Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Storskala 2D-elektronmikroskopi (EM), eller nanotomy, er vevet bred anvendelse av nanoskala oppløsning elektronmikroskopi. Andre og vi har tidligere brukt i stor skala EM til menneskelig hud bukspyttkjertelen holmer, vev kultur og hele sebrafisk larver 1-7. Her beskriver vi en universelt anvendelig metode for vev-skala skanning EM for objektiv påvisning av sub-cellulære og molekylære funksjoner. Nanotomy ble brukt for å undersøke den sunne og en nevrodegenerativ sebrafisk hjernen. Vår metode er basert på standardiserte EM prøveopparbeidelse protokoller: Festes med glutaraldehyd og osmium, etterfulgt av epoxy-resin embedding, supertynn seksjonering og montering av supertynne-seksjoner på en-hulls nett, etterfulgt av innlegg farging med uranyl og bly. Storskala 2D EM mosaikkbilder er kjøpt med en scanning EM koblet til en ekstern stort område scan generator ved hjelp av scanning overføring EM (STEM). Storskala EM bilder er vanligvis ~ 5 – 50 G piksler In størrelse, og best med zoomable HTML-filer, som kan åpnes i en hvilken som helst nettleser, ligner online geografiske HTML kart. Denne fremgangsmåten kan anvendes på (human) vev, tverrsnitt av hele dyr, så vel som vevskultur 1-5. Her ble sebrafisk hjernene analysert i en ikke-invasiv neuronal ablasjon modell. Vi visualiserer innenfor et enkelt datasett vev, cellulære og subcellulære forandringer som kan kvantifiseres i forskjellige celletyper, inkludert neuroner og mikroglia, hjernens makrofager. I tillegg forenkler nanotomy korrelasjonen av EM med lysmikroskopi (CLEM) 8 på samme vev, som store overflatearealer som tidligere avbildes ved hjelp av fluorescerende mikroskopi, kan deretter bli utsatt for stort område EM, noe som resulterer i nano-anatomi (nanotomy) av vev. I alt kan nanotomy objektiv påvisning av funksjonene på EM-nivå i en vev-wide kvantifiserbar måte.
Nye tekniske utviklingen har forbedret allsidighet, anvendelighet og kvantitativ natur EM, som fører til en gjenoppliving av ultra analyse. Fremskritt inkluderer 3D EM, storskala 2D EM og forbedrede metoder og reagenser korrelert lysmikroskopi og elektronmikroskopi (CLEM) for å sammenligne andre former for mikroskopisk analyse direkte til EM nivå 8-10. Storskala 2D EM er spesielt egnet til å kvantifisere eller identifisere (nye) sykdoms funksjoner for menneskelig patologi, studere dyremodeller for sykdom og vev kultur modeller. På grunn av den vanligvis lille synsfelt er det vanskelig å korrelere endringer i høy forstørrelse til et vev bred skala, så vel som til unbiasedly og kvantitativt analysere ultrastrukturelle egenskaper.
For patologisk analyse av menneskelig vev, eller vurderingen av patologi i dyremodeller, haematoxylin og eosin (H & E) farget deler av formaldehyd fast parafin innebygd (FFPE) tissue er standard. Foruten enkel H & E flekker immunolabeling er også utført for å identifisere patologiske forandringer. Dersom slike vev kunne analyseres ved EM-nivå, spesifikke celletyper, og subcellulære endringer kan bli identifisert. Den objektive natur stor skala EM gjør det mulig å finne uventede og nye trekk ved sykdommen. Ved store EM områder opp til kvadratmillimeter kan visualiseres. Vi og andre tidligere søkt nanotomy å rotte bukspyttkjertelen holmer 4, cellekultur 2, rottehjerne tre, hud og slimhinner 7 og hele sebrafisk larver 1,5 (www.nanotomy.org). Sebrafisk er godt egnet for in vivo avbildning, særlig i å visualisere celletyper som er vanskelig tilgjengelig i pattedyrvev, inkludert hjerneimmunceller 11. Her nanotomy fremgangsmåten er beskrevet i detalj, påsatt koronale seksjoner av sebrafisk hoder som gjennomgår betinget neuronal ablasjon ved omdannelse av metronidazol av neuronaluttrykt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle rådata presenteres som zoomable HTML-filer, visualisere molekylære til vev omfattende endringer. Presentasjonen av rådata gir deg objektive analyser av datasett fra andre vinkler av eksperter over hele verden.
EM tillater analyse av mobilnettet sammenheng med høy oppløsning av makromolekyler i biologisk sammenheng. Men dette vanligvis begrenser synsfeltet. Større skala 3D EM er spesielt egnet for kartlegging neuronal tilkobling ved å lage nanoskala oppløsning 3 dimensjonale rekonstruksjoner, som krever komplekse databehandlingen 10. I kontrast, krever 2D stor skala EM bare en enkelt seksjon og søm av imaging data, og vurdering av data er mulig av alle som har tilgang til en nettleser. Vi og andre tidligere brukt i stor skala EM å analysere vev og hele dyr. Som for de fleste nærmer seg, TEM og SEM-baserte sømmen har sine egne fordeler. Her ble scanning overføring EM (STEM) brukes som tillater generering av et stort synsfelt med høy oppløsning. Vanligvis er en STEM bilde tilsvarer de synsfelt på ca 100 TEM bilder, noe som reduserer mengden av sømmen når avbildning stor fields for mine synspunkter på høy oppløsning. Ved høyere oppløsning er nødvendig, kan TEM være fordelaktig. STEM har den fordel i TEM at ikke-kontras prøver kan brukes med god kontrast ultra 6.
I tillegg kan fremgangsmåten som er beskrevet her ganske enkelt justeres for bruk med ryggen spredt elektron deteksjon (BSD) på seksjoner montert på silika wafere, og utvider bruken av flere mikroskop systemer. HTML-zoomable vev EM-filer er svært nyttig for kvantifisering, deling av data som kanskje ikke har blitt analysert til sin fulle innhold, som kombinerer LM og EM-data (Clem) 8, presentasjon formål i vitenskapelig forskning, for å analysere pasientdata, og for utdanning. Alternativt kan i stor skala EM i et SEM, men ikke i en TEM, silika wafere kan brukes, som har to hovedfordeler: BSD kan anvendes, som mer generelt er tilgjengelig på skanning elektronmikroskop enn STEM deteksjon. Second, montering av store deler (> 1 mm 2 områder avrenter) er grei. Montering på enkle avlange nett er arbeidskrevende og teknisk utfordrende. Detaljert sammenligning mellom TEM, SEM og STEM er detaljert andre steder 6. En ulempe med BSD bildebehandling er at, i forhold til stammen, bildene har økt støy. Dette kan delvis kompenseres ved å øke oppholdstiden piksel, noe som resulterer i mye lengre innhentingstider.
Selv for prøveopparbeidelse relativt standard EM behandling (fiksering, forankring og seksjonering) er nødvendig for 5-7, er det teknisk utfordrende å kutte store supertynne seksjoner helt blottet for gjenstander. Snittene er svært skjøre, kan lett brekke, brett eller blir ødelagt under bildebehandling, noe som vanligvis tar flere timer per datasett. Men på grunn av den elektroniske deling av rå objektive data, bør det bli mulig å sammenligne lettere til publiserte data, og bruke publisert datasett i det åpne domenet som kontroller. Foreløpig er det få EM-enheter i stand til å large-skala analyse er i bruk, og derfor tilgjengeligheten til denne teknikken er noe begrenset, men de fleste bildebehandlingssentre velkommen samarbeidstiltak.
For store deler vevet må være skikkelig festet hele prøven. Det er derfor en blanding av rask, men moderat fikseringsmiddel PFA blir brukt i kombinasjon med den langsomme, men sterk fikseringsmiddel GA. Kutting og plukke opp store deler uten artefakter er vanskelig. Arbeide med wafere i kombinasjon med BSD er enklere i forhold til å samle deler på ett hull nett. Heavy metal post farging er mer kritisk i forhold til klassisk EM. Siden hele delen er fotografert hver artefakt vil være synlig. TEM brukere vanligvis finner det vanskelig å bytte til en SEM, på grunn av forskjellen i mikroskopet drift.
Kvantifisering og deling av data – Kvantifisering subcellulære funksjoner er vanskelig i enkelt EM bilder. Muligheten for å zoome inn og ut av storskalabilder lar lett identifikasjon av celler av interesse, som kan følges av nanoskala målinger inne i cellene. Disse datasettene viser at spesifikke celletyper kan raskt identifisert og kvantifisert på en saklig måte i disse store vevssnitt, basert på funksjoner påvisbare på ulike skalaer. For eksempel mikroglia kan identifiseres basert på deres morfologi og tett cytoplasma. Deretter, når du zoomer inn på de enkelte cellene, nanoskala subcellulære og molekylære funksjoner av disse cellene kan måles innenfor samme datasettet, som vi tidligere har vist mot ER bredde i en stor skala EM vev kultur datasett 2. En ekstra fordel med nanotomy er at hosting av store datasett på nettet vil tillate andre å inspisere data, kanskje for andre funksjoner, og trekke sine konklusjoner på ny hypotese.
CLEM – I tillegg til å legge til rette for kvantitativ EM, stor skala EM gjør det enklere å korrelere lys mikroskop,pic merking til EM nivå 8. I det foreliggende eksempel er vist tilstedeværelse av fagocyterende mikroglia i en sebrafisk ablasjon modell. Et viktig spørsmål i nevrovitenskap er hva de enkelte funksjoner og bidrag er av microglia og potensielle andre kilder til phagocytic og immunceller. Tidlige EM studier har vist karakteristiske subcellulære trekk ved microglia i sykdoms 18. Uheldigvis er det vanskelig å selektivt merke mikroglia spesielt i en patologisk innstilling, da de oppviser stor overlapping med andre immunceller i genekspresjon, morfologi og funksjon. Derfor er det uklart om og når microglia på ultra nivå skiller seg fra immunceller fra andre kilder, inkludert monocytter utledet infiltrere makrofager. Forståelse om det er ultra forskjeller mellom disse cellene vil gi et startpunkt for analyse av funksjonelle forskjeller. Kombinere selektive transgene eller uttrykk markører og CLEM tillater Fondetection av ultra funksjoner selektiv til bestemte befolkningsgrupper.
Diagnose og presentasjon og utdanning – Ved å visualisere nanonivå til mikro innenfor et enkelt datasett EM data er sterkt tilrettelagt for et bredt publikum. Med de økte muligheter og verktøy for samsvar og storskala EM forventer vi en tilbakevending til EM i grunnleggende og medisinsk forskning. Vår metode representert her er brukt til en sebrafisk hjerneskade modell 5, men er blitt brukt på menneskelig vev 7, rottehjerne 3, i en rottemodell for diabetes 4 og i cellekultur 2, og kan også brukes i kombinasjon med en TEM -basert metode 1 viser allsidigheten av denne metoden. Mikroskopet operatøren ikke lenger opptak høyt valgt, og dermed partisk bilder, men alle tallrike ultra funksjoner blir registrert og åpent for hele verden analyse.
The authors have nothing to disclose.
Flertallet av arbeidet har blitt utført ved den UMCG Mikroskopi og Imaging Center (UMIC), som er sponset av NWO 175-010-2009-023 og ZonMW 91111006; STW "Mikros dalen 12718" til BNGG. Dette arbeidet ble sponset av en ZonMW VENI stipend, et Marie Curie karriere integreringstilskuddet (sparer døende nevroner) og en Alzheimers Nederland fellesskap å TJvH
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |