Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Großflächige 2D-Elektronenmikroskopie (EM) oder nanotomy ist das Gewebe weite Anwendung nanoskaliger Auflösung Elektronenmikroskopie. Andere und wir bisher angewandten großen Maßstab EM auf die menschliche Haut Pankreasinseln, Gewebekultur und ganze Zebrabärblingembryonen 1-7. Hier beschreiben wir ein universell anwendbares Verfahren für das Tissue-Skala Scanning EM für unvoreingenommene Erkennung von Unter zellulären und molekularen Eigenschaften. Nanotomy wurde angewendet, um die gesunde und eine neurodegenerative cerebra- zu untersuchen. Unsere Methode basiert auf standardisierten EM Probenvorbereitung Protokolle: Fixierung mit Glutaraldehyd und Osmium, gefolgt von Epoxy-Harz Einbettung, Ultradünnschnitt und Montage von ultra-dünnen Schnitte auf ein Lochgitter, gefolgt von Post-Färbung mit Uranylacetat und Blei. Großflächige 2D-EM Mosaikbilder werden mit einem Scannen erfassten EM an einen externen großen Bereich Scan-Generator mit Raster-Transmissions-EM verbunden (STEM). Groß angelegte EM-Bilder sind in der Regel ~ 5-50 G Pixel in Größe und am besten mit diesen zoombaren HTML-Dateien, die in einem beliebigen Web-Browser, ähnlich wie Online-geographischen HTML Karten geöffnet werden kann. Dieses Verfahren kann auf (human) Gewebe, Querschnitte von ganzen Tieren angewendet werden , sowie Gewebekultur 1-5. Hier Zebrabärbling Gehirne wurden in einer nicht-invasiven Ablation neuronalen Modell analysiert. Wir visualisieren innerhalb eines einzigen Datensatzes Gewebe, zellulärer und subzellulärer Veränderungen, die in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen und Mikroglia quantifiziert werden können, die Makrophagen des Gehirns. Zusätzlich nanotomy die Korrelation von EM mit Lichtmikroskopie (CLEM) 8 auf dem gleichen Gewebe erleichtert, da große Oberflächenbereiche zuvor Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, können anschließend in großen Bereich EM unterzogen werden, was in der Nano Anatomie (nanotomy) von Gewebe. Insgesamt ermöglicht nanotomy unvoreingenommene Erkennung von Features auf EM-Ebene in einem Gewebe weiten quantifizierbare Weise.
Neue technische Entwicklungen haben die Vielseitigkeit, die Anwendbarkeit und quantitative Natur der EM verbessert, was zu einer Wiederbelebung der Ultrastrukturanalyse führt. Die Fortschritte sind 3D – EM, in großem Maßstab 2D – EM und verbesserte Verfahren und Reagenzien für korrelierte Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (CLEM) andere Formen der mikroskopischen Analyse zum Vergleich direkt auf die EM – Ebene 8-10. Großflächige 2D-EM ist besonders geeignet zu quantifizieren oder (Roman) Krankheit Merkmale für die menschliche Pathologie identifizieren, Tiermodelle für Krankheiten und Gewebekulturmodelle untersuchen. Aufgrund der typischerweise kleinen Sichtfeld ist es schwierig, Veränderungen bei hoher Vergrößerung an ein Gewebe breiten Skala zu korrelieren, sowie unbiasedly und quantitativ ultrastrukturelle Merkmale analysieren.
Für pathologische Analyse von menschlichem Gewebe oder die Beurteilung der Pathologie in Tiermodellen, Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt Abschnitte von fixierten und in Paraffin eingebettet Formaldehyd (FFPE) tissue ist der Standard. Neben einfachen H & E-Färbung Immunmarkierung auch zur Identifizierung pathologischen Anomalien durchgeführt. Wenn solche Gewebe an der EM-Ebene, spezifische Zelltypen untersucht werden konnten, und subzellulären Veränderungen identifiziert werden konnten. Die unvoreingenommene Art von großen EM ermöglicht unerwartete und neuartige Merkmale der Krankheit zu finden. Durch groß angelegte EM Bereiche Quadratmillimetern können sichtbar gemacht werden. Wir und andere vorher nanotomy angewendet Pankreasinseln 4, Zellkultur 2, Rattenhirn 3, Haut und Schleimhaut 7 und ganze Zebrabärblingembryonen 1,5 (www.nanotomy.org) an Ratten. Zebrabärblinge sind sehr gut geeignet für in – vivo – Bildgebung, in besonders Zelltypen zu visualisieren, die den Zugang in Säugetiergewebe schwer einschließlich Gehirn Immunzellen 11. Hier ist die nanotomy Verfahren wird im Detail beschrieben, angewandt auf Koronalschnitte von Zebrabärbling Köpfe unterzogen bedingten neuronalen Ablation durch Umwandlung von Metronidazol durch neuronaleausgedrückt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle Rohdaten werden als zoombare HTML-Dateien vorgestellt, um Änderungen Gewebe Skala molekularen Visualisierung. Die Darstellung der Rohdaten ermöglicht unvoreingenommene Analysen der Datensätze aus anderen Winkeln von Experten weltweit.
EM ermöglicht die Analyse von zellulären Kontext mit hochauflösende Abbildung von Makromolekülen in biologischen Kontext. Dies schränkt jedoch typischerweise das Sichtfeld. Größere angelegte 3D – EM ist besonders geeignet für die Zuordnung neuronaler Konnektivität durch nanoskalige Auflösung 3 – dimensionale Rekonstruktion zu schaffen, erfordern komplexe Datenverarbeitung 10. Im Gegensatz dazu 2D großen Maßstab EM erfordert nur einen einzigen Abschnitt und Nähen der Abbildungsdaten, und die Beurteilung der Daten ist möglich, indem jeder, der Zugang zu einem Internet-Browser. Wir und andere bisher in großem Maßstab EM verwendeten Gewebe und ganze Tiere zu analysieren. Wie für die meisten Ansätze, TEM und SEM-basierte Nähte haben ihre eigenen Vorteile. Hier scanning transmission EM (STEM) verwendet, die mit einer hohen Auflösung Erzeugung einer großen Sichtfeld ermöglicht. Typischerweise ist ein STEM Bild auf die Sichtfelder von etwa 100 TEM-Bilder äquivalent, signifikant die Menge an Naht verringert wird, wenn große fiel Abbildends Sicht bei hoher Auflösung. Wenn eine höhere Auflösung benötigt wird, kann TEM vorteilhaft sein. STEM hat den Vorteil gegenüber TEM , dass nicht-kontrastiert Proben mit guter ultra Kontrast 6 verwendet werden.
Zusätzlich kann das hier beschriebene Verfahren einfach für mit rückgestreute Elektronendetektion (BSD) Verwendung eingestellt werden auf Abschnitten auf Silica Wafer angebracht ist, die Verwendung auf mehrere Mikroskopsysteme zu erweitern. HTML-zoombaren Gewebe EM – Dateien sind sehr nützlich für die Quantifizierung, gemeinsame Nutzung von Daten , die zu seinem vollen Inhalt kann nicht analysiert wurden, LM und EM – Daten (CLEM) 8, Präsentationszwecke in der wissenschaftlichen Forschung kombiniert, um Patientendaten zu analysieren und für die Bildung. Alternativ kann in EM Groß in einem SEM, aber nicht in einem TEM, Silica Wafer können verwendet werden, was zwei Vorteile hat: BSD verwendet werden kann, die auf Rasterelektronenmikroskopen als STEM Detektions allgemein verfügbar ist. Zweitens Montage großer Teile (> 1 mm 2 BereichenInteresse) ist einfach. Montage auf einzelnen geschlitzten Gittern ist arbeitsintensiv und technisch anspruchsvoll. Detaillierter Vergleich zwischen TEM, SEM und STEM ist an anderer Stelle 6 detailliert beschrieben. Ein Nachteil der BSD-Bildgebung ist, dass STEM verglichen, Bilder haben erhöhtes Rauschen. Dies kann teilweise durch Erhöhen der Pixel-Verweilzeit ausgeglichen werden, was zu einer viel längeren Erfassungszeiten.
Obwohl für die Probenvorbereitung relativ Standard EM Verarbeitung (Fixierung, Einbettung und Schneiden) 5-7 benötigt wird, ist es technisch anspruchsvolle große ultradünne Schnitte völlig frei von Artefakten zu schneiden. Abschnitte sind sehr zerbrechlich, leicht brechen, falten oder während der Bildgebung zerstört, die in der Regel mehrere Stunden pro-Datensatz erfolgt. Da jedoch der Online-Sharing der rohen unvoreingenommene Daten sollte es möglich werden, leichter zu veröffentlichten Daten zu vergleichen und veröffentlichten Daten-Set in der offenen Domäne als Kontrollen verwendet werden. Derzeit einige EM-Geräte der Lage, large-Scale-Analyse sind im Einsatz, und daher Zugang zu dieser Technik ist etwas begrenzt, obwohl die meisten Imaging-Zentren gemeinsamen Bemühungen begrüßen.
Für großflächige Abschnitte hat das Gewebe richtig in der gesamten Probe zu fixieren. Deshalb ist eine Mischung aus dem schnellen, aber moderate Fixativ PFA in Kombination mit der langsamen, aber starke Fixiermittel GA verwendet wird. Schneiden und Aufnehmen von großen Teilen ohne Artefakte ist schwierig. Arbeiten mit Wafern in Kombination mit BSD ist einfacher, im Vergleich zu den Abschnitten auf einzelne Lochgitter zu sammeln. Schwermetallpfosten Färbung ist kritischer Vergleich zu klassischen EM. Da der ganze Abschnitt jedes Artefakt wird sichtbar abgebildet wird. TEM Benutzer typischerweise finden es schwierig, ein SEM zu wechseln, wegen des Unterschieds in Mikroskopbetrieb.
Quantifizierung und gemeinsame Nutzung von Daten – subzellulärer Funktionen Quantifizieren in einzelnen EM Bilder schwierig ist. Die Möglichkeit, zu vergrößern und aus GroßBilder können leicht Identifizierung von Zellen von Interesse, die von nanoskaligen Messungen innerhalb der Zellen folgen kann. Diese Datensätze zeigen, dass bestimmte Zelltypen können schnell in diesen großen Gewebeschnitten in unvoreingenommen identifiziert und quantifiziert werden, basierend auf Eigenschaften nachweisbar in verschiedenen Maßstäben. Beispielsweise Mikroglia können auf der Grundlage ihrer Morphologie und dichten Zytoplasma identifiziert werden. Anschließend, auf auf die einzelnen Zellen Zoomen, nanoskaligen subzellulärer und molekularen Eigenschaften dieser Zellen innerhalb des gleichen Datensatzes gemessen werden, wie wir zuvor für ER Breite in einem großen Maßstab EM Gewebekultur – Datensatz 2 gezeigt. Ein zusätzlicher Vorteil der nanotomy ist, dass Online von großen Datenmengen Hosting erlauben anderen, um die Daten zu überprüfen, vielleicht für andere Funktionen, und ihre Schlussfolgerungen zu neuen Hypothese ziehen.
Clem – Zusätzlich zur Erleichterung der quantitativen EM, EM in großem Maßstab macht es einfacher , Licht microsco zu korrelierenpic Kennzeichnung EM Level 8. Im vorliegenden Beispiel wird das Vorhandensein von phagozytischen Mikroglia in einem Zebrabärbling Ablation Modell gezeigt. Eine wichtige Frage in den Neurowissenschaften ist es, was die einzelnen Funktionen und Beiträge sind von Mikroglia und mögliche andere Quellen von phagozytischen und Immunzellen. Frühe EM Studien haben unterscheidenden subzellulären Eigenschaften der Mikroglia bei Krankheit 18 gezeigt. Leider ist es schwierig, selektiv Mikroglia insbesondere in einem pathologischen Einstellung bezeichnen, da sie große Überlappung mit anderen Immunzellen in der Genexpression, der Morphologie und Funktion aufweisen. Daher ist es unklar, ob und wann Mikroglia auf ultrastruktureller Ebene unterscheiden sich von Immunzellen aus anderen Quellen, einschließlich Monozyten-Makrophagen abgeleiteten infiltrieren. Zu verstehen, ob es ultrastrukturellen Unterschiede zwischen diesen Zellen wird ein Ausgangspunkt für die Analyse der funktionellen Unterschiede. Die Kombination von selektiven transgenen oder Expression-Markern und Clem ermöglicht detection von ultrastrukturelle Merkmale selektiv auf bestimmte Bevölkerungsgruppen.
Diagnose und Präsentation und Bildung – durch nanoskalige Visualisierung innerhalb eines einzelnen Datensatzes EM Daten zu mikroskaligen stark an ein breites Publikum erleichtert. Mit den erweiterten Möglichkeiten und Werkzeuge für die korrelative und groß angelegte EM erwarten wir eine Belebung der EM in der Grundlagen- und medizinischen Forschung. Unsere Methode , die hier dargestellt ist , an einen Zebrabärbling Hirnverletzung Modell angewendet 5, hat aber auf die menschliche Gewebe 7, Rattenhirn 3, in einem Rattenmodell für Diabetes 4 und in Zellkultur – 2, und kann auch verwendet werden in Kombination mit einem TEM verwendet -basierte Ansatz 1 die Vielseitigkeit dieses Verfahrens zeigt. Das Mikroskop Bediener nicht mehr die Aufzeichnung hoch ausgewählt, und daher voreingenommen Bilder, aber alle zahlreiche ultrastrukturelle Merkmale erfasst und offen für die weltweite Analyse.
The authors have nothing to disclose.
Die Mehrheit der Arbeit wurde an der UMCG Mikroskopie und Imaging Center (UMIC) durchgeführt, die von NWO 175-010-2009-023 und ZonMW 91.111.006 gefördert wird; STW "Mikroskopie-Tal 12718" zu BNGG. Diese Arbeit wurde von einem ZonMW VENI Zuschuss gefördert, eine Marie-Curie-Karriere Eingliederungszuschuss (Einsparung sterbende Neuronen) und einer Alzheimer Nederland Gemeinschaft zu TJvH
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |