Summary
Här, är ett protokoll som presenteras för att identifiera Kinesin-1 last. En Motorfritt mutant av Kinesin-1 tung kedja (KIF5B) aggregat i cytoplasman och inducerar aggregation av dess last. Båda aggregaten upptäcks i fluorescensmikroskopi. En liknande strategi kan användas för att identifiera last av andra motorproteiner.
Introduction
Kinesin-1 är en motor protein som medierar anterograd transport av dess last 1,2. Det är en heterotetramer av de två underenheterna av Kinesin lätt kedja 1 (KLC1) och två subenheter av Kinesin tunga kedjor (KHCs). KIF5B 1, en KHC, innehåller en motor domän vid sin N-terminal, som hydrolyserar ATP och omvandlar den kemiska energin till mekanisk energi för rörelse längs mikrotubuli. Dess C-terminala region innehåller dimeriseringsdomän som interagerar med KLC1, som associerar med last. Kinesin-1 transporterar laster såsom vesiklar, organeller och mRNA 3,4. Nyligen var KIF5B visat att transportera kärntranskriptionsfaktorn c-MYC för proteosomal nedbrytning i cytoplasman 5. Tre metoder (kemisk inhibitor, siRNA / shRNA och dominant negativ mutant) användes för att inhibera Kinesin-1-funktionen. De alla inducerad aggregation av c-MYC i cytoplasman. För den sista metoden, var c-MYC endast påverkas av det dominerande negative mutant av KIF5B, men inte av den hos en annan relaterad KIF5A motorprotein, vilket tyder på att mutanten inte utövar allmänna effekter på de intracellulära komponenterna (såsom mikrotubuli störningar) eller på proteinaggregation. Den dominant negativ mutant av KIF5B inte heller påverka en annan transkriptionsfaktor, vilket tyder på att den inte utövar allmänna effekter på transkriptionsfaktorer. Snarare antyder det att den dominerande negativa mutanten utövar specifika effekter på dess last.
Användning av dominanta negativa mutanter är vanligt inom området för motorproteiner. Liknande Motorfritt mutanter av kinesiner och myosiner användes tidigare. De används främst för att visa effekterna av mutanterna på subcellulära lokaliseringar av deras last eller på cellulära funktioner 6-12. Mindre vikt lades på det rumsliga förhållandet mellan mutanterna och de laster som påverkas av dem. Men i vissa förekomster ades de mutanter observer att co-lokalisera med sina cargos 6,10.
Samspelet mellan KIF5B och dess associerade proteiner har tidigare bekräftats genom in vivo jäst två-hybridanalys och biokemiska rullgardins analyser såsom co-immunoprecipitation och i rullgardins vitro 13-16. I den här artikeln, är ytterligare en visuell metod som använder fluorescensmikroskopi beskrivs att identifiera KIF5B last proteiner. Metoden använder sig av en Motorfritt KIF5B mutant som fungerar som en dominant negativ mutant. Det aggregat i cytoplasman och inducerar aggregation av dess last.
Märkning av vildtyp och Motorfritt KIF5B mutant med det fluorescerande proteinet tdTomato 17 möjliggör deras visualisering med fluorescensmikroskopi. De taggade KIF5B proteinerna kan samuttryckas med en kandidatprotein sammansmält med en annan fluorescerande protein med spektralegenskaper separeras lämpligen från KIF5B taggen. De taggade proteinerna observeras direkt i levande cellerenligt fluorescensmikroskopi. Induktion av aggregering av kandidat protein genom Motorfritt KIF5B mutanten bekräftar att kandidatprotein är ett in vivo last av KIF5B. Vidare kan tdTomato-märkta KIF5B proteiner uttryckas ensam i cellerna för att studera effekterna på endogena last proteiner. Senare, är immunofluorescensmikroskopi genomföres i vilka de transfekterade cellerna fixeras och färgas med en specifik antikropp mot det endogena kandidatprotein, följt av en lämplig sekundär antikropp konjugerad med ett fluorescerande färgämne. I detta fall, studeras den endogena kandidatprotein på dess fysiologiska nivå. Liknande Motorfritt mutanter av andra motorproteiner kan vara beredd att identifiera sina laster.
Protocol
1. Kloning av tdTomato-taggade Vildtyp och Motorfritt KIF5B Proteiner
- Amplifiera cDNA för human vild-typ och Motorfritt KIF5B proteiner med användning av primrarna i tabell 1, Taq DNA-polymeras (5 enheter för 100 | j, l), dNTP-blandning (2 mM för varje deoxinukleotid) och dess 10X buffert under 30 cykler. Varje cykel består av ett denatureringssteg (95 ° C under 30 sek), ett härdningssteg (45 ° C under 30 sek) och ett förlängningssteg (72 ° C under 3 min).
- Extrahera den amplifierade DNA-produkten med lika stor volym fenol / kloroform (1: 1).
Obs: Fenol är brännbart och kan orsaka brännskador. Kloroform är farligt. Undvik direktkontakt med dem och använda dem under en dragskåp. Alternativt kan PCR-produkter renas med olika kit.- Snurra vid 18000 xg i en mikrocentrifug vid rumstemperatur under 1 min. Överför den vattenhaltiga lösningen till ett nytt rör och extraherades med en lika stor volym kloroform.
- Snurravid 18000 xg i en mikrocentrifug vid rumstemperatur under 0,5 min. Överför den vattenhaltiga lösningen till ett nytt rör.
- Blanda den vattenhaltiga lösningen med en tiondel volym av 3 M Na-acetat och två volymer absolut etanol.
- Snurra vid 18000 xg i en mikrocentrifug vid rumstemperatur under 5 min. Kassera den vattenhaltiga lösningen.
- Tvätta DNA-pelleten med två volym av 75% etanol. Häll bort vattenlösning och lufttorka DNA-pelleten vid rumstemperatur under 5 min. Resuspendera DNA-pelleten i 34 | il vatten.
- Smälta de amplifierade produkterna i en slutlig volym av 40 | j, l med restriktionsenzymerna Sall (10 enheter) och BamHI (10 enheter) och 4 | il av deras 10X buffert vid 37 ° C under två timmar. Lös de uppdelade produkterna i en agarosgel (1,0% vid 100 V) innehållande etidiumbromid (0,2 ^ g / ml).
Obs: Etidiumbromid är en potent mutagen och kan absorberas genom huden. Därför är det viktigt att undvika direkt eller indirekt kontakt wed etidiumbromid. - Klipp ut de korrekta banden för rening av kolumner. Väg agarosgelen innehållande DNA-fragmentet. Och lös upp den i solubiliseringsbuffert (300 pl för 0,1 g) vid 37 ° C under ca 20 min.
- Tillsätt resulte lösningen till en kolonn och körning i mikrocentrifug vid rumstemperatur under 5 sek. Kassera genomströmning.
- Tvätta kolonnen med 0,5 ml solubiliseringsbuffert genom att upprepa steg 1,5. Tvätta kolonnen igen med 0,75 ml tvättbuffert genom att upprepa steg 1,5. Snurra kolonnen i 2 min för att bli av med den återstående tvättbuffert.
- Eluera DNA-fragmentet med 50 | j, l vatten genom att upprepa steg 1,5. Uppskatta koncentrationen av DNA-fragmentet genom att köra en alikvot av den mot en DNA-storlek stege i en agarosgel (1,0% vid 100 V) innehållande etidiumbromid (0,2 ^ g / ml).
- Ligera renade produkter (ca 100 ng) med ptdTomato-C1 vektor 17 (ca 100 ng) som tidigare kluvits med the samma restriktionsenzymer i 10 ^ användning av T4-DNA-ligas (2000 enheter) och 1 pl 10X ligeringsbuffert vid rumstemperatur under 16 h.
Obs: vildtyp och Motorfritt mutant innehåller aminosyror från 2 till 963 och 584 till 963, respektive. Tidigare var en större Motorfritt KIF5B mutant används för att identifiera dess funktion 9. En mindre Motorfritt KIF5B mutant användes för föreliggande studier för att öka dess uttrycksnivåer.
2. immunofluorescensmikroskopi
- För live-cell eller indirekt fluorescens avbildning med förstoring på eller under 40X, utsäde 0,2-0,3 miljoner HeLa-celler i 1 ml fullständigt medium [Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS)] i varje brunn i en sex-brunnar. Växa vid 37 ° C med 5% CO2.
- För immunfluorescensstudier indirekta med förstoringar över 40X, tvätta täckglas (18 mm x 18 mm, 1,5 tjocklek) i absolut etanol kort och lufttorka dem ibrunnarna i en sex-brunnar, inuti en biosäkerhet skåp för att undvika kontaminering.
- Seed 0,2-0,3 miljoner celler i 1 ml fullständigt DMEM-medium i varje brunn i en sex-brunnar.
- Framställning av Transfektion Complex
- Nästa dag, inuti en biosäkerhet skåp, späd 0,6 ug (totalt) av expressionsplasmiden för tdTomato-märkt vildtyp eller Motorfritt KIF5B i närvaro eller frånvaro av en expressionsplasmid för en last kandidatprotein (pTagCFP-c-MYC 5 ) med 0,1 ml transfektion medium i en 1,6 ml mikrocentrifugrör.
Obs: Vektorn pTagCFP-c-MYC uttrycker TagCFP-märkta c-MYC. - Lägg 1,8 pl av transfektionsreagens till 0,1 ml transfektion medium i en annan 1,6 ml mikrocentrifugrör. Vanligtvis förbereda en mästare blandning av utspädd transfektionsreagens nog för 12 prover.
- Inkubera under 5 min, vid rumstemperatur.
- Lägga den utspädda 0,1 ml transfektion reagens till de utspädda 0,1 ml DNA. Mix innehållet genom att vända rören. Snurra rören under 5 sekunder i en mikrocentrifug.
- Inkubera i 45 min, vid rumstemperatur.
- Nästa dag, inuti en biosäkerhet skåp, späd 0,6 ug (totalt) av expressionsplasmiden för tdTomato-märkt vildtyp eller Motorfritt KIF5B i närvaro eller frånvaro av en expressionsplasmid för en last kandidatprotein (pTagCFP-c-MYC 5 ) med 0,1 ml transfektion medium i en 1,6 ml mikrocentrifugrör.
- Tvättning av celler
- Tvätta de ympade cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under inkubationsperioden för bildningen av transfektionen komplex.
- Ersätta mediet av de ympade cellerna i varje brunn med 0,8 ml förvärmd transfektion medel. Återgå plattorna till inkubatorn vid 37 ° C.
- Transfektion av celler
- Efter inkubering av 45 minuter, tillsätt 0,2 ml av DNA / transfektionsreagens komplex (framställd i steg 2,3) droppvis till varje brunn i plattan.
- Rock sex brunnar försiktigt i 5 sekunder, innan de återförs till inkubatorn vid 37 ° C.
- Efter 6-8 timmar, byt medium med hela DMEM-medium.
- För live-cell fluorescens avbildning 18
- Efter ytterligare 16 h inkubation ent 37 ° C, tillsätt DNA interkalerande fläcken Hoechst 33342 till mediet till en slutlig koncentration av 1 ^ M.
Notera: Hoechst 33342 är en cell-permeabel, DNA-interkalerande färgämne som färgar cellkärnorna. - Inkubera de transfekterade cellerna under 10 min i inkubatorn vid 37 ° C innan man undersöker dem för expression av fluorescerande proteiner genom fluorescerande mikroskopi med användning av ett 40X objektiv. Filteruppsättningar för DAPI, GFP, FITC och Cy3 är (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) och (Ex545 nm / Em605 nm), respektive.
Obs: Om bakgrunden är hög på grund av auto-fluorescens av hela DMEM-medium är medium utan fenolrött används.
- Efter ytterligare 16 h inkubation ent 37 ° C, tillsätt DNA interkalerande fläcken Hoechst 33342 till mediet till en slutlig koncentration av 1 ^ M.
3. För indirekt immunofluorescens studier
- Framställning av paraformaldehydlösning
- Väg paraformaldehyd pulver (4 g per 100 ml PBS) och lägga till PBS.
Obs: Paraformaldehyd är brandfarligt fast ämne och en potentiell cancer Hasard. Det irriterar ögonen, andningsorganen och huden. Därför är det viktigt att undvika kontakt med eller inandning av paraformaldehyd. - Lägga NaOH till lösningen (150 | j, l 10 N NaOH / 100 ml).
- Förvara lösningen vid 37 till 42 ° C under 2-3 h med skakning då och då.
- Justera pH till 7,0 genom tillsats av isättika till lösningen (ca 75 | j, l / 100 ml) efter att paraformaldehyd pulvret är upplöst.
- Väg paraformaldehyd pulver (4 g per 100 ml PBS) och lägga till PBS.
- Målproteiner Färgning
- Efter ytterligare inkubation under 16 h vid 37 ° C, tvätta de transfekterade cellerna vid rumstemperatur en gång med PBS genom att snurra den sex-brunnar i 5 sek.
- Fixera cellerna med 1 ml nyberedd, 4% paraformaldehydlösning per brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Tvätta cellerna med PBS en gång genom att snurra på fem sekunder sex brunnar. Kassera lösningen.
- Inkubera cellerna med 1 ml 0,1% Triton-X 100 (i PBS) vid rumstemperatur under 30 min. dETergent Triton-X 100 kommer permeabilize cellmembranet för att tillåta åtkomst av antikroppar till deras intracellulära mål.
- Tvätta cellerna med PBS fyra gånger genom att virvla den sex-brunnar under 5 sekunder varje gång. Kassera lösningen efter varje tvätt.
- Inkubera cellerna med 1 ml av primära antikroppar (c-MYC kaninantikropp eller p53 mus antikropp; 0,1 | j, g / ml) i en 10% FBS i PBS-lösning vid rumstemperatur genom att gunga under 4 timmar.
- Tvätta med PBS fyra gånger genom virvlande sex brunnar i 5 sekunder varje gång. Kassera lösningen efter varje tvätt.
- Inkubera med 1 ml fluorescerande färgämnes-konjugerad sekundära antikroppar (Alexa Fluor 488-konjugerad anti-kanin eller anti-mus-IgG-antikropp; 0,5 | j, g / ml) i 10% FBS i PBS vid rumstemperatur i mörker genom att gunga under 2 h.
- Tvätta med PBS fyra gånger genom virvlande sex brunnar i 5 sekunder varje gång. Kassera lösningen efter varje tvätt.
- Nukleär färgning och Montering
- Applicera 10 pl monteringslösning på varje objektglas. Montera varje täckglas över monteringslösning på ett objektglas.
- Inkubera vid rumstemperatur i mörker över natten.
- Försegla kanterna på täckglas med nagellack. Placera i mörker inuti ett dragskåp över natten för att avlägsna de nagellack ångor.
- Nästa dag, undersöka cellerna genom fluorescensmikroskopi med användning av en 40X objektiv. Filteruppsättningar för DAPI, GFP, FITC och Cy3 är (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) och (Ex545 nm / Em605 nm), respektive.
Representative Results
Exogent uttryckte vildtyp KIF5B verkade homogent i cytoplasman, medan c-MYC föll främst i kärnan (Figur 1A). Men bildade Motorfritt KIF5B mutanten aggregat i cytoplasman (Figur 1A). Aggregation av Motorfritt KIF5B inducerade aggregering av c-MYC. Procentandelen celler som uttrycker aggregeras TagCFP-märkt c-MYC i cellerna som uttrycker vildtyp KIF5B var låg. Det var dock betydligt högre när Motorfritt KIF5B samuttrycktes (Figur 1A). Den observerade sam-lokalisering av mutant KIF5B med c-MYC (figur 1) antyder att KIF5B reglerar subcellulära lokalisering av c-MYC och c-MYC är en last av Kinesin-1. Negativa kontroller i vilka konstruktionerna uttrycktes ensamt är inkluderade i den nedre panelen i figur 1A. Resultaten visar att det inte fanns någon signifikant genomblödning av fluorescens emission. Den Motorfritt KIF5B inducerade också aggregation av det endogena c-MYC (Figur 1B) och transkriptionsfaktom p53 (Figur 2), vilket indikerar att c-MYC och p53 är både laster av Kinesin-1 och KIF5B reglerar subcellulära lokalisering av både endogena proteiner. Tillsammans med de resultat som Kinesin-1-hämmare rose bengal lakton (RBL) 20 inducerar bildning av högmolekylära arter både c-MYC och p53 5, är p53 sannolikt en last av Kinesin-1. Det är intressant att notera att den nukleära transkriptionsfaktorn p53, som c-MYC, även exporteras från kärnan till cytoplasman för proteasomal nedbrytning 21,22. Rörelsen av transkriptionsfaktorer KIF5B verkar vara specifik eftersom uttrycket av Motorfritt KIF5B mutanten inte påverkade subcellulära lokalisering c-Fos eller få den att aggregera (Figur 3). Ovanstående data visar att metod som används i denna publikation möjliggör hög specificitet identifiering av Kinesin-1 last. En liknande strategi kan tillämpas på andra motorproteiner samt.
Figur 1: Uttryck av Motorfritt KIF5B mutanten inducerar c-MYC aggregation i cytoplasman (A) HeLa-celler transfekterades med tdTomato-märkt vildtyp (WT) KIF5B (röd) och TagCFP-märkt c-MYC (blå).. tdTomato-taggade WT KIF5B dök huvudsakligen i cytoplasman, medan TagCFP-märkta c-MYC dök huvudsakligen i kärnan. Emellertid tdTomato-märkta Motorfritt KIF5B mutant (röd) bildade filamentösa eller punktat aggregat i cytoplasman. Expression av Motorfritt KIF5B inducerade aggregering av c-MYC. Mutanten KIF5B och c-MYC samlokaliserade tillsammans (rosa). Procentandelar av celler (%) som indikerar aggregat av GFP-c-MYC (%) visas. Resultaten visas sommedelvärde ± SD (N = 3). Negativa kontroller med expressionen av tdTomato-etikette KIF5B proteiner eller TagCFP-taggade c-MYC tillsammans med tomma vektorer (V) visas i den undre panelen. (B) Liknande resultat erhölls med den endogena c-MYC (grön) när tdTomato-taggade WT eller Motorfritt KIF5B proteiner (röd) uttrycktes. Den tdTomato-taggade Motorfritt KIF5B mutant bildade aggregat i cytoplasman och inducerad aggregation av den endogena c-MYC. Båda typerna av aggregat samlokaliserade tillsammans i cytoplasman (orange). Kärnorna färgades med färgämnet Hoechst 33342 eller DAPI. Skalstock; 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Expression av Motorfritt KIF5B mutanten inducerar endogen p53 aggregation i than cytoplasman. I HeLa-celler, exogen tdTomato-märkt vildtyp (WT) KIF5B (röd) dök upp huvudsakligen i cytoplasman, medan den endogena p53 (grön) dök upp huvudsakligen i kärnan. I motsats härtill tdTomato-taggade Motorfritt KIF5B mutant (röd) bildade aggregat i cytoplasman. Expression av Motorfritt KIF5B inducerade aggregationen av p53, vilket resulterar i samlokalisering av KIF5B och p53 i cytoplasman (gul). Experimentet genomfördes tre gånger. Kärnorna färgades med färgämnet DAPI. Skalstock; 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Uttryck av Motorfritt KIF5B mutanten inte inducerar aggregation av c-Fos i cytoplasman tdTomato-märkt vildtyp (WT) KIF5B (röd) dök upphuvudsakligen i cytoplasman hos HeLa-celler, medan EGFP-c-Fos (grön) tycktes huvudsakligen i kärnan. Tvärtom den tdTomato-taggade Motorfritt KIF5B mutant (röd) bildade aggregat i cytoplasman. Expression av Motorfritt KIF5B inte inducerar aggregering av c-Fos. Experimentet genomfördes fyra gånger. Kärnorna hos cellerna färgades med färgämnet DAPI. Skalstock; 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| gemensamma omvänd primer | 5'-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 ' |
| vildtyp KIF5B framåtriktad primer | 5'- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 ' |
| Motorfritt KIF5B framåtriktad primer | 5'- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 ' |
"1"> Tabell 1: Primersekvenser för kloning av vild typ och Motorfritt KIF5B proteiner.
Discussion
Den metod som beskrivs utnyttjar egenskaperna hos den Motorfritt KIF5B mutanten, som saknar förmågan att röra sig längs de mikrotubuli, men bibehåller förmågan att bilda dimerer med vildtyp KIF5B och därigenom tillåta det tetramera proteinet att interagera med samma lastproteiner som vildtypen KIF5B. Motorfritt KIF5B därför verkar som en dominant negativ mutant och former mislocalized aggregat med dess last. Denna metod har visat sig identifiera Kinesin-en last c-MYC (figur 1) 5. I den här artikeln har samma Motorfritt KIF5B mutant som används för att identifiera p53 som en annan potentiell last av Kinesin-1 (Figur 2). Detta visar att den metod som är möjligt att identifiera andra laster av Kinesin-1. Vidare är specificiteten hos mutanten tillhandahålls av avsaknad av effekt av mutanten på det negativa kontrollproteinet c-Fos (Figur 3).
I detta protokoll, tdTomato-märkta vild tyPE eller Motorfritt KIF5B proteinet samuttrycks med ett annat fluorescerande protein-taggade last kandidatprotein. I detta fall är live-cell fluorescensmikroskopi och bildbehandling utförs. Bildningen av aggregat kan spåras genom time-lapse avbildning. Alternativt är den tdTomato-taggat protein som uttrycks ensamma och kandidaten last proteinet vid dess fysiologiska nivåer visualiseras genom indirekt immunofluorescens-mikroskopi med användning av specifika antikroppar. Det fluorescerande proteinet tdTomato väljs för dess ljusstyrka och fotostabilitet 17. Om bakgrunden är hög på grund av auto-fluorescens av fullständigt DMEM medium, medium utan fenolrött används.
Den Motorfritt KIF5B mutanten bildar dimerer med vildtyp KIF5B stökiometriskt. Därför är det viktigt att uttrycka tillräcklig mängd Motorfritt KIF5B mutant för att bilda dimerer med vildtyp motsvarighet att hämma dess funktion och att bilda aggregat. För att lösa detta problem, optimering av expression av Motorfritt mutanten är viktigt. Det uppnås genom att använda en liten Motorfritt mutant innehållande dimeriseringsdomän. Dessutom är det också nödvändigt optimering av den lämpliga transfektionsreagens och protokoll. Varaktigheten av inkubation av HeLa-celler med DNA / transfektionsreagens optimerades i HeLa-celler för expression av exogena proteiner och cellviabilitet. Inkubationen varaktighet kan behöva optimeras för andra cellinjer.
För förstoringar mellan 4X till 40X, inga täckglas krävs. Celler kan direkt undersökas i brunnarna. Därför, i detta fall, är det protokoll som billigt och bekvämt. För förstoringar över 40X celler odlas på täckglas i brunnarna och efter färgning, är monterade på objektglas för undersökning under oljeimmersions mål.
Observation av aggregat av Motorfritt KIF5B proteinet begränsas av storleken av cytoplasman. Det är lätt att detekteraaggregat i många däggdjursceller. Det är dock relativt svårt att observera aggregaten i neuronala celler när volymen av cytoplasman är liten runt kärnan och i neuriter.
Protokollet används för att visa sambandet mellan KIF5B och dess last utöver den in vivo jäst två-hybrid och biokemiska pull-down-analyser 13-16. Alla dessa analyser bestämma föreningen under olika fysiska förutsättningar och deras resultat kan komplettera varandra. Dessutom är fördelen med denna fluorescensanalys under andra analyser att det kan visa regleringen av subcellulära lokalisering av de laster genom KIF5B (figurerna 1 och 2).
Protokollet är inte begränsad till KIF5B och kan användas för att identifiera last av andra motorproteiner, såsom vissa andra kinesin motorer 3 och en del av de myosin motorerna 23,24 används i intracellulär transport av last 3. Dessa motorproteiner innehåller även motor domäner för rörelse längs mikrotubuli för kinesin motorer och microfilaments för myosin motorer och coiled-coil segment för oligomerisering. De flesta av dem bilda homodimerer 3,23. Därför kan en liknande strategi tillämpas på dem genom att skapa sina Motorfritt dominanta negativa mutanter för att identifiera sin last.
Disclosures
Fri tillgång publicering och produktion av den här artikeln betalas av Roche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
| formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
| Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
| PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
| PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
| BamHI | New England Biolab | R0136 | |
| SalI | New England Biolab | R0138 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
| Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
| p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
| fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
| computer software for imaging | cellSens |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Yu, Y., Feng, Y. M. The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy. Cancer. 116, 5150-5160 (2010).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Lee, C. M. Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm. Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).
- Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles. Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).
- Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1. J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).
- Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules. Biol Cell. 106, 57-71 (2014).
- Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels. Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).
- Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3. Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).
- Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments. Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).
- Zadeh, A. D., et al. Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel. J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).
- Su, Y. Y., et al. KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8. J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).
- Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B. . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).
- Cho, K. I., et al. Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function. Traffic. 8, 1722-1735 (2007).
- Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B. Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).
- Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening. Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).
- Zhang, Y., Xiong, Y. Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF. Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).
- Michael, D., Oren, M. The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system. Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).
- Kneussel, M., Wagner, W. Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics. Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).
- Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells. J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).
