Introduction
Hudåkommor som sträcker sig från kontakteksem, eksem, psoriasis, cellulit, svampinfektioner och bölder till icke-melanom hudcancer befanns vara bland de 50 vanligaste sjukdomarna i världen, och den fjärde ledande orsaken till icke-dödliga sjukdomar under 2010 1. Följaktligen är utredningen av molekylära och cellulära mekanismer som ligger bakom olika hud sjukdomar en nödvändig och aktivt forskningsområde. Gnagarmodeller har varit anmärkningsvärt användbar vid förståelsen av inflammatoriska hudtillstånd såsom atopisk dermatit 2, psoriasis 3, eller Staphylococcus aureus-infektion 4. Inexpensive, effektiva och enkla protokoll för enzymatisk digerering av mus hudvävnad kan tillhandahålla beredningar av celler som kan användas för en mängd olika tillämpningar nedströms för att bättre förstå patofysiologin av hudsjukdomar. Här används en enkel och ekonomisk metod som beskrivits för enzymatisk uppslutning av mushudvävnad och isolering av huden infiltrerande leukocyter som kan användas för cellodling in vivo adoptiv överföring, flödescytometrisk analys och sortering eller gen expressionsstudier. Det övergripande målet med detta förfarande är att förbereda en enda cell suspension av hud-infiltrerande leukocyter med hög cellviabiliteten samtidigt minimera kostnaderna vanligtvis förknippas med anpassade reagenskit och mekaniska dissociators.
Befintliga hud vävnadsdissociering metoder 5-7 kan leda till låg cellviabilitet och ytmarkör integritet, eller kräva anpassade enzymsatser och dyra vävnadsdissociering maskiner 8-11. Även rötning av musöra hudvävnad är tämligen utbredd 12-13, smälta mycket keratiniserad hudvävnad (t.ex. från flanken) kan resultera i cellpreparat kontaminerade med stora mängder av icke-cellulärt skräp. I en nyligen genomförd studie, Zaid och kollegor diger mus flank hud under 90 minuter i 2,5 mg / ml dispas, Followed med 45 minuter i 3 mg / ml kollagenas 7. I en annan studie, dessa forskare använde flera inkubationer med en sammanlagd nedbrytning av 2,5 timmar, inklusive användning av trypsin / EDTA, kollagenas III, och dispas 5. Användningen av trypsin rekommenderas inte för enzymatisk hud matsmältningen, såsom behandling med trypsin från olika tillverkare har visat att mätbart påverka integriteten för cellyteproteiner på däggdjursceller 14-15. Dessutom kan dispas få betydande effekter på proliferativa förmåga CD4 och CD8a T-celler och påverka yta överflöd av minst 20 molekyler, inklusive gemensamma T-cellsaktivering markörer som CD62L 16. Andra protokoll använder RPMI 1640 i matsmältningen mediet 6. Emellertid kan närvaron av Mg2 + och Ca 2 + i RPMI orsaka omfattande cellaggregation 17.
En idealisk protokoll för vävnadsdissociering bör sträva efter hög cellviabilitet, lågnivåer av cellaggregering och minimal skada på cellyteproteiner. Hög kvalitet preparat lymfkörtel stromacellinjer har åstadkommits med protokoll som använder kortare enzym inkubationer, Ca2 + och Mg 2 + fria medier, och undvika trypsin och dispas 18. Emellertid har protokoll av detta slag inte fastställts för dissociation av hela mushud.
Här är ett protokoll som beskrivits för att dissociera, isolera och berika hud-infiltrerande leukocyter från allergen-utmanade mus flank hud. I korthet, skars ut huden förinkuberades i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med 10% fetalt bovint serum under en timme för att mjuka vävnaden under matsmältningen och avlägsna eventuellt överskott död hud eller fettvävnad. Detta följs av en 30 minuters enzymatisk spjälkning steg med 0,7 mg / ml kollagenas D. kollagenas D har minimala effekter på tätheten av cellytmarkörer, och ingen effekt på T-cellsproliferation in vitro 16,18, vilket gör detmycket lämplig för tillämpningar som innefattar karakterisering av ytproteiner. Efter enzymatisk digerering, blev diskontinuerlig densitetsgradientcentrifugering används för att avlägsna epitelceller och skräp från singel-cellsuspension och anrika hematopoietiska celler. Viktigt undviker detta förfarande dyra kolumnbaserad magnetisk cellseparation reagens och vävnadsdissociering maskiner 8-11, och kan utföras med utrustning och material som finns i en grundläggande biomedicinsk forskningslaboratorium. Här detta protokoll användes för att isolera leukocyter från flank hud utmanade tre gånger med haptenet oxazolon (Ox) i tidigare sensibiliserade ND4 Swiss-möss (anpassad från 19). Celler analyserades med hjälp av multi-parametrisk flödescytometri. Denna teknik gav en cellsuspension med minimal skräp och> 95% viabilitet av isolerade lymfocyter som analyserades genom flera parametrisk flödescytometri för att mäta infiltration av T-lymfocyter och neutrofiler i den drabbade ski.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: 8-12 veckor gammal kvinna ND4 Swiss Webster-möss, konventionellt inrymda med fri tillgång till mat och vatten, användes för dessa studier Den experimentella protokoll som används (B13S1) godkändes av Macalester College IACUC..
1. Sensibilisering och Challenge med oxazolon
- Dag 0
- Förbered anestesi kammare genom tillsats 3 ml isofluran till absorberande handdukar placerade under mask på botten av en 4 L lock glasburk. För ND4 honmöss som används här, tid i kammaren är 30-60 sekunder tills motivet är tillräckligt sövd; optimera anestesi administration för musstammen som används.
- Raka varje sövda musens rygg och flank med hjälp av en djurhår trimmer.
- Dag 1
- Gör en 2% -ig lösning av 4-etoximetylen-2-fenyl-2-oxazolin-5-en (Ox) i absolut etanol, och inkubera vid 50 ° C under 15 min på en roterande platta i en inkubator.
- Kortfattat sövamöss med användning isoflurananestesi enligt beskrivningen i 1.1.1 och tillämpa 100 pl 2% Ox till den rakade tillbaka i flera serie tillämpningar av cirka 20 fil vardera. Vänta 5-10 sekunder mellan serie ansökningar om lösningen torka.
- Var noga med att undvika att spilla 2% Ox lösningen på andra än ryggen regioner och vänta på lösningen att torka mellan program.
- Dagar 5-7
- Gör en 1% lösning av (Ox) i absolut etanol, och inkubera vid 50 ° C under 15 min på en roterande platta i en inkubator.
- Försiktigt men bestämt immobilisera musen i nackskinnet och svans bas med buken uppåt och hals något lutande nedåt (liknar en tag för en intraperitoneal injektion) och tillämpa 100 pl 1% Ox till den rakade flanken i flera seriella applikationer och tar dig tid att torka huden efteråt som beskrivits ovan.
- För kontrollmöss, gäller 100 il absolut etanol fordonet till rakade flank.
2. Flank Hud Skörd
- Euthanize möss med användning inhalation av koldioxid, och försiktigt skära ut det önskade området för flank huden (~ 25 mm x 25 mm av huden) med 10 cm kirurgisk sax.
- Med hjälp av en ren, skarp kirurgisk kniv, skrapa bort överflödigt fett och bindväv från flanken huden.
- Placera 3 bitar av flank hud från 3 möss i en 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml RT HBSS [med fenolrött, utan kalcium eller magnesium, 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1- piperazinetansulfonsyra (HEPES), och 10% fetalt bovint serum (FBS)].
3. Pre-matsmältningen Tissue Tvätt
- Placera rör innehållande skalfragment på en roterande platta för 30 min i en torr icke-gasades inkubator som hölls vid 37 ° C.
- Vortexa kraftigt i 10 sekunder vid slutet av inkubationsperioden.
- Sila innehållet i röret genom en 70 ^ msil för att kassera tvättbufferten och samla vävnaden. En enda sil kan återanvändas under hela förfarandet inom en biologisk behandlingsgrupp.
- Med hjälp av en pincett, överföra flanken huden från silen in i en ny 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml av färskt, RT HBSS medium (innehållande EDTA, HEPES och FBS såsom beskrivits ovan).
- Med en 12,5 cm par av kirurgiska dissekera sax nedsänkta i röret, finhacka varje del av flank hud så att den genomsnittliga bit vävnad är ungefär 2,2 mm x 2,2 mm i area.
- Placera rör innehållande skalfragment på en roterande platta för 30 min i en torr icke-gasades inkubator som hölls vid 37 ° C.
- Vortexa kraftigt i 10 sekunder vid slutet av inkubationen
4. kollagenasdigestion Hud
- Sila innehållet i röret genom en 70 | im sil, samla in och överföra bitarna flank skalet till ett nytt 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml fresh, RT HBSS medium kompletterat med 0,7 mg / ml kollagenas D.
- Placera rör innehållande digeremedium och skalfragment på en roterande platta för 30 min i en torr icke-gasades inkubator som hölls vid 37 ° C.
- Vortex innehållet i röret kraftigt för 10 sek vid slutet av inkubationen.
- Filter innehållet i röret genom en 70 pm sil i en ny 50 ml koniska rör; hålla genomströmning innehåller diger vävnad och kassera sil och flankerar hudavlagringar.
- Tvätta genomströmning i 50 ml HBSS medier, centrifugera i 5 min vid 350 g och dekantera supernatanten.
5. densitetsgradientcentrifugering
- Med användning av en serologisk pipett, tillsätt 3 ml RT 67% densitetsgradientcentrifugering media i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en ny 15 ml koniska rör för varje prov.
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml RT 44% densitetsgradientcentrifugering medier i HBSS med fenolrött.
- Gently skiktet 5 ml av den 44% densitetsgradientcentrifugering media innehållande cellerna på toppen av densitetsgradientcentrifugering medieprovet 67% med användning av en serologisk pipett. Var noga med att ställa pipetten på lägsta hastighet, och placera pipetten längs väggen av det koniska röret. Var noga med att inte skaka, störa, eller invertera övertoningen.
- Ställ acceleration till den lägsta inställningen, lossa bromsen, och centrifugera gradienten vid 931 xg under 20 minuter vid RT att se till att centrifugen är balanserad.
- Efter centrifugering, försiktigt bort gradient från centrifugen och försiktigt transporteras till labbet bänken håller röret upprätt. Med användning av en 5 ml plast överföringspipett, avlägsna cellskiktet vid gränsytan mellan de 44% och 67% densitetsgradientcentrifugering media och förflyttas till en ny 15 ml koniska rör. Om gränssnittet inte syns helt enkelt bort ca 2 ml vätska vid 67% -44% gräns.
- Fyll koniska röret med celler från integrerface med 2% FBS i 1X iskall PBS, centrifugceller för 5 min vid 350 x g, och dekantera supernatanten.
Anmärkning: Detta är första gången att cellerna kan kylas / förvaras kallt eftersom rötningssteg är vid 37 ° C och densitetsgradientcentrifugering media steg är vid RT. Celler kan återsuspenderas i en 1: 1 Trypanblått utspädning och räknas och livsdugligheten information kan erhållas vid denna punkt.
6. Blockera och färgning för flödescytometrisk analys
- Block FcyRII / III-receptorer på celler för att förhindra icke-specifik antikropp färgning. För de experiment som beskrivs här, se antikropps huvudmixarna i PBS med 2% FBS innehållande 1: 100 spädning av okonjugerad antikropp mot CD16 / 32 (2.4G2) att binda och blockera FcyRII / III-receptorer.
- Inkubera blockerade celler med lämpliga huvud blandningar av antikroppar mot CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (från 53 till 6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), och Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), liksom Brilliant Violet 510 levande / död fläck att identifiera döda celler. Använd alla antikroppar antingen på utspädning som rekommenderas av tillverkarna eller tidigare optimeras av forskare. För de experiment som beskrivs här, använda alla antikroppar vid 1: 100 utspädning.
- Tvätta celler och återsuspendera i 50 | il 1 x PBS färgning buffert med 2% FBS. Håll på is tills fluorescensdata kan förvärvas på en flödescytometer.
Obs: Det är viktigt att ha kompensationsparametrar förväg optimeras med en lymfoidvävnad och en gemensam cellyteantigen (som CD4 eller CD8) före förvärvet av fluorescensdata. - För att öka antalet celler för nedströms flödescytometrianalys, förvärva data från hela prov av färgade celler.
7. Analysera Flödescytometri data med hjälp av standardmetoder för att utföra stegen nedan
- Först grind på lymfocyt regionen av framåtspridning(område) genom sidospridning (område) -kurva.
- Välj sedan enstaka celler med hjälp av framåtspridning (bredd) vid sida spridning (bredd), för att undvika att analysera dubletter. Detta kan också åstadkommas med en framåtspridnings höjd genom sidospridning höjd tomt.
- Sedan, grind på härstamning (CD11b, CD11c och CD45R / B220) -negativ och CD3-positiva händelser, för att utesluta makrofager, dendritiska celler och B-celler, respektive, och begränsa analyser cellfacket T, om målet är, eftersom det är här, att bedöma infiltrerande T-celler.
- Nästa, grind på levande celler som utesluter levande / döda fläckar.
- Slutligen, grind på cellpopulationen av intresse (se representativa resultat avsnitt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kollagenas D behandlade splenocyter visar liknande nivåer av CD4 och CD8 α på T-celler i jämförelse med media behandlade kontroller
Först var eventuella effekter av kollagenas D på frekvens och yta överflöd av härstamning och aktiveringsmarkörer på T-cellgrupper utvärderas med hjälp av sekundär lymfoidvävnad som en kontroll. En suspension av splenocyter erhölls från ND4 möss och tvättades under 1 timme med HBSS media. Nästa, hälften av cellerna utsattes för 0,7 mg / ml kollagenas D (som beskrivs i avsnitt 4 ovan). De återstående cellerna återsuspenderades i kontroll HBSS medium. Därefter tillsattes båda splenocyt fraktionerna behandlas med hjälp av en densitetscentrifugering gradient som beskrivs i avsnitt 5 ovan. Cellerna färgades sedan med antikroppar mot yt-CD4 och CD8a, och analyserades på flödescytometern. Singel, levande, CD45 +, icke-T härstamning - (B220 - CD11b -CD11c -), var CD3ɛ + celler gated för analys, för att utesluta B-celler, makrofager, dendritiska celler. CD4 och CD8a proteiner lika upptäckts på ytan av splenocyter som hade utsatts för kollagenas D matsmältning och de hade inte utsatts för enzym med ca 60% CD4 + CD8a - celler och 30% CD4 - CD8a + celler detekterades med antingen behandling ( Figur 1A). Därför gjorde kollagenas D sammandrag inte påverkar den relativa frekvensen av CD4 och CD8a. Intensiteterna yta CD4 och CD8a geometrisk medelfluorescensenheter (gMFI) på dessa delmängder var också jämförbara mellan de två behandlingarna; gMFI värden för CD4 var 2271 för enzymbehandlade och 2243 för kontroll splenocytes respektive och gMFI värden för CD8a var 536 för enzymbehandlade och 520 för kontroll splenocyter. Enzymatisk behandling hade inte heller någon effekt på ytan densitet av T-cellaktiveringsmarkörer CD44 eller CD62L på CD4 + T-celler (Figur 1B). Geometriska medelfluorescensintensitetsvärden för CD44 var 669 för enzymbehandlade och 654 för kontroll splenocyter; gMFI värden för CD62L var 1523 för enzymbehandlade och 1517 för kontroll splenocyter. Som kollagenas D digestion bevarar integriteten hos ytproteiner på isolerade celler, kan det protokoll som beskrivs här kan användas med tillförsikt för nedströms flödescytometrianalys.
Enzymdigestion och lutning rening av flank hudceller resulterar i hög cellulär viabilitet
Cellutbyte och procent viabilitet av cellsuspensionen erhållen ovan bedömdes med hjälp av Trypan Blue färgexklusion 20. Detta matsmältningen och gradientseparation protokoll gav ca 250 livsdugliga immunceller per mm 2 av flankvävnad i Ox-utmanade möss och cirka 4 levande immunceller per mm 2 av vävnad i fordons-utmanade mösssom tidigare sensibiliserades med Ox (tabell 1).
Enzymdigestion och lutning rening av flank hudceller resulterar i robust återhämtning av immunceller
Därefter undersöktes omfattningen av immun infiltrering i huden bestämdes genom att analysera den stora mängden CD45 ytproteiner på celler som isolerats från flanken av Ox-utmanade möss och kontrollmöss för att bedöma återhämtning av hud-infiltrerande immunceller med användning av de metoder som beskrivs här. CD45 är en pan-hematopoetisk härstamning markör 21. 95% av låg framåtriktad och sidospridning, enskilda celler (grindning inte visad) i Ox-utmanade möss och 71% av dessa celler i fordons-utmanade kontroller var levande CD45 + celler (Figur 2). A ~ 67-faldig ökning av infiltrerande CD45 + immune celler detekterades i flanken huden efter 3 dagliga Ox utmaningar med användning av förfarandet beskrivet häri (tabell 1).
Tre flank Ox utmaningar resultera i uttalad infiltration av T-celler och neutrofiler
Vår teknik gav en cellpopulation från flank hud som skulle kunna användas för att detektera en mängd olika myeloida och lymfoida cellundergrupper såsom Gr-1 + neutrofiler 22, CD4-T-celler och CD8a-T-celler. Vi observerade ~ 6-faldig, ~ 7-faldig, och ~ 73-faldiga ökningar av neutrofiler, CD4 T-celler och CD8a-T-celler, respektive, efter 3 dagliga Ox utmaningar (Tabell 1). Vi beräknade dessa ökningar genom att multiplicera det totala antalet viabla celler erhållna (räknades med användning av Trypan blå-exklusion) av procent av det givna immuncellfragment ur den viabla celler grinden under flödescytometrisk analys. Vi sedan delade antalet livskraftiga totala immunceller, Gr-1 +, CD4 + eller CD8a + celler i Ox-behandlade möss med motsvarande siffror för fordonskontrollmöss, ger ossfaldig ökning av lymfocytundergrupper. Gr-1 + neutrofiler stod för 42% av singel, levande CD45 + B220 - CD11b - CD11c - celler i Ox-behandlade möss och 10% av denna population i EtOH-behandlade möss (Figur 2B). I Ox-behandlade möss, ~ 52% av gated CD3 + T-celler var CD8a + och ~ 34% var CD4 +, medan bärarkontroller, ~ 9% av T-celler var CD8a + och 57% var CD4 + (figur 2C) . Därför, med den teknik som beskrivs här, allergisk och icke-allergisk flank hud kan bearbetas för erhållande av enkelcellsuspensioner lämpliga för hög upplösning flödescytometrisk karakterisering av infiltrerande immuncellundergrupper.
| Celler undergrupper från mus flank hud | Ox / ox (3) | Ox / EtOH (3) | Vik Expansion (Ox / Ethanol) |
| per mm 2 vävnad | |||
| Totalt antal celler | 262,7 | 5,3 | 49,3 |
| CD45 + immunceller | 250,7 | 3,8 | 66,7 |
| CD4 + CD8 - celler | 6,5 | 0,9 | 7,2 |
| CD4 - CD8 + -celler | 10,6 | 0,1 | 72,9 |
| Neutrofiler | 8,6 | 1,5 | 5,6 |
Tabell 1. Cell avkastningen från allergisk flank huden ND4 honmöss. Viabla celler isolerade från flank hud räknades med användning av Trypan Blue-uteslutning, och normaliserades till celler / mm 2 vävnaden med utgångspunkt från det hudområde isolerades och antalet möss poolades per tisstämma beredning. Vi beräknade totala immuncellutbyte baseras på detektering av det hematopoietiska antigen CD45 på cellytan, och lymfocyt delmängds utbyten baserade på härstamningsspecifika ytmarkörer. Vi sedan delas antalet celler i Ox-behandlade möss genom siffrorna för fordonskontrollmöss, ger oss vika ökningar lymfocytundergrupper. Data som visas representerar poolade data från 2-3 möss per behandling, och är representativa för två oberoende experiment.
Figur 1. Enzym matsmältning och gradientrening av splenocyter bevara lymfocytundergrupper och cellaktiveringsmarkörer. Splenocyter tvättades under 1 h med HBSS medier, inkuberades med antingen kollagenas D eller HBSS medium enbart och renades med användning av en densitetsgradient för att avlägsna skräp och röda blodkroppar. T-celler identifierades som levande, CD45 +, härstamning (B220, CD11b, CD11c) <sup> - och CD3ɛ +. Frekvens av CD4 och CD8a T-celler inte ändras efter enzymatisk spjälkning (A). Ytors CD44 och CD62L på CD4 + T-celler ändrades inte efter enzymatisk rötning (B). Data som visas representerar sammanslagna data från 2-3 möss per behandling från ett enda experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Enzym matsmältning och gradientrening av hudceller avslöjar distinkta immun infiltrering i styrning kontra allergen utmanade mus flank hud. Tre flanken Ox utmaningar producera en ~ 67-faldig ökning av hud-infiltrerande immunceller i tidigare sensibiliserade ND4 Swiss-möss ( A). Tre Ox utmaningar PROV ocksåoked en ~ 6-faldig ökning av Gr-1 + neutrofiler (B), och ~ 73- och ~ 7-faldig ökning av CD8a + och CD4 + T-celler, respektive (C). Live CD45 + immunceller är gated från enstaka, låg framåt och sidospridning celler; neutrofiler och T-celler gated från B220 - CD11b - CD11c - levande enstaka celler. Räkningar utfördes med användning av en 1: 1 Trypanblått utspädning följande gradient densitetsseparation. Data visade representerar sammanslagna data från 2-3 möss i varje behandlingsgrupp, och är representativa för två oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Characterizing förändringar i huden hemmahörande leukocyter i gnagarmodeller av hudsjukdomar som atopisk dermatit eller psoriasis är viktigt för att förstå mekanistiska kopplingar mellan inflammatoriska celler tillströmning och sjukdomspatologin. Här beskriver vi en ekonomisk teknik för att isolera leukocyter från hudvävnad med basutrustning finns i de flesta biomedicinska forskningslaboratorier. Denna relativt snabb teknik undviker användningen av dyra vävnadsdissociering maskiner och anpassade rör och reagenser, bidrar till att bevara resurserna och samtidigt minimera hands-on tid på labbet bänken. Svag enzymatisk smälta och diskontinuerlig gradientseparation avlägsna huvuddelen av epitelceller och skräp, och de isolerade cellerna kan användas för en mängd olika tillämpningar nedströms inklusive flödescytometrisk analys, cellsortering, överföring, cellodling och stimulering in vitro-analyser. Enzymatisk digere med kollagenas D har någon effekt på T-cellytan markörintegritet och preserves cellviabilitet. Detta protokoll kan lätt modifieras för att behandla hud från andra än flankregioner.
De mest kritiska stegen i den här proceduren är 1) grundligt avlägsna eventuella fett- och bindväv samtidigt skörd huden, 2) hantering och bearbetning vävnad snabbt för att maximera infiltrera cellutbytet och samtidigt minimera celldöd, 3) försiktigt skiktning gradienten, och 4) noggrant extraktion av gränssnittet av gradienten. Innan du börjar ett storskaligt experiment är det viktigt att träna densitetsgradientcentrifugering media skiktning och gränssnitt bort. Man kan öva skörd av celler från en diskontinuerlig densitetsgradient genom att krossa en hel murin mjälte genom en 70 | im sil i 1 x PBS färgningsbuffert och utföra densitetsgradienten såsom beskrivet ovan i steg 5. Det är mycket lättare att se och extrahera gränsytan mellan 44% densitetsgradientcentrifugering media och 67% densitetsgradientcentrifugering media med splenocytes, på grund av det stora antalet immunceller är närvarande.
När du arbetar med densitetsgradienter, bör bubblor undvikas medan pipettering och lutning störningar bör minimeras. Den koniska rör innehållande gradienten bör hanteras försiktigt och hålls vertikalt i alla lägen. Densitetsgradientcentrifugering medielösningar bör alltid vara vid RT, serologiska pipetter inställda på lägsta möjliga frisläppningshastigheten, centrifugen hölls vid RT, inställd på låg acceleration med bromsen frånkopplad, och noggrant balanserad innan spinningen. När du arbetar med hud preparat som ger ett litet antal av infiltrerande leukocyter celler är inte alltid syns på gradienten gränssnittet. Således är det viktigt att göra den 44% densitetsgradientcentrifugering media med HBSS innehållande fenolrött, så att gränsytan lätt kan visualiseras även när ett skikt av celler inte kan skönjas. Dessutom är det viktigt att vara varsam men snabbt vid extrahering, tvättningoch bearbetning av hudvävnad för att undvika celldöd innan huden placeras i HBSS medier.
Om cellviabilitet eller renhet är låg, kortare (~ 20 min) uppslutningstider, kanske något lägre koncentrationer av kollagenas D (~ 0,5 mg / ml), eller Malningen vävnaden mer fint vara till hjälp. Eftersom över matsmältningen och nedbrytning av vävnad kan bidra till celldöd, kommer utredarna måste optimera den minimala koktiden som ger en tillräckligt stor cellprov storlek 17. Processen kommer sannolikt att kräva flera omgångar av optimering i händerna på enskilda utredare att standardisera teknik. Kollagenas D aktivitetsnivå kan också variera mellan tillverknings partier och justeringar av koktiden måste göras för varje parti enzym som används. Under optimeringen är det viktigt att fläckreferens cellsuspensioner (t.ex. mjälte) som renats med och utan en enzymatisk smälta steg med en pålitlig levande / död fläck samt immunceller linEage markörer (t.ex. CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.) för att säkerställa att cellpopulationer och ytmarkörer av intresse bevaras genom vävnaden rötningsprocessen. Om möjligt är det bra att utföra optimeringar på en flödescytometer som kan mäta fram och sidospridning bredd eller höjd samt området, för att utesluta cellaggregat. Slutligen bör cellsuspensionema prövas under ljusmikroskop för visuell bedömning av lönsamheten och allmän cellulär morfologi. Cellerna kan räknas manuellt med 0,4% trypanblått färgexklusion under ett ljusmikroskop eller på en flödescytometer med användning av räkningskulor. För studier som kräver strängare kvantifiering av specifika celltyper i den utskurna vävnaden, kan forskarna väga eller mäta volymen av vävnadsfragment före och efter uppslutning, och använd omfattningen av matsmältningen att mer exakt uppskatta antalet cellgrupper som finns i den vävnad som analyseras.
En begränsning hos dennaprotokollet är att den är särskilt anpassad till rening av immunceller. Om man är intresserad av isolering, rening och analys av en annan cellulär population (t.ex. hud epitelceller), densitetsgradienten set-up och den enzymatiska smälta protokollet kommer både sannolikt behov av att ändras och optimeras för att bäst isolera cellerna av intresse. Men gör detta protokoll för isolering och rening av både lymfoida och myeloida cellgrupper och kan därmed anpassas till de flesta immunologiska tillämpningar. En annan begränsning är att detta protokoll inte kan användas för att skilja mellan cellpopulationer infiltrerar dermis jämfört epidermis i huden. För att åstadkomma denna nivå av differentiering, skulle detta protokoll måste anpassas ytterligare med ytterligare åtgärder för att enzymatiskt separera dermis och epidermis före eller i stället för stegen här. Här tas prover poolade från ~ 3 möss för att underlätta multiparameter flödescytometrisk analys gör det svårt attdetektera variationen mellan biologiska replikat. Men beroende på nedströms tillämpningen av val, detta protokoll kan enkelt modifieras för att ge och använda prover från enstaka individer. Slutligen presenterade protokollet för unga här, kan ND4 honmöss måste ändras för möss i olika åldrar, kön eller stammar enligt forskarnas behov.
Sammanfattningsvis denna kombination av mild enzymatisk smälta och diskontinuerlig gradientseparation ger en enkel, effektiv och ekonomisk metod för att rena immunceller från inflammatoriska hudlesioner hos möss. Den kan användas och anpassas i stort sett över ett varierat utbud av gnagarmodeller av hud sjukdomar som ett praktiskt verktyg för att bedöma immun infiltration och isolera en ren, livskraftig population av leukocyter för tillämpningar efter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har några ekonomiska eller andra intressen att lämna ut.
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 till DC), National vulvodynia Association (tilldelning till DC), och Macalester College stött detta arbete. CB fick ett stipendium från Macalester College Beckman Scholars Program, som finansieras av Arnold och Mabel Beckman Foundation. BTF och TM stöds av JDRF 2-2011-662. Vi tackar Dr Jason Schenkel och Dr. Juliana Lewis för teknisk rådgivning, och alla nuvarande och tidigare medlemmar av Chatterjea labbet för deras hjälp och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T.
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R.
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
