परिवर्ती के प्रभाव की कमी से प्रदान की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में, tdTomato टैग जंगली Tyपीई या motorless KIF5B प्रोटीन एक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग उम्मीदवार माल प्रोटीन के साथ coexpressed है। इस मामले में, रहते सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्रदर्शन कर रहे हैं। समुच्चय के गठन के समय चूक इमेजिंग से पता लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, tdTomato टैग प्रोटीन अकेले व्यक्त किया है और इसकी शारीरिक स्तर पर उम्मीदवार माल प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग अप्रत्यक्ष immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato इसकी चमक और photostability 17 के लिए चुना जाता है। पृष्ठभूमि पूरा DMEM माध्यम के ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण अधिक है, फिनोल लाल के बिना मध्यम प्रयोग किया जाता है।

motorless KIF5B उत्परिवर्ती जंगली प्रकार KIF5B stoichiometrically साथ dimers रूपों। इसलिए, यह जंगली प्रकार के समकक्ष के साथ dimers फार्म के लिए अपने कार्य को बाधित करने और समुच्चय के रूप में करने के लिए motorless KIF5B उत्परिवर्ती के लिए पर्याप्त मात्रा में व्यक्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस मुद्दे expr के अनुकूलन को संबोधित करने के लिए,motorless उत्परिवर्ती की ession आवश्यक है। यह dimerization डोमेन युक्त एक छोटे motorless उत्परिवर्ती का उपयोग करके हासिल की है। इसके अलावा, उचित अभिकर्मक अभिकर्मक और प्रोटोकॉल के अनुकूलन भी आवश्यक है। डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ हेला कोशिकाओं के ऊष्मायन की अवधि exogenous प्रोटीन और सेल व्यवहार्यता की अभिव्यक्ति के लिए हेला कोशिकाओं में अनुकूलित किया गया था। ऊष्मायन अवधि अन्य सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

40X के लिए 4X के बीच आवर्धन के लिए, कोई कवर चश्मा आवश्यक हैं। कोशिकाओं को सीधे कुओं में जांच की जा सकती है। इसलिए, इस मामले में, प्रोटोकॉल सस्ती और सुविधाजनक है। 40X ऊपर आवर्धन के लिए, कोशिकाओं कुओं में कवर चश्मे पर हो रहे हैं और, धुंधला के बाद, तेल विसर्जन उद्देश्यों के तहत परीक्षा के लिए खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ रहे हैं।

motorless KIF5B प्रोटीन का समुच्चय के अवलोकन कोशिका द्रव्य के आकार के द्वारा सीमित है। यह पता लगाने के लिए आसान हैकई स्तनधारी कोशिकाओं में समुच्चय। हालांकि, यह neuronal कोशिकाओं में समुच्चय निरीक्षण करने के लिए जब कोशिका द्रव्य की मात्रा नाभिक के चारों ओर और neurites में छोटा है अपेक्षाकृत मुश्किल है।

प्रोटोकॉल में विवो खमीर दो संकर और जैव रासायनिक पुल से नीचे assays 13-16 के अलावा KIF5B और उसके cargos के बीच सहयोग को दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन सभी assays के विभिन्न शारीरिक शर्तों के तहत संघ का निर्धारण और उनके परिणामों को एक दूसरे के पूरक कर सकते हैं। इसके अलावा, अन्य assays पर इस प्रतिदीप्ति परख का लाभ यह है कि यह KIF5B द्वारा cargos के subcellular स्थानीयकरण के विनियमन दिखा सकता है (1 आंकड़े और 2)।

प्रोटोकॉल KIF5B तक सीमित नहीं है और इस तरह के कुछ अन्य kinesin मोटर्स 3 और मायोसिन मोटर्स 23,24 cargos 3 के intracellular परिवहन में उपयोग के रूप में कुछ अन्य मोटर प्रोटीन, cargos की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। ये मोटर प्रोटीन भी kinesin मोटर्स और मायोसिन मोटर्स के लिए microfilaments, और oligomerization के लिए coiled-तार क्षेत्रों के लिए सूक्ष्मनलिकाएं साथ आंदोलन के लिए मोटर डोमेन होते हैं। उनमें से अधिकांश homodimers 3,23 के रूप में। इसलिए, एक समान रणनीति उनकी motorless प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट बनाने के लिए अपने cargos की पहचान करने से उन्हें लागू किया जा सकता है।

Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
absolute ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261
Opti-MEM-I (transfection medium) Life Technologies 51985
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961
formaldehyde, para Fisher Scientific O4042-500
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-500
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent Roche 6365787001
Taq DNA polymerase Life Technologies 10342020
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) Roche 12111424
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-541A
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder Life Technologies SM1333
PureLink Quick Gel Extraction kit Life Technologies K210012
BamHI New England Biolab R0136
SalI New England Biolab R0138
T4 DNA ligase  New England Biolab M0202T
Ethidium bromide Thermo Scientific 17898
DMEM Life Technologies 11995-065
c-MYC rabbit antibody Cell Signaling 5606
p53 mouse antibody Santa Cruz sc-126
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody Life Technologies A11008
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Life Technologies A11059
fluorescent microscope  Olympus IX71_Fluoview
computer software for imaging  cellSens 

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References

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जैव रसायन अंक 108 सी-MYC kinesin-1 KLC1 KIF5B kinesins myosins तस्करी प्रमुख नकारात्मक फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
Kinesin-1 cargos के पहचान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग
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Lee, C. M. Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (108), e53632, doi:10.3791/53632 (2016).

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