Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
A gran escala de microscopía electrónica en 2D (EM), o nanotomy, es la aplicación a nivel de los tejidos de la microscopía electrónica de resolución nanoescala. Los demás y que se aplicaban anteriormente EM gran escala para la piel islotes pancreáticos humanos, cultivo de tejidos y toda larvas de pez cebra 1-7. Aquí se describe un método universalmente aplicable para la exploración EM tejido a gran escala para la detección imparcial de características sub-celulares y moleculares. Nanotomy se aplicó para investigar la sana y un cerebro de pez cebra neurodegenerativa. Nuestro método se basa en los protocolos de preparación de muestras estandarizadas EM: La fijación con glutaraldehído y osmio, seguido de la incrustación de resina epoxi, ultrafina seccionar y el montaje de ultrafinas secciones en las redes de un solo agujero, seguido por el poste de tinción con uranilo y plomo. A gran escala de las imágenes 2D EM mosaico se adquieren mediante un escaneo EM conectado a un generador de exploración amplia zona exterior mediante un ME de transmisión de barrido (STEM). Gran escala EM imágenes son típicamente ~ 5 – 50 G i pixelestamaño n, y se ve mejor usando archivos HTML con zoom, que se pueden abrir en cualquier navegador web, similar a los mapas geográficos HTML en línea. Este método se puede aplicar a tejidos (humanos), secciones transversales de animales enteros, así como el cultivo de tejidos 1-5. Aquí, los cerebros de pez cebra se analizaron en un modelo de ablación neuronal no invasiva. Visualizamos dentro de un solo conjunto de datos de tejido, celular y cambios subcelulares que se puede cuantificar en varios tipos de células incluyendo neuronas y la microglia, macrófagos del cerebro. Además, nanotomy facilita la correlación de EM con microscopía de luz (CLEM) 8 en el mismo tejido, como áreas de superficie grandes de captación de imagen previamente usando microscopía de fluorescencia, posteriormente se puede someter a gran área EM, resultando en la nano-anatomía (nanotomy) de tejidos. En total, nanotomy permite la detección imparcial de las características a nivel de EM de manera cuantificable en todo el tejido.
los avances técnicos recientes han mejorado la versatilidad, la aplicabilidad y la naturaleza cuantitativa de la EM, lo que lleva a un renacimiento del análisis ultraestructural. Los avances incluyen EM 3D, 2D EM gran escala y la mejora de los métodos y reactivos para correlacionada microscopía óptica y microscopía electrónica (CLEM) para comparar otros modos de análisis microscópico directamente con el nivel de EM 8-10. A gran escala 2D EM es particularmente adecuado para cuantificar o identificar (novela) características de la enfermedad de la patología humana, el estudio de modelos animales para los modelos de enfermedad y de cultivo de tejidos. Debido a la normalmente pequeño campo de vista es difícil correlacionar los cambios en la alta ampliación a una escala amplia de tejido, así como para analizar unbiasedly y cuantitativamente características ultraestructurales.
Para el análisis patológico de los tejidos humanos o la evaluación de la patología en modelos animales, hematoxilina y eosina (H & E) de color secciones de parafina embebido fijo formaldehído (FFPE) tisSue es la norma. Además de la simple tinción H & E immunolabeling también se realiza para identificar anormalidades patológicas. Si tales tejidos podrían ser analizados en el nivel EM, tipos de células específicos, y los cambios subcelulares pudieron ser identificados. La naturaleza no sesgada de EM gran escala permite la búsqueda de características inesperadas y novedosas de la enfermedad. Por áreas de gran escala em up a milímetros cuadrados se pueden visualizar. Nanotomy a la rata islotes pancreáticos 4, el cultivo de células 2, 3 ratas cerebro, piel y mucosa 7 y todo larvas de pez cebra 1,5 (www.nanotomy.org) Nosotros y otros aplicados con anterioridad. El pez cebra son muy adecuados para formación de imágenes in vivo, en particular para visualizar los tipos de células que son de difícil acceso en los tejidos de mamíferos incluyendo las células inmunes del cerebro 11. Aquí el procedimiento nanotomy se describe en detalle, se aplica a secciones coronales de cabezas de pez cebra sometidos a ablación neuronal condicional por conversión de metronidazol por neuronalnitrorreductasa expresada (www.nanotomy.org) 5,12-14. Todos los datos en bruto se presenta como archivos HTML con zoom, la visualización molecular para cambiar la escala de los tejidos. La presentación de los datos en bruto permite análisis imparciales de las bases de datos desde otros ángulos de expertos de todo el mundo.
EM permite el análisis del contexto celular con una alta resolución de imagen de macromoléculas en contexto biológico. Sin embargo, esto típicamente limita el campo de visión. Mayor escala 3D EM es particularmente adecuado para la conectividad neuronal mediante la creación de mapeo resolución nanoescala 3 reconstrucciones tridimensionales, lo que requiere el procesamiento de datos complejos 10. Por el contrario, 2D gran escala EM requiere solamente una sola sección y la costura de los datos de imagen, y la evaluación de los datos es posible por cualquier persona con acceso a un navegador de Internet. Nosotros y otros previamente usamos EM gran escala para analizar tejidos y animales enteros. En cuanto a la mayoría de los enfoques, TEM y la costura a base de SEM tienen sus propias ventajas. En este caso, se utilizó la transmisión de escaneo EM (STEM) que permite la generación de un gran campo de visión en alta resolución. Típicamente, una imagen de STEM es equivalente a los campos de visión de aproximadamente 100 imágenes de TEM, lo que reduce significativamente la cantidad de costura cuando se generan imágenes grandes fields de vista con alta resolución. Si se necesita una resolución más alta, TEM puede ser ventajoso. STEM tiene la ventaja sobre TEM que las muestras no se pueden utilizar en contraste con un buen contraste ultraestructural 6.
Además, el método descrito aquí puede ser simplemente ajustado para su uso con la detección de electrones retrodispersados (BSD) en secciones montadas sobre obleas de sílice, ampliando el uso en varios sistemas de microscopio. Los archivos de EM tejido HTML con zoom son muy útiles para la cuantificación, el intercambio de datos que pueden no haber sido analizado a su contenido completo, que combina LM y datos de EM (CLEM) 8, a efectos de presentación en la investigación científica, para analizar los datos del paciente, y para la educación. Alternativamente, en EM a gran escala en un SEM, pero no en un TEM, obleas de sílice se pueden utilizar, que tiene dos ventajas principales: BSD se puede utilizar, que es más generalmente disponibles en microscopios electrónicos de barrido que el tallo de detección. En segundo lugar, el montaje de grandes secciones (> 1 mm 2 zonas deintereses) es sencillo. Montaje sobre rejillas ranuradas individuales es una labor intensiva y técnicamente desafiante. Comparación detallada entre TEM, SEM y STEM se detalla en otro lugar 6. Una desventaja de las imágenes BSD es que, en comparación con el tallo, las imágenes han aumentado el ruido. Esto en parte se puede compensar mediante el aumento del tiempo de permanencia de píxel, lo que resulta en tiempos de adquisición mucho más largos.
Aunque para la preparación de muestras de procesamiento relativamente estándar EM (fijación, inclusión y corte) que se necesita 5-7, es técnicamente difícil de cortar secciones ultrafinas grandes completamente desprovisto de artefactos. Las secciones son muy frágiles, se rompen con facilidad, se pliegan o se destruyen durante la exploración, que por lo general toma varias horas por el conjunto de datos. Sin embargo, debido a la distribución en línea de los datos imparciales primas, debería ser posible comparar más fácilmente con los datos publicados, y utilizar el conjunto de datos publicada en el dominio abierto como controles. En la actualidad, unos dispositivos capaces de EM de laEl análisis RGE escala están en uso, y por lo tanto la accesibilidad a esta técnica es algo limitada, aunque la mayoría de los centros de imágenes celebran los esfuerzos de colaboración.
Para las secciones de gran escala el tejido tiene que ser fijado adecuadamente a lo largo de la muestra. Es por ello que se utiliza una mezcla de la rápido pero moderada fijador PFA en combinación con la lenta pero fuerte fijador GA. Cortar y recoger grandes secciones sin artefactos es difícil. Trabajando con las obleas en combinación con BSD es más fácil en comparación con la recogida de las secciones en las redes con un solo orificio. tinción poste de metal pesado es más crítica en comparación con EM clásica. Dado que toda la sección se crea una imagen cada artefacto será visible. TEM usuarios les suele resultar difícil cambiar a un SEM, debido a la diferencia en la operación del microscopio.
La cuantificación y el intercambio de datos – La cuantificación de características subcelulares es difícil en un solo EM imágenes. La posibilidad de acercar y alejar de gran escalaimágenes permite fácilmente la identificación de células de interés, que puede ser seguido por mediciones nanoescala dentro de las células. Estos datos indican que determinados tipos de células pueden ser identificados rápidamente y cuantificados de forma imparcial en estas secciones de tejido de gran tamaño, sobre la base de características detectables a diferentes escalas. Por ejemplo microglia se pueden identificar en función de su morfología y citoplasma denso. Posteriormente, al hacer zoom sobre las células individuales, características subcelulares y moleculares a nanoescala de estas células se puede medir en el mismo conjunto de datos, como se mostró anteriormente para la anchura ER dentro de un gran escala tejido EM cultura conjunto de datos 2. Una ventaja adicional de nanotomy es que la celebración de grandes conjuntos de datos en línea escala permitirá a otros, para controlar los datos, tal vez para otras funciones, y sacar sus conclusiones sobre la nueva hipótesis.
CLEM – Además de facilitar la EM cuantitativa, EM gran escala hace que sea más fácil para correlacionar la luz microscoetiquetado fotografia a nivel de EM 8. En el presente ejemplo se muestra la presencia de microglia fagocíticas en un modelo de ablación de pez cebra. Una cuestión importante en la neurociencia es lo que las funciones y las contribuciones individuales son de la microglía y los posibles otras fuentes de fagocitosis y las células inmunes. Los primeros estudios han demostrado EM características subcelulares distintivos de microglia en la enfermedad 18. Desafortunadamente, es difícil para etiquetar selectivamente microglia en particular en un entorno patológico, ya que presentan grandes similitudes con otras células inmunes en la expresión génica, morfología y función. Por lo tanto, no está claro si y cuando microglia en el nivel ultraestructural difieren de las células inmunes de otras fuentes incluyendo derivado de monocitos infiltración de macrófagos. La comprensión de si existen diferencias ultraestructurales entre estas células servirá de punto de partida para el análisis de las diferencias funcionales. La combinación de marcadores transgénicos o expresión selectiva y CLEM permite detreflejo de características ultraestructurales selectivas para poblaciones específicas.
Diagnóstico y presentación y la educación – Al visualizar a nanoescala microescala dentro de un único conjunto de datos los datos de EM se facilita en gran medida a una amplia audiencia. Con el incremento de posibilidades y herramientas para la EM correlativa y en gran escala anticipamos un renacimiento de EM en la investigación básica y médica. Nuestro método representado aquí se aplica a un modelo de lesión de pez cebra cerebro 5, pero se ha utilizado en el tejido humano 7, cerebro de rata 3, en un modelo de rata para la diabetes 4 y en el cultivo celular 2, y también se puede utilizar en combinación con un TEM enfoque basado en 1 que muestra la versatilidad de este método. El operador del microscopio ya no es altamente grabación seleccionada, y por lo tanto, las imágenes sesgadas, pero todas las numerosas características ultraestructurales se registran y abierto para el análisis de todo el mundo.
The authors have nothing to disclose.
Mayor parte del trabajo se ha realizado en el Centro de Microscopía e Imagen UMCG (UMIC), que está patrocinado por NWO 175-010-2009-023 y ZonMW 91.111.006; STW "Valle de Microscopía 12718" para BNGG. Este trabajo fue patrocinado por una subvención ZonMW VENI, una subvención de la integración profesional Marie Curie (ahorro de morir neuronas) y una beca de Alzheimer Nederland a TJvH
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |