Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Storskalig 2D elektronmikroskopi (EM), eller nanotomy är vävnads omfattande tillämpning av nano upplösning elektronmikroskopi. Andra och vi tidigare tillämpade storskalig EM till mänsklig hud pankreasöar, vävnadskultur och hela zebrafisk larver 1-7. Här beskriver vi en allmängiltig metod för vävnads skala scanning EM för objektiv detektering av sub-cellulära och molekylära funktioner. Nanotomy tillämpades för att undersöka friska och en neurodegenerativ zebrafisk hjärnan. Vår metod bygger på standardiserade EM provberedningsprotokoll: Fixering med glutaraldehyd och osmium, följt av epoxi-harts inbäddning, ultratunna sektionering och montering av ultratunna-avsnitt om ett hål nät, följt av post färgning med uranylacetat och bly. Storskaliga 2D EM mosaik bilder förvärvas med hjälp av en scanning EM ansluten till en extern stor area scan generator med sveptransmissions EM (STEM). Storskaliga EM bilder är vanligtvis ~ 5 – 50 G pixlar In storlek, och bäst visas med zoombar HTML-filer, som kan öppnas i alla webbläsare, som liknar nätet geografiska HTML kartor. Denna metod kan tillämpas på (human) vävnad, tvärsnitt av hela djur såväl som vävnadskultur 1-5. Här har zebrafisk hjärnor analyserades i en icke-invasiv neuronal ablation modell. Vi visualisera inom en enda datauppsättning vävnad, cellulär och subcellulära ändringar som kan kvantifieras i olika celltyper inklusive neuroner och mikroglia, hjärnans makrofager. Dessutom underlättar nanotomy korrelationen av EM med Ijusmikroskopi (CLEM) 8 på samma vävnad, eftersom stora ytareor tidigare avbildas med fluorescensmikroskopi, kan därefter utsättas för stort område EM, vilket resulterar i nano anatomin (nanotomy) av vävnader. Sammantaget gör nanotomy opartisk detektion av funktioner på EM-nivå i en vävnad omfattande kvantifierbara sätt.
tekniska utvecklingen de senaste har förbättrat mångsidighet, användbarhet och kvantitativ natur EM, vilket leder till ett återupplivande av ultra analys. Förskott inkluderar 3D EM, storskalig 2D EM och förbättrade förfaranden och reagens för korrelerad Ijusmikroskopi och elektronmikroskopi (CLEM) för att jämföra andra typer av mikroskopiska analysen direkt till EM nivå 8-10. Storskalig 2D EM är särskilt lämpligt att kvantifiera eller identifiera (nya) sjukdoms funktioner för mänsklig patologi, studera djurmodeller för sjukdom och vävnadsodlingsmodeller. På grund av den vanligtvis små synfältet är det svårt att korrelera förändringar på hög förstoring till en vävnad stor skala, samt att unbiasedly och kvantitativt analysera ultra funktioner.
För patologisk analys av mänsklig vävnad eller bedömningen av patologi i djurmodeller, hematoxylin och eosin (H & E) färgade sektioner av formaldehyd fast paraffininbäddade (FFPE) tissue är standard. Förutom enkel H & E färgning immunomärkning utförs också för att identifiera patologiska avvikelser. Om sådana vävnader kan analyseras på EM-nivå, specifika celltyper, och subcellulära förändringar kunde identifieras. Den objektiva karaktären av storskalig EM tillåter finna oväntade och nya egenskaper hos sjukdomen. Genom storskaliga EM områden upp till kvadratmillimeter kan visualiseras. Vi och andra tillämpas tidigare nanotomy råtta pankreasöar 4, cellodling 2, råtthjärna tre, hud och slemhinnor 7 och hela zebrafisk larver 1,5 (www.nanotomy.org). Zebrafisk är mycket lämpliga för in vivo avbildning, i synnerhet för att visualisera celltyper som är svåra att komma åt i däggdjursvävnader, inklusive hjärnan immunceller 11. Här nanotomy förfarande beskrivs i detalj, appliceras på koronala sektioner av zebrafiskhuvuden som genomgår villkorlig neuronal ablation genom omvandling av metronidazol med neuronaluttryckt nitroreduktas (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alla rådata presenteras som zoombar HTML-filer, visualisera molekylär vävnadsskalförändringar. Presentationen av rådata tillåter objektiva analyser av datamängder från andra vinklar av experter över hela världen.
EM möjliggör analys av cell sammanhang med hög upplösning avbildning av makromolekyler i biologiska sammanhang. Detta begränsar emellertid typiskt synfältet. Större skala 3D EM är särskilt lämplig för att kartlägga nervkopplingar genom att skapa nano upplösning 3 dimensionella rekonstruktioner, som kräver komplexa databehandling 10. Däremot kräver 2D storskalig EM bara ett enda avsnitt och sömnad av bilddata, och bedömning av uppgifter är möjlig genom vem som helst med tillgång till en webbläsare. Vi och andra tidigare använts i stor skala EM för att analysera vävnader och hela djur. När det gäller de flesta metoder, TEM och SEM-baserade sömmar har sina egna fördelar. Här var scanning transmission EM (STEM) används som möjliggör genereringen av ett stort synfält med hög upplösning. Vanligtvis är en STEM bild motsvarar synfälten på cirka 100 TEM-bilder, vilket avsevärt minskar mängden sömmar när avbildning stor fields perspektiv med hög upplösning. Om det krävs högre upplösning, kan TEM vara fördelaktigt. STEM har den fördelen framför TEM att icke-kontrasterade prover kan användas med god ultrastrukturella kontrast 6.
Dessutom kan den här beskrivna metoden enkelt justeras för användning med bakåtspridd elektrondetektering (BSD) på avsnitten monterad på kiseldioxid wafers, bredda användningen till flera mikroskopsystem. HTML-zoombar vävnads EM-filer är mycket användbara för kvantifiering, delning av data som inte kan ha analyserats till sin fulla innehåll, som kombinerar LM och EM data (Clem) 8, presentationsändamål i vetenskaplig forskning, analysera patientdata, och för utbildning. Alternativt kan i storskalig EM i en SEM, men inte i en TEM, kiseldioxid wafers kan användas, som har två huvudsakliga fördelar: BSD kan användas, vilket är mer allmänt tillgängliga på svepelektronmikroskop än STEM detektering. För det andra, montering av stora delar (> 1 mm 2 områden avränta) är okomplicerad. Montering på enstaka slitsade galler är arbetsintensiv och tekniskt utmanande. Detaljerad jämförelse mellan TEM, SEM och STEM specificeras på annat håll 6. En nackdel med BSD avbildning är att, jämfört med STEM, bilder har ökat buller. Detta kan delvis kompenseras genom att öka tiden pixeluppehålls, vilket resulterar i mycket längre hämtningstider.
Även för provberedning relativt standard EM bearbetning (fixering, inbäddning och snittning) behövs 5-7, är det tekniskt utmanande att skära stora ultratunna sektioner helt saknar artefakter. Sektioner är mycket bräcklig, lätt gå sönder, lägga sig eller förstörs under avbildning, vilket normalt tar flera timmar per dataset. Men på grund av online-delning av rå objektiva data bör det bli möjligt att jämföra lättare publicerade data och använda publicerade dataset i det öppna verksamhetsområdet som kontroller. För närvarande är det få EM-enheter med förmåga att laRGE-skala analys är i bruk, och därför tillgång till denna teknik är något begränsad, även om de flesta röntgenkliniker välkomna samarbeten.
För storskaliga sektioner vävnaden måste vara ordentligt fästa i hela provet. Det är därför en blandning av snabb men måttlig fixativ PFA används i kombination med den långsamma men stark fixerings GA. Kapning och plocka upp stora delar utan artefakter är svårt. Arbeta med skivor i kombination med BSD är lättare jämfört med att samla delar på enstaka hål galler. Heavy metal post färgningen är mer kritisk än klassisk EM. Eftersom hela avsnittet avbildas varje artefakt kommer att vara synlig. TEM användarna typiskt att det är svårt att byta till en SEM, på grund av skillnaden i mikroskop drift.
Kvantifiering och datadelning – kvantifiera subcellulära funktioner är svårt i enstaka EM bilder. Möjligheten att zooma in och ut i stor skalabilder kan lätt identifiering av celler av intresse, som kan följas av nano mätningar inuti cellerna. Dessa datamängder visar att specifika celltyper kan snabbt identifieras och kvantifieras på ett opartiskt sätt i dessa stora vävnadssnitt, baserat på funktioner detekterbara i olika skalor. Till exempel mikroglia kan identifieras baserat på deras morfologi och tät cytoplasma. Därefter, vid zooma in på de enskilda cellerna, nanoskala subcellulära och molekylära egenskaperna hos dessa celler kan mätas inom samma dataset, som vi tidigare visade för ER bredd inom ett storskaligt EM vävnadskultur dataset 2. En ytterligare fördel med nanotomy är att hosting av storskaliga datamängder på nätet gör det möjligt för andra att inspektera uppgifter, kanske för andra funktioner, och dra sina slutsatser om ny hypotes.
CLEM – Förutom att underlätta kvantitativ EM gör storskalig EM det lättare att korrelera ljus microscopic märkning EM nivå 8. I föreliggande exempel närvaron av fagocytiska mikroglia i en zebrafisk ablation modell visas. En viktig fråga i neurovetenskap är vad de enskilda funktionerna och bidrag är av mikroglia och potentiella andra källor till fagocytiska och immunceller. Tidiga EM studier har visat distinkta subcellulära funktioner i mikroglia vid sjukdom 18. Tyvärr är det svårt att selektivt märka mikroglia i synnerhet i en patologisk inställning, som de uppvisar stor överlappning med andra immunceller i genuttryck, morfologi och funktion. Därför är det oklart om och när mikroglia på ultra nivå skiljer sig från immunceller från andra källor, inklusive monocyter härrör infiltrerande makrofager. Förstå om det finns ultra skillnader mellan dessa celler kommer att ge en utgångspunkt för analys av funktionella skillnader. Kombinera selektiva transgena eller uttrycks markörer och CLEM tillåter Detvsnitt av ultra funktioner selektiva för specifika populationer.
Diagnos och presentation och utbildning – Genom att visualisera nanoskala till mikro inom en enda datauppsättning EM data underlättas avsevärt till en bred publik. Med de ökade möjligheter och verktyg för korrelat och storskalig EM räknar vi ett återupplivande av EM i grundläggande och medicinsk forskning. Vår metod representerade här tillämpas på en zebrafisk hjärnskada modell 5, men har använts på mänsklig vävnad 7, råtthjäma 3, i en råttmodell för diabetes 4 och i cellkultur 2, och kan även användas i kombination med ett TEM -baserade tillvägagångssätt 1 visar mångsidigheten hos denna metod. Operatören mikroskop inte längre inspelning starkt markerad och därmed snedvridna bilder, men alla många ultra funktioner registreras och öppna för global analys.
The authors have nothing to disclose.
Majoriteten av arbetet har utförts på UMCG Mikroskopi och Imaging Center (UMIC), som sponsras av NWO 175-010-2009-023 och ZonMW 91.111.006; STW "Microscopy Valley 12718" till BNGG. Detta arbete sponsrades av en ZonMW VENI bidrag, en Marie Curie karriär integrationsbidrag (spara döende nervceller) och en Alzheimer Nederland gemenskap till TJvH
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |