Abstract
Storskala 2D-elektronmikroskopi (EM), eller nanotomy, er vevet bred anvendelse av nanoskala oppløsning elektronmikroskopi. Andre og vi har tidligere brukt i stor skala EM til menneskelig hud bukspyttkjertelen holmer, vev kultur og hele sebrafisk larver 1-7. Her beskriver vi en universelt anvendelig metode for vev-skala skanning EM for objektiv påvisning av sub-cellulære og molekylære funksjoner. Nanotomy ble brukt for å undersøke den sunne og en nevrodegenerativ sebrafisk hjernen. Vår metode er basert på standardiserte EM prøveopparbeidelse protokoller: Festes med glutaraldehyd og osmium, etterfulgt av epoxy-resin embedding, supertynn seksjonering og montering av supertynne-seksjoner på en-hulls nett, etterfulgt av innlegg farging med uranyl og bly. Storskala 2D EM mosaikkbilder er kjøpt med en scanning EM koblet til en ekstern stort område scan generator ved hjelp av scanning overføring EM (STEM). Storskala EM bilder er vanligvis ~ 5 - 50 G piksler In størrelse, og best med zoomable HTML-filer, som kan åpnes i en hvilken som helst nettleser, ligner online geografiske HTML kart. Denne fremgangsmåten kan anvendes på (human) vev, tverrsnitt av hele dyr, så vel som vevskultur 1-5. Her ble sebrafisk hjernene analysert i en ikke-invasiv neuronal ablasjon modell. Vi visualiserer innenfor et enkelt datasett vev, cellulære og subcellulære forandringer som kan kvantifiseres i forskjellige celletyper, inkludert neuroner og mikroglia, hjernens makrofager. I tillegg forenkler nanotomy korrelasjonen av EM med lysmikroskopi (CLEM) 8 på samme vev, som store overflatearealer som tidligere avbildes ved hjelp av fluorescerende mikroskopi, kan deretter bli utsatt for stort område EM, noe som resulterer i nano-anatomi (nanotomy) av vev. I alt kan nanotomy objektiv påvisning av funksjonene på EM-nivå i en vev-wide kvantifiserbar måte.
Introduction
Nye tekniske utviklingen har forbedret allsidighet, anvendelighet og kvantitativ natur EM, som fører til en gjenoppliving av ultra analyse. Fremskritt inkluderer 3D EM, storskala 2D EM og forbedrede metoder og reagenser korrelert lysmikroskopi og elektronmikroskopi (CLEM) for å sammenligne andre former for mikroskopisk analyse direkte til EM nivå 8-10. Storskala 2D EM er spesielt egnet til å kvantifisere eller identifisere (nye) sykdoms funksjoner for menneskelig patologi, studere dyremodeller for sykdom og vev kultur modeller. På grunn av den vanligvis lille synsfelt er det vanskelig å korrelere endringer i høy forstørrelse til et vev bred skala, så vel som til unbiasedly og kvantitativt analysere ultrastrukturelle egenskaper.
For patologisk analyse av menneskelig vev, eller vurderingen av patologi i dyremodeller, haematoxylin og eosin (H & E) farget deler av formaldehyd fast parafin innebygd (FFPE) tissue er standard. Foruten enkel H & E flekker immunolabeling er også utført for å identifisere patologiske forandringer. Dersom slike vev kunne analyseres ved EM-nivå, spesifikke celletyper, og subcellulære endringer kan bli identifisert. Den objektive natur stor skala EM gjør det mulig å finne uventede og nye trekk ved sykdommen. Ved store EM områder opp til kvadratmillimeter kan visualiseres. Vi og andre tidligere søkt nanotomy å rotte bukspyttkjertelen holmer 4, cellekultur 2, rottehjerne tre, hud og slimhinner 7 og hele sebrafisk larver 1,5 (www.nanotomy.org). Sebrafisk er godt egnet for in vivo avbildning, særlig i å visualisere celletyper som er vanskelig tilgjengelig i pattedyrvev, inkludert hjerneimmunceller 11. Her nanotomy fremgangsmåten er beskrevet i detalj, påsatt koronale seksjoner av sebrafisk hoder som gjennomgår betinget neuronal ablasjon ved omdannelse av metronidazol av neuronaluttrykt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle rådata presenteres som zoomable HTML-filer, visualisere molekylære til vev omfattende endringer. Presentasjonen av rådata gir deg objektive analyser av datasett fra andre vinkler av eksperter over hele verden.
Protocol
Alle eksperimenter med sebrafisk larver ble godkjent av forsøk med dyr Utvalget ved Universitetet i Groningen i henhold til nasjonale og EUs retningslinjer.
1. Prøvepreparering
- Fiksering og Inkludering
- Fiksering
- Bedøver fiskelarver i Tricaine (0,003%) tilsettes til E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) sebrafisk vann og test for anestesidybden ved å stikke forsiktig med en 200 mL pipette tips etter disseksjon mikroskop til bevegelse er ikke lenger registreres (figur 1A).
- Ved behandling av prøver for korrelerende EM etter anskaffe in vivo bildedata ved hjelp av konfokal eller to foton avbildning i 1,8% agarose som beskrevet, 5,15 fix larver i agarose ved å bruke 4% PFA i PBS inneholdende Triton-X-100 (0,05%).
- Skjær larver fra agarose og prosess forstorskala EM fem.
- Fiks larver i ferskvann 4% paraformaldehyd i PBS inneholdende Triton-X-100 (0,05%) i 2 timer ved romtemperatur i plastrør.
Merk: Celler dyrket i kultur (in vitro) kan være direkte festet i glutaraldehyd, som beskrevet i det neste trinn (1.1.1.5). - Fjern løsning og tilsett 100 ul 0,5% PFA, 2% glutaraldehyd (GA), og 0,1 M natriumkakodylat (pH 7,4). Oppbevar natten ved 4 ° C. Skyll prøver to ganger i 0,1 M natriumkakodylat.
- Skjær larve hoder rostrally til hindbrain å lette inntrengning av osmium. Bruk tynne sprøyter / tang.
- Postfix larver i 1% osmiumtetroksyd (OsO 4) /1.5% kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6]) i 0,1 M natriumkakodylat på is i to timer og skyll 3 x 5 min i dobbelt destillert H 2 O.
- Dehydrere i etanol ved 20 min inkubering i økende etanolkonsentrasjon (50%, 70%, 3 ganger 100%).
- embedding
- Forbered epoxy i henhold til standard oppskrifter som brukes i EM laboratorier.
Merk: Vi bruker epoksyharpiks som følger: Bland 19,8 g glycid eter 100, 9,6 g 2-Dodecenylsuccinic syreanhydrid og 11,4 g methylnadic anhydrid ved hjelp av en magnetrører. Tilsett 0,5 g DMP-30 (tris- (dimetylaminometyl) fenol) og bland igjen. - Inkuber larver over natten i 50% epoxyharpiks i etanol (v / v) under rotasjon (RT).
- Bytt fortynnet epoxy-resin med ren harpiks. Inkuber i 30 minutter, tilsett frisk harpiks på nytt og inkuberes i ytterligere 30 min. Igjen oppdaterer harpiksen og deretter inkubert 3 timer ved romtemperatur, etterfulgt av 15 minutter ved 58 ° C og ytterligere 1 time ved RT under lavt trykk (200 mbar).
- Orientere hoder i kommersielt tilgjengelige silisium flat innebygging formene under et mikroskop disseksjon ved hjelp av en nål eller tannpirker med den fremre vender mot den siden av støpeformen eller etter behov (Figur 1B).
- Polymer epoxy resi over natten ved 58 ° C. Hvis epoxy er fortsatt altfor myk tillate en annen dag å polymer og herde ved 58 ° C. Test stivhet ved å legge press med tang. Hvis dette lett later et innrykk tillate en annen dag å polymer og herde ved 58 ° C. Når prøven er fullstendig herdet videre til trimming og snitting.
- Klipp vekk overflødig resin fra stubb bruker barberblader (figur 1B).
- Forbered epoxy i henhold til standard oppskrifter som brukes i EM laboratorier.
- Fiksering
- Seksjonering, Kontrast, og Montering
- seksjonering
- § epoksyharpiks blokken ved hjelp av en ultramicrotome.
- Bruk et glass kniv eller en diamant histoknife å kutte semithin seksjoner (500 nm) for toluidinblått / basic fuksin (figur 1D) flekker å detektere riktig posisjonering.
- Overfør semi-tynne snitt på mikroskopiske lysbilder ved å plukke dem opp med et glass Pasteur pipette som spiss har vært stengt ved smelting i en flamme. Tørr på en varm plate until ikke vann som er igjen. Flekken i 10 sekunder med 1% toluidinblått i vann på en varm plate, og etter skylling med vann, flekk i 10 sek med 0,05% basiske fuksin i 1% natriumtetraborat. Undersøk med en vanlig lysmikroskop på 10X til 40X.
- Når den riktige området / orientering i hjernen er nådd, fortsetter seksjonering epoksyharpiksen blokk med en diamantkniv for å kutte ultratynne seksjoner (~ 70 nm; figur 1E)
- Bruk lett identifiserbare anatomiske strukturer i og rundt hjernen, inkludert lukte groper, øyne, grå-hvit substans grenser, for å identifisere regionen av interesse i løpet av supertynn seksjonering og justere snitte vinkel når prøven er skråstilt.
- Mount delen på ett spor L2 x 1 kobbernett (figur 1F), for å tillate oppkjøpet uforstyrret av gitter barer. Bruk Formvar belagt nett for å støtte seksjonene.
- kontrast
- Flekkesupertynne seksjoner på rutenettets i 2 minutter i 2% uranylacetat i metanol, fulgt av Reynolds bly-citrat i ytterligere 2 minutter 16.
- seksjonering
2. Image Acquisition
- Large Scale STEM
Merk: Vi bruker skanning EM med en ekstern skanning generator i stand til å skaffe flere store synsfelt med høy oppløsning 3,5,7,17 hjelp STEM deteksjon. Typisk er en bilde generert på denne måten tilsvarer områdene riss av ~ 100 transmisjonselektronmikroskop (TEM) bilder, noe som reduserer mengden av sømmen.- Montering Prøve i mikroskop
- Plasser rutenett med inndeling i flergitterprøveholderen og overføres inn i kammeret av SEM.
- Justering av STEM Detector
- Sett risten med prøven under bjelken og flytte den opp slik at det vil være ca. 5 mm fra linsen pol. Acquire et bilde på 20 kV hjelpi-linse detektor.
- Fokus på rutenettet kanten og justere arbeidsavstand til 4,0 mm.
- Flytt prøveholderen til et trygt sted og bringe i STEM detektor.
- Sentrer hullet på STEM detektor i bildefeltet ved å skru justeringsskruene mens bildebehandling ved maksimal hastighet med i-objektivet detektor.
- Nøye bringe tilbake prøven holder som bare vil passe mellom linsen pol og detektoren.
- Acquire et bilde med in-objektivet detektor for å være sikker på å være på den delen området.
- Bytt til STEM deteksjon (gevinst medium og alle kvadrantene satt på "minus") og få et bilde og velge området som skal skannes.
- Hev akselerasjon spenning til 21 kV og vente på stabilisering av strålen (stabilt bilde på nytt) og deretter gå til 29 kV i trinn på 2 kV.
- Anskaffelse Images
- Pre-bestråle prøven (for å hindre at lysstyrken endres som følge av e-bjelke) ved å zoomeut slik at hele området som skal skannes passer bildevinduet.
- Bytt åpning til 120 pm (for å holde den riktige dynamiske området detektor gevinster må reduseres ett trinn).
- De-fokus slik at bildet blir uskarpt.
- Gjør det skannede området så stramt som mulig ved hjelp av redusert areal skannealternativ.
- Sett skannehastighet slik at en ramme er skannet i ca.. 1 - 2 sek.
Merk: Avhengig av størrelsen og vev dette vanligvis tar ½ time (100 x 100 mikrometer FOV) til opp til tre timer (1000 x 500 mm). - Zoom inn minst 100X og skanne et lite område for 10 sek.
Merk: Når dette området ikke endrer lysstyrke i forhold til det omkringliggende, pre-bestråling er tilstrekkelig. - Bringe tilbake den 30 mikrometer blenderåpning (og STEM gevinst på middels)
- Fokus prøven.
- Juster blenderåpning med wobbler (på ~ 40,000X forstørrelse).
- Mens i fokus velge den letteste området / funksjonen, sett skannehastighet slik at detaljerer synlige.
- I mikroskop programvare justere lysstyrke og kontrast ved nøye å se på histogrammet for å holde alle piksler i det dynamiske området. Gjør det samme for de mørkeste området / funksjoner.
- Gå tilbake til det lyse området og sjekk igjen. Vær på den sikre siden, så det er litt plass på begge sider av histogrammet.
- Zoome ut slik at hele området som skal skannes passer bildevinduet, og starte det store området oppkjøpet programmet.
- Bruk veiviseren for å sette opp en mosaikk ved å velge et område fra skjermen. Bruk pikselstørrelse 2-5 nm avhengig av hva detaljer er nødvendig. Bruk holdetid 3 ms for STEM.
- Velg alternativ "autofokus på forrige tile", bruker stor skala oppkjøpet programvare autofokus med standard firmainnstillinger, sjekk boksen "bekrefte innstillingen før utførelse" og definere hvor du vil lagre dataene.
- Trykk på "optimalisere" for å sjekke mikroskop innstillinger.
Merk: Nå er tiden som trengs vil være shegen. Dette kan være opp til 72 timer for 1 x 0,5 mm områder. - I vinduet "maksimal flis oppløsning" type 20.000 så individuelle fliser ikke vil være større enn 20k x 20k, hindrer sløv kanteffekter. Trykk på "execute".
- Når spurt om å sjekke fokus og lysstyrke / kontrast (B / C), slå av ekstern skanning generator og nøye justere fokus og astigmatisme i mikroskop programvare. Ikke endre B / C.
Merk: Scenen kan flyttes og forstørrelse endret, men forstørrelse må settes tilbake til ønsket pikselstørrelse. - Slå på ekstern skanning generator igjen og trykk "fortsett".
- Montering Prøve i mikroskop
3. Data Analysis
- Åpne storskala EM file viewer program og åpne filen "mosaikk info". Dette vil åpne alle flislagte tif-filer. Dette fortrinnsvis utført på en annen arbeidsstasjon for å ikke hindre nye oppkjøp.
- Velg alternativet "auå sy hele mosaikk (parametere lapper modus på halvparten, søm terskel 0,90, støyreduksjon automatisk. Ved søm kriterier ikke kan oppfylles, zoome inn og manuelt legge fliser i posisjon og klikk "fortsette som den er").
- Eksporter som en html-fil, eller alternativt som en enkelt TIF.
Merk at for TIF eksportere en nedskalering kan være nødvendig. Ta den endelige pikselstørrelsen i filnavnet slik at målinger senere. - Utfør merknader i TIF-filen ved å åpne den i et bilderedigeringsprogram. Parallelt åpner zoomable html-filen i en nettleser for optimal oppløsning observasjon.
Representative Results
Storskala EM datasett av koronale deler av hodet til en uke gamle sebrafisk larver viser mange vev og cellulære funksjoner i en eneste stor skala bilde (www.nanotomy.org).
Nanotomy av kontroll hjerne seksjoner avslører typiske ultra funksjoner i nevrale vev av rostral brain inkludert duftfiberbunter, nevrale kjerner og nevrale underrommene inkludert synapser (figur 2A, www.nanotomy.org). Celletyper i hodet som kan skilles inkludere chondrocytes med store vakuoler i underkjeven, osmiophilic myelinet av olfactory nerveceller, endotelceller i en liten båt, strukturer inkluderer Meninx (sebrafisk motstykket til hjernehinnene, den membran lag encasing pattedyrhjernen). Subcellulære strukturer inkluderer glycocalyx av epidermis, ulike kjernefysiske morfologi og brennpunkter i ulike cel l typer og organeller, inkludert Golgi-apparatet, endoplasmatiske retikulum (ER), mitokondrier og synaptiske vesikler og post-synaptiske tettheter.
Uventet kjerner av celler som kler ventrikkelen er meget elektron tett sammenlignet med andre celler dispergert mer sideveis i hjernen. I tillegg er disse ventrikulære kjerner viser mørkt foci som er fraværende i andre celler i hjernen og vises forskjellige i størrelse og struktur fra heterochromatin, som finnes i kjernen av fagocytisk mikroglia (figur 2). Celler lining ventrikkelen i utviklingen av sebrafisk omfatter stort sett radial gliaceller og nevrale stamceller, som kan gjenspeile en endret kromatin tilstand enn mer differensierte celler. Som stamceller i vev er generelt ganske sjelden, for å korrelere nanotomy vev merking for stamcelle markører med vev skala EM vil derfor kunne brukes til å identifisere ultra trekk ved stamceller.
ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Storskala EM (www.nanotomy.org) av en koronale delen i en sebrafisk larve under nevronale ablasjon avslører mange spesifikke vev og cellulære og molekylære funksjoner som ikke finnes i kontrolldyrene. Cellular funksjoner inkluderer phagocytic microglia og vakuoler størrelsen på cellene, sannsynligvis representerer døende celler (figur 2B, www.nanotomy.org). Tidligere EM studier har identifisert microglia i virveldyr 18,19. Karakteristiske trekk microglia inkluderer langstrakte kjerner , klumper av usammenhengende kromatin ved siden av kjernefysiske konvolutten, fremtredende Golgi-apparatet, gratis polyribosomes, kornet endoplasmatisk retikulum (ER) med lang smal cisternae, relativt mørk / tett cytoplasma, og mange inneslutninger, for eksempel phagosomes, lipid dråper og lysosomer. Alle disse kjennetegnene, tilskrives microglia i pattedyr vev, ble også funnet i disse cellene i sebrafisk hjernen (figur 2B, www.nanotomy.org). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 1: Workflow av Storskala Tissue Elektronmikros på sebrafisk Brains. (A) 7 dager gammel sebrafisk larve. (B) sebrafisk larve hoder innleiret side ved side i epoksyharpiksen. (C) Glass kniv for semi -thin seksjonering og orienterings prøven. (D) Representative semithin toluidinblått farget snitt som viser to side-ved-side innleiret sebrafisk larver. (E) Diamond kniv til å skjære ultratynne (70 nm) seksjoner. (F) Redigert bilde i (D) av hel sebrafisk larve hjerne seksjon på ett hull rutenett for å indikere lokalisering. (G) mikros~~POS=TRUNC system som brukes for storskala 2D EM i denne studien. (H) Flyt av bildebehandling. klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2: Nanotomy Resultater:. Fra makromolekyl til Tissue (A) Nanotomy av hjernen til 7 dager etter befruktning kontroll og (B) som ble behandlet (nevronale ablasjon, figur 1), som viser funksjoner som er spesifikke for nevronale ablated degenerative hjerne (B) Disse omfatte fagocytiske mikroglia, mørke celler som gjennomgår celledød og svampaktig utseende av nervevev ((A) og (B)). Øvre paneler (tilpasset fra 5): 10X forstørrelse av området angitt i midten paneler. Midt paneler: 10X forstørrelse av området angitt i nedre paneler. (A, midtre panelet) Høy forstørrelse visning av neuropil viser synapse i (A, nedre panel), synaptiske vesikler (SVS) ogpostsynaptiske tetthet (PD). (B, Midt-panel) Høy forstørrelse visning av amoeboid microglia eller muligens en makrofag (midtre panelet M) viser typiske amoeboid mikrogliaceller funksjoner (nedre panel) inkludert fremtredende Golgi-apparatet (G), inneslutninger inkludert lysosomale vakuoler (L). Skala barer: 50 mikrometer (øverst), 5 mikrometer (midten) og 0,5 mikrometer (nederst). Dette tallet har blitt forandret fra fem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet , eller besøke den fullstendige data på nettet (nanotomy.org).
Discussion
EM tillater analyse av mobilnettet sammenheng med høy oppløsning av makromolekyler i biologisk sammenheng. Men dette vanligvis begrenser synsfeltet. Større skala 3D EM er spesielt egnet for kartlegging neuronal tilkobling ved å lage nanoskala oppløsning 3 dimensjonale rekonstruksjoner, som krever komplekse databehandlingen 10. I kontrast, krever 2D stor skala EM bare en enkelt seksjon og søm av imaging data, og vurdering av data er mulig av alle som har tilgang til en nettleser. Vi og andre tidligere brukt i stor skala EM å analysere vev og hele dyr. Som for de fleste nærmer seg, TEM og SEM-baserte sømmen har sine egne fordeler. Her ble scanning overføring EM (STEM) brukes som tillater generering av et stort synsfelt med høy oppløsning. Vanligvis er en STEM bilde tilsvarer de synsfelt på ca 100 TEM bilder, noe som reduserer mengden av sømmen når avbildning stor fields for mine synspunkter på høy oppløsning. Ved høyere oppløsning er nødvendig, kan TEM være fordelaktig. STEM har den fordel i TEM at ikke-kontras prøver kan brukes med god kontrast ultra 6.
I tillegg kan fremgangsmåten som er beskrevet her ganske enkelt justeres for bruk med ryggen spredt elektron deteksjon (BSD) på seksjoner montert på silika wafere, og utvider bruken av flere mikroskop systemer. HTML-zoomable vev EM-filer er svært nyttig for kvantifisering, deling av data som kanskje ikke har blitt analysert til sin fulle innhold, som kombinerer LM og EM-data (Clem) 8, presentasjon formål i vitenskapelig forskning, for å analysere pasientdata, og for utdanning. Alternativt kan i stor skala EM i et SEM, men ikke i en TEM, silika wafere kan brukes, som har to hovedfordeler: BSD kan anvendes, som mer generelt er tilgjengelig på skanning elektronmikroskop enn STEM deteksjon. Second, montering av store deler (> 1 mm 2 områder avrenter) er grei. Montering på enkle avlange nett er arbeidskrevende og teknisk utfordrende. Detaljert sammenligning mellom TEM, SEM og STEM er detaljert andre steder 6. En ulempe med BSD bildebehandling er at, i forhold til stammen, bildene har økt støy. Dette kan delvis kompenseres ved å øke oppholdstiden piksel, noe som resulterer i mye lengre innhentingstider.
Selv for prøveopparbeidelse relativt standard EM behandling (fiksering, forankring og seksjonering) er nødvendig for 5-7, er det teknisk utfordrende å kutte store supertynne seksjoner helt blottet for gjenstander. Snittene er svært skjøre, kan lett brekke, brett eller blir ødelagt under bildebehandling, noe som vanligvis tar flere timer per datasett. Men på grunn av den elektroniske deling av rå objektive data, bør det bli mulig å sammenligne lettere til publiserte data, og bruke publisert datasett i det åpne domenet som kontroller. Foreløpig er det få EM-enheter i stand til å large-skala analyse er i bruk, og derfor tilgjengeligheten til denne teknikken er noe begrenset, men de fleste bildebehandlingssentre velkommen samarbeidstiltak.
For store deler vevet må være skikkelig festet hele prøven. Det er derfor en blanding av rask, men moderat fikseringsmiddel PFA blir brukt i kombinasjon med den langsomme, men sterk fikseringsmiddel GA. Kutting og plukke opp store deler uten artefakter er vanskelig. Arbeide med wafere i kombinasjon med BSD er enklere i forhold til å samle deler på ett hull nett. Heavy metal post farging er mer kritisk i forhold til klassisk EM. Siden hele delen er fotografert hver artefakt vil være synlig. TEM brukere vanligvis finner det vanskelig å bytte til en SEM, på grunn av forskjellen i mikroskopet drift.
Kvantifisering og deling av data - Kvantifisering subcellulære funksjoner er vanskelig i enkelt EM bilder. Muligheten for å zoome inn og ut av storskalabilder lar lett identifikasjon av celler av interesse, som kan følges av nanoskala målinger inne i cellene. Disse datasettene viser at spesifikke celletyper kan raskt identifisert og kvantifisert på en saklig måte i disse store vevssnitt, basert på funksjoner påvisbare på ulike skalaer. For eksempel mikroglia kan identifiseres basert på deres morfologi og tett cytoplasma. Deretter, når du zoomer inn på de enkelte cellene, nanoskala subcellulære og molekylære funksjoner av disse cellene kan måles innenfor samme datasettet, som vi tidligere har vist mot ER bredde i en stor skala EM vev kultur datasett 2. En ekstra fordel med nanotomy er at hosting av store datasett på nettet vil tillate andre å inspisere data, kanskje for andre funksjoner, og trekke sine konklusjoner på ny hypotese.
CLEM - I tillegg til å legge til rette for kvantitativ EM, stor skala EM gjør det enklere å korrelere lys mikroskop,pic merking til EM nivå 8. I det foreliggende eksempel er vist tilstedeværelse av fagocyterende mikroglia i en sebrafisk ablasjon modell. Et viktig spørsmål i nevrovitenskap er hva de enkelte funksjoner og bidrag er av microglia og potensielle andre kilder til phagocytic og immunceller. Tidlige EM studier har vist karakteristiske subcellulære trekk ved microglia i sykdoms 18. Uheldigvis er det vanskelig å selektivt merke mikroglia spesielt i en patologisk innstilling, da de oppviser stor overlapping med andre immunceller i genekspresjon, morfologi og funksjon. Derfor er det uklart om og når microglia på ultra nivå skiller seg fra immunceller fra andre kilder, inkludert monocytter utledet infiltrere makrofager. Forståelse om det er ultra forskjeller mellom disse cellene vil gi et startpunkt for analyse av funksjonelle forskjeller. Kombinere selektive transgene eller uttrykk markører og CLEM tillater Fondetection av ultra funksjoner selektiv til bestemte befolkningsgrupper.
Diagnose og presentasjon og utdanning - Ved å visualisere nanonivå til mikro innenfor et enkelt datasett EM data er sterkt tilrettelagt for et bredt publikum. Med de økte muligheter og verktøy for samsvar og storskala EM forventer vi en tilbakevending til EM i grunnleggende og medisinsk forskning. Vår metode representert her er brukt til en sebrafisk hjerneskade modell 5, men er blitt brukt på menneskelig vev 7, rottehjerne 3, i en rottemodell for diabetes 4 og i cellekultur 2, og kan også brukes i kombinasjon med en TEM -basert metode 1 viser allsidigheten av denne metoden. Mikroskopet operatøren ikke lenger opptak høyt valgt, og dermed partisk bilder, men alle tallrike ultra funksjoner blir registrert og åpent for hele verden analyse.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Flertallet av arbeidet har blitt utført ved den UMCG Mikroskopi og Imaging Center (UMIC), som er sponset av NWO 175-010-2009-023 og ZonMW 91111006; STW "Mikros dalen 12718" til BNGG. Dette arbeidet ble sponset av en ZonMW VENI stipend, et Marie Curie karriere integreringstilskuddet (sparer døende nevroner) og en Alzheimers Nederland fellesskap å TJvH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| triton-X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodium tetraborate | Merck | 1063808 | |
| toluidene blue | Merck | 1273 | |
| basic fuchsin | BDH | 340324 | |
| lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| atlas external scan generator | Fibics |
References
- Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
- Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
- Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
- van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
- Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
- Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
- Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).
