Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

सुधार के 2 डी और 3 डी त्वचा Published: August 22, 2016 doi: 10.3791/53642
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 1,2,3
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Epithelial Biology Laboratory, Institute of Medical Biology, A*STAR, 3Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore

Summary

हम बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन में अमीर सेल व्युत्पन्न matrices प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, macromolecular crowders (एमएमसी) का उपयोग। इसके अलावा, हम एक प्रोटोकॉल जो 3 डी organotypic त्वचा सह संस्कृति पीढ़ी है, जो संस्कृति के समय को कम कर देता है, जबकि निर्माण की परिपक्वता को बनाए रखने में एमएमसी को शामिल किया गया प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

कोलेजन के ग्लाइकोप्रोटीन परिवार मानव शरीर में मुख्य संरचनात्मक प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है, और आधुनिक ऊतक इंजीनियरिंग में इस्तेमाल किया biomaterials के प्रमुख घटक हैं। के रूप में यह बेहद धीमी है, संयोजी ऊतक और बाद में ऊतक सामंजस्य की उप इष्टतम गठन में जिसके परिणामस्वरूप, विशेष रूप से त्वचा मॉडल में एक तकनीकी अड़चन, इन विट्रो में कोलेजन के बयान है। यहाँ, हम एक विधि है जो त्वचा संस्कृतियों के लिए विभिन्न आकार सुक्रोज सह पॉलिमर के अलावा शामिल macromolecular भीड़ (एमएमसी), जो कोलेजन बयान का एक नाटकीय वृद्धि में परिणाम उत्पन्न करने का वर्णन है। विशेष रूप से, त्वचीय fibroblasts नियंत्रण करने के लिए की तुलना में एमएमसी के तहत कोलेजन मैं / चतुर्थ / सातवीं और fibronectin की एक महत्वपूर्ण राशि जमा किया।

प्रोटोकॉल भी एक विधि का वर्णन भीड़ सेल परतों decellularize करने के लिए है, जो संस्कृति सतह पर बनाए रखा गया बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के महत्वपूर्ण मात्रा को प्रकाश में लाने के रूप में immunocy इसका सबूतtochemistry। कुल मैट्रिक्स द्रव्यमान और वितरण पैटर्न हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अध्ययन किया गया था। रचना और आकृति विज्ञान बदलती के दिलचस्प है, fibroblasts, केरेटिनकोशिकाओं और सह संस्कृतियों का उत्पादन सेल व्युत्पन्न matrices (सीडीएम)। सीडीएम इस प्रकार अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुप्रयोगों की दिशा में बढ़ रहा है, के रूप में माध्यमिक सेल बोने, जहां कोटिंग्स या scaffolds के वर्तमान उपयोग, आम तौर पर xenogenic पशु स्रोतों से बचा जा सकता है के लिए "जैव scaffolds 'का इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल एक 3 डी organotypic त्वचा सह संस्कृति मॉडल है जो, Dermo-एपिडर्मल जंक्शन (DEJ) में ईसीएम बयान को बढ़ाने के लिए विशेष रूप से पर्याप्त था, कोलेजन सातवीं, प्रमुख घटक के जलमग्न चरण के दौरान एमएमसी के आवेदन का वर्णन के तंतुओं प्रस्तोता। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एमएमसी के साथ विकसित संस्कृतियों में तंतुओं प्रस्तोता नियंत्रण की तुलना के रूप में की उपस्थिति की पुष्टि की। प्रस्तोता तंतुओं एपिडर्मिस को डर्मिस तार के रूप में यह महत्वपूर्ण है, इसलिए,एक पूर्व गठित परिपक्व DEJ भ्रष्टाचार स्थिरता और कुल मिलाकर घाव भरने के मामले में त्वचा भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं लाभ हो सकता है खा रहे हैं। इसके अलावा, संस्कृति समय 3 सप्ताह के लिए 5 हफ्तों से सघन था एक परिपक्व निर्माण प्राप्त करने के लिए, जब एमएमसी का उपयोग कर, लागत को कम करने।

Introduction

त्वचा पानी की कमी और रोगज़नक़ प्रवेश को रोकने के द्वारा एक सुरक्षात्मक बाधा रूपों। यह तीन प्रमुख घटकों से बना है; stromal अमीर डर्मिस 1, एक स्तरीकृत एपिडर्मिस 2,3,4 यह की चोटी पर, और 5,6 के बीच में Dermo-एपिडर्मल जंक्शन। डर्मिस कोलेजन और लोचदार फाइबर का काफी हद तक बना है और कम fibroblasts 7 के साथ आबादी है। इसके विपरीत, सेल अमीर एपिडर्मिस केरेटिनकोशिकाओं की कई परतों से बना है। भीतरी सबसे परत के केरेटिनकोशिकाओं proliferative हैं और नए बेसल कोशिकाओं जो नवीनीकृत और टर्मिनली फर्क केरेटिनकोशिकाओं कि लगातार त्वचा की बाहरी परत-सबसे करने के लिए कदम और उनके नाभिक और cytoplasmic सामग्री खो दिया है, एक श्रृंगित परत है जो होकर गुजरती है, जिसके परिणामस्वरूप की जगह प्रदान करते हैं विशल्कन।

त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन, तहखाने झिल्ली का एक विशिष्ट प्रकार, एक जटिल परस्पर मैट्रिक्स अणु है, जो tethe की रचना की संरचना हैडर्मिस को एपिडर्मिस रु। कोलेजन मैं डर्मिस के तंतुओं कोलेजन तंतुओं सातवीं जो कोलेजन चतुर्थ अमीर पटल Densa के लिए लंगर डाले हैं प्रस्तोता के साथ जिल्द। एंकरिंग तंतु (laminin 5, कोलेजन XVII और इंटेग्रिन) बदले में बेसल keratinocytes के hemidesmosomes साथ पटल Densa कनेक्ट। बेसल keratinocytes (परत basale) पैदा करना और नवीनीकृत करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह से अलग और suprabasal परतों के लिए फार्म विभक्त के रूप में की क्षमता है; परत spinosum, परत granulosum, और अंत में परत corneum, जो पर्यावरण के साथ त्वचा के संपर्क सतह का प्रतिनिधित्व करता है। श्रृंगित परत करने के लिए बेसल परत से एन मार्ग, केरेटिनकोशिकाओं cytokeratins की अभिव्यक्ति पैटर्न स्विच और अंत में apoptosis से गुजरना और श्रृंगित में खुद को डिब्बे में बंद लिफाफे, विशिष्ट प्रोटीन है कि covalently transglutaminase गतिविधि के द्वारा crosslinked कर रहे हैं के hulls।

त्वचा और इन विट्रो में इसकी परतों पुनः, की जटिल संरचना सहित त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन और चमड़े का बाह्य मैट्रिक्स, और cornification प्रक्रिया का अनुकरण करने के लिए, लंबे समय से intrigued वैज्ञानिकों और एक चुनौतीपूर्ण कार्य के रूप में bioengineers है। , रोगी बायोप्सी से त्वचा कोशिकाओं के सफल निकासी और रोगी व्युत्पन्न त्वचा कोशिकाओं 8 का उपयोग त्वचा organotypic संस्कृतियों की पीढ़ी वहाँ त्वचा ऊतक इंजीनियरिंग में उल्लेखनीय प्रगति की है, उदाहरण के लिए किया गया है। हालांकि, अनसुलझी समस्याओं को खुद त्वचा कोशिकाओं द्वारा बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का स्राव गरीब से संबंधित और उप इष्टतम त्वचा मॉडल में जिसके परिणामस्वरूप रहते हैं। इसके अलावा, समय 3 डी organotypic त्वचा सह संस्कृति मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग उत्पन्न करने के लिए आवश्यक चार से आठ सप्ताह के बीच होती है, एक समय सीमा है जो संभावित macromolecular crowders के समावेश के साथ छोटा हो सकता है। संस्कृति के समय को कम करना, अभिकर्मक लागत की बचत होती है सेल वार्धक्य की घटनाओं को कम कर देता है और रोगी के समय के इंतजार के उत्पाद क्लिनिक में इस्तेमाल किया जाना चाहिए कम कर देता है।

टी "> Macromolecular भीड़ (एमएमसी) संस्कृति के माध्यम से विशिष्ट अणुओं को शुरू बाहर रखा मात्रा प्रभाव। ये procollagen के proteolytic दरार जो मानक जलीय संस्कृति की स्थिति 9-13 के तहत मंदा है सहित enzymatic प्रतिक्रिया दरों को प्रभावित। एमएमसी के तहत, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने के लिए शामिल अभिकर्मकों 14,15 में जिसके परिणामस्वरूप की मात्रा बढ़ रही uncrowded नियंत्रण 10 की तुलना में procollagen दरार, कोलेजन मैं भीड़ संस्कृतियों में अणुओं की वृद्धि हुई राशि के मामले में, बिना तेजी रहे हैं। कोलेजन को procollagen के रूपांतरण के रूप में कोलेजन के गठन की अनुमति देता है विधानसभाओं, fibroblasts 48 घंटे के लिए एमएमसी के साथ सुसंस्कृत रूप से चार सप्ताह 11,16,17 के लिए नजर रखी uncrowded fibroblast संस्कृतियों की तुलना में काफी अधिक कोलेजन झुकेंगे रहा। enzymatic गतिविधियों है कि गठन, स्थिरीकरण और ईसीएम के पुनर्गठन को प्रभावित, एमएमसी भी पर प्रभाव के अलावा सीधे बढ़ाने और कोलेजन मिलाना दिखाया गया हैफाइबर गठन 18,19।

हम यहाँ एक तरीका मौजूद है त्वचा कोशिकाओं द्वारा बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) उत्पादन, विशेष रूप से, त्वचीय fibroblasts और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं में बढ़ाने के लिए। इसके अलावा, हम बताते हैं कि समृद्ध ईसीएम monolayer संस्कृतियों में एमएमसी के तहत उत्पादित decellularized और शुद्ध सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स (सीडीएम) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

हम एक गैर-परंपरागत दृष्टिकोण का उपयोग कल्पना करने के लिए और पूरी तरह से ईसीएम एमएमसी के साथ सुसंस्कृत त्वचा कोशिकाओं द्वारा जमा की सराहना करते हैं। हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी आमतौर पर सेल मैट्रिक्स बातचीत या सेल करने वाली कांच संपर्क अंक के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक मैट्रिक्स की कुल राशि कांच की सतह पर जमा देखने के लिए हमारी प्रणाली में उपयोग किया गया था। हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी उपस्थिति और एमएमसी के अभाव में फ्लोरोसेंट immunostaining के साथ मिलकर किया गया था बाह्य मैट्रिक्स संरचना और पैटर्न के संदर्भ में जानकारी की सबसे अधिक राशि प्राप्त करने के लिए।

Organotypiसी त्वचा सह संस्कृतियों एक शास्त्रीय विधि से एक तीन आयामी संदर्भ में इन विट्रो में त्वचा मॉडल है। दो आयामी सह संस्कृतियों में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध करा सकता है, यह जब इस डेटा का अनुवाद है और इसे वापस एक विवो वातावरण है, जो स्वाभाविक एक तीन आयामी संरचना है को लागू करने के लिए सीमित है। त्वचा keratinocytes, विशेष रूप से, ध्रुवीकृत कर रहे हैं और शिखर और बेसल वर्ग जो homeostasis और सेल पालन के लिए आवश्यक होते हैं। इसके अलावा, इस तरह के केरातिन 1, केरातिन 10 और filaggrin के रूप में बेसल परत के ऊपर केरेटिनकोशिकाओं में ठेठ suprabasal प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तरीकरण और keratinocytes के टर्मिनल भेदभाव के पाठ्यक्रम में ही मौजूद है। टर्मिनल भेदभाव ठेठ monolayer संस्कृतियों में शायद ही मौजूद है, suprabasal प्रोटीन अभिव्यक्ति सामान्य रूप से इस संस्कृति प्रणाली में हासिल नहीं है। इसलिए, organotypic संस्कृतियों संस्कृति के माध्यम में डूबे हुए शुरू है, लेकिन उसके बाद keratinocyt ड्राइव करने के लिए एक हवा तरल इंटरफेस करने के लिए उठा रहे हैंई भेदभाव। यह स्तरीकरण मार्कर, यहां तक ​​कि cornification और एपिडर्मल शरीर क्रिया विज्ञान के एक आम तौर पर बेहतर प्रतिबिंब की अभिव्यक्ति में यह परिणाम है। जबकि अन्य समूहों के पहले सफलतापूर्वक organotypic त्वचा सह संस्कृतियों उत्पन्न किया है, एक कार्यात्मक Dermo-एपिडर्मल जंक्शन क्षेत्र की स्थापना एक मुद्दा रहा है। यहाँ, हम एक बढ़ाया तहखाने झिल्ली के साथ organotypic त्वचा सह संस्कृतियों संवर्धन, एक संक्षिप्त समय सीमा में करने के लिए और इन निर्माणों की परिपक्वता से समझौता किए बिना एक नया तरीका मौजूद है। यह इन विट्रो मॉडलिंग के लिए त्वचा mimetics, त्वचा जीव विज्ञान के अध्ययन और स्क्रीनिंग परीक्षणों की एक वर्गीकरण प्रदान करेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 2 डी स्किन सेल संस्कृतियों में Macromolecular भीड़

  1. बीज 50,000 कोशिकाओं (प्राथमिक fibroblasts या प्राथमिक keratinocytes या प्राथमिक fibroblasts और केरेटिनकोशिकाओं के सह संस्कृति) एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से। इसी प्रकार की कोशिका विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर में बीज कोशिकाओं।
  2. कोशिकाओं रात भर पालन करने के लिए, 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अनुमति दें।
  3. पुराने मीडिया त्यागें और 1 मिलीलीटर ताजा मीडिया macromolecular crowders और 100 माइक्रोन के एस्कॉर्बिक एसिड युक्त के साथ बदलें। एक CROWDER / एमएल Ficoll 70 और 25 मिलीग्राम / एमएल Ficoll 400. उपयोग fibroblast मीडिया (एफएम) DMEM से मिलकर 37.5 मिलीग्राम से मिलकर कॉकटेल का उपयोग 10% FBS और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक। एक सीरम मुक्त मीडिया, KSFM या सीएनटी-57 में केरेटिनकोशिकाओं आगे बढ़ें। 50% और 50% एफएम सीरम मुक्त मीडिया का एक मिश्रण में सह संस्कृतियों को बनाए रखें।
  4. हर 2 दिन 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 दिनों के लिए संस्कृतियों सेते हैं, एक मीडिया परिवर्तन के साथ।

2. त्वचा सेल संस्कृतियों पर फ्लोरोसेंट Immunostaining

  1. सेल संस्कृतियों 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  2. या तो मेथनॉल या paraformaldehyde (एंटीबॉडी विशिष्टताओं के आधार पर) के साथ सेल संस्कृतियों को ठीक करें।
    1. मेथनॉल निर्धारण के लिए
      1. अशेष प्रत्येक कुएं में ठंड मेथनॉल के 500 μl और 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। महाप्राण लगानेवाला और मेथनॉल अपशिष्ट त्यागें। एक लामिना धूआं हुड में शुष्क हवा।
    2. Paraformaldehyde निर्धारण के लिए
      1. अशेष प्रत्येक कुएं में 2% paraformaldehyde समाधान के 500 μl और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। महाप्राण लगानेवाला और paraformaldehyde अपशिष्ट त्यागें।
      2. 1x पीबीएस के साथ धोने, तीन washes, धोने प्रति 5 मिनट के लिए।
      3. अशेष प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर।
  3. फ्लोरोसेंट Immunostaining एंटीबॉडी का उपयोग
    1. अशेष अच्छी तरह से 3% गोजातीय सीरम albumin (1x पीबीएस में पतला) प्रत्येक में 500 μl। 3 के लिए कमरे के तापमान पर सेते0 मिनट। अवरुद्ध समाधान Aspirate और त्यागें।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी
      1. अशेष प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μl: सीधे इमेजिंग थाली से लिए: प्रत्येक कुएं में (1 100 में 10% कमजोर पड़ने बकरी सीरम) समाधान और कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए सेते हैं।
      2. अशेष प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 μl (1: 100 में 10% कमजोर पड़ने बकरी सीरम) समाधान Parafilm के एक फ्लैट टुकड़ा पर coverslips के लिए। Parafilm पर coverslip रखें, सेल पक्ष (कोशिकाओं के साथ coverslip का हिस्सा) समाधान का सामना करना पड़ के साथ। पूरे सेल-साइड कवर, कोई बुलबुले के साथ। कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और त्यागें।
    4. 1x पीबीएस के साथ धोने, तीन washes, धोने प्रति 5 मिनट के लिए।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी
      1. अशेष माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μl: इमेजिंग थाली से सीधे के लिए: प्रत्येक कुएं में (1 400 10 में कमजोर पड़ने% बकरी सीरम) समाधान और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, एल्यूमीनियम के लिए के साथ थाली को कवर आईएल।
      2. अशेष माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 μl (1: 400: 10% कमजोर पड़ने बकरी सीरम) समाधान Parafilm के एक फ्लैट टुकड़ा पर coverslips के लिए। Parafilm पर coverslip रखें, सेल पक्ष (कोशिकाओं के साथ coverslip का हिस्सा) समाधान का सामना करना पड़ के साथ। पूरे सेल-साइड कवर, कोई बुलबुले के साथ। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ Parafilm कवर।
    6. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और त्यागें।
    7. 1x पीबीएस के साथ धोने, तीन washes, धोने प्रति 5 मिनट के लिए। अशेष प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर।
    8. बढ़ते
      1. थाली से सीधे इमेजिंग के लिए: माउंट नहीं है। माइक्रोस्कोप के लिए आगे बढ़ें।
      2. माउंट coverslips, मीडिया बढ़ते, एक गिलास स्लाइड पर में: coverslips की इमेजिंग के लिए। एक कंटेनर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर में सूखी रात भर। माइक्रोस्कोप के लिए आगे बढ़ें।
  4. एक 40X / 1.30 तेल उद्देश्य के साथ एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर छवियों मोल।
ई "स्किन सेल संस्कृतियों के> 3। पश्चिमी सोख्ता

  1. सेल परतों 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  2. अशेष lysis बफर के 100 μl (देखें माल की सूची) प्रत्येक अच्छी तरह से (6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप) में। एक microcentrifuge ट्यूब में एक सेल खुरचनी और हस्तांतरण समाधान के साथ सेल परत परिमार्जन।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,330 XG पर अपकेंद्रित्र समाधान। एक और microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें।
  4. नमूना बफर के 5 μl और एजेंट को कम करने के 2 μl के साथ प्रत्येक नमूने की 13 μl मिक्स (देखें सामग्री सूची)। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीट नमूने हैं।
  5. 1 मिनट के लिए 15,330 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने संक्षेपण पानी इकट्ठा करने के लिए। एक पूर्व डाली पृष्ठ जेल में लोड नमूने और लगभग 1 घंटे के लिए 100 वी पर चलाते हैं।
  6. एक nitrocellulose झिल्ली को अलग प्रोटीन का स्थानांतरण करने, जेल और कागज के टुकड़े और (एक ही आकार के) स्पंज के बीच झिल्ली सैंडविच। सुनिश्चित जेल, झिल्ली, कागजात और स्पंज के बीच कोई बुलबुले हैंएस। सैंडविच कैसेट बंद करो और 2 घंटा पर के लिए 70 वी में हस्तांतरण चलाते हैं।
  7. जांच के लिए स्थानांतरण पूरा हो गया था, तो 0.1% पीबीएस बीच -20, तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट के साथ 10 मिलीलीटर रक्तवर्ण रंग एस धो झिल्ली के साथ झिल्ली सेते हैं।
  8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% दूध के 10 मिलीलीटर के साथ ब्लॉक। 0.1% पीबीएस बीच -20, तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट के साथ झिल्ली धो लें।
  9. 90 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी (: 1,000 5% दूध में कमजोर पड़ने माउस विरोधी कोलेजन सातवीं, एलएच 7.2, 1) के साथ सेते हैं। 0.1% पीबीएस बीच -20, तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट के साथ झिल्ली धो लें।
  10. 30 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी (: 2,000 5% दूध में कमजोर पड़ने बकरी विरोधी माउस एचआरपी, 1) के साथ सेते हैं। 0.1% पीबीएस बीच -20, तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट के साथ झिल्ली धो लें।
  11. एक कैसेट झिल्ली स्थानांतरण और ईसीएल पता लगाने अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें। झिल्ली पर एक स्पष्ट, पतली प्लास्टिक शीट रखें।
  12. chemiluminescence का पता लगाने के लिए, प्लास्टिक शीट पर एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील फिल्म जगह है और कैसेट बंद करें। 2 के बाद-5 मिनट, कैसेट से फिल्म को हटाने और एक डेवलपर में जगह।

4. बनाने और एक सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स का उपयोग

  1. बीज 50,000 कोशिकाओं (प्राथमिक fibroblasts या प्राथमिक keratinocytes या प्राथमिक fibroblasts और केरेटिनकोशिकाओं के सह संस्कृति) एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से।
  2. कोशिकाओं रात भर पालन करने के लिए, 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अनुमति दें।
  3. पुराने मीडिया त्यागें और ताजा मीडिया macromolecular crowders और 100 माइक्रोन के एस्कॉर्बिक एसिड युक्त के साथ बदलें। CROWDER कॉकटेल Ficoll 70 और 25 मिलीग्राम / एमएल Ficoll 400 तंतुकोशिका मीडिया (एफएम) 37.5 मिलीग्राम के होते हैं / एमएल 10% FBS और 1% कलम strep के साथ पूरक DMEM के होते हैं। केरेटिनकोशिकाएं एक सीरम मुक्त मीडिया, KSFM या सीएनटी-57 में बड़े हो रहे हैं। 50% और 50% एफएम KSFM या सीएनटी-57 का एक मिश्रण में सह संस्कृतियों को बनाए रखें।
  4. 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 दिनों के लिए संस्कृतियों सेते हैं, बदलते मीडिया हर 2 दिन।
  5. सेल परतों Decellularize एक सेल व्युत्पन्न मातृ प्राप्त करने के लिएएक्स (एफ चटाई = fibroblast व्युत्पन्न मैट्रिक्स, कश्मीर चटाई = keratinocyte व्युत्पन्न मैट्रिक्स, सह चटाई = मैट्रिक्स fibroblasts और keratinocytes के एक सह-संस्कृति से प्राप्त)।
    1. सेल परतों 1x पीबीएस में दो बार धोएं।
    2. 0.5% सोडियम deoxycholate के 250 μl जोड़ें। सेते हैं, बर्फ पर, 10 मिनट के लिए। महाप्राण सेल lysate।
    3. दोहराएँ चरण 4.5.2 तीन बार।
    4. धो दो बार सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स आसुत एच 2 ओ में 1x पीबीएस में सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स रखें। Matrices 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  6. माध्यमिक सेल निलंबन (F-चटाई के शीर्ष पर केरेटिनकोशिकाएं सीडिंग उदाहरण के लिए) तैयार करें।
    1. महाप्राण 1x पीबीएस।
    2. सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स (F-मैट) के शीर्ष पर 50,000 केरेटिनकोशिकाओं बीज। कोशिकाओं रात भर पालन करने के लिए, 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अनुमति दें।
      नोट: Assays पक्षपाती कोशिकाओं पर सीधे किया जा सकता है।

5. सेल की विशेषतानिकाली गई मैट्रिक्स

  1. फ्लोरोसेंट immunostaining: प्रोटोकॉल 2 का संदर्भ लें।
  2. हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी
    1. कांच coverslips, प्रोटोकॉल 4.1-4.5 निम्नलिखित करने पर बीज कोशिकाओं।
    2. सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स प्राप्त करने के बाद, निम्न प्रोटोकॉल 2.2 नमूने तय कर लो।
      नोट: एंटीबॉडी धुंधला वैकल्पिक है। यदि आवश्यक हो, प्रोटोकॉल 2.3 का संदर्भ लें।
    3. एक 40X / 1.30 तेल उद्देश्य के साथ एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग करके छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करना। 74 मिमी पर पिनहोल सेट करें।
    4. हस्तक्षेप पुन FL ection माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) चैनल और फिल्टर के लिए लाल चैनल uorescence FL के लिए बीपी 575-615 आईआर के लिए एल.पी. 505 का प्रयोग करें। आईआरएम चैनल के लिए प्रयोग NT 80/20 और एचएफटी 405/488/561, NFT 565, बीम splitters के लिए लाल चैनल uorescence FL के लिए थाली। लाल चैनल और HeNe633 आईआरएम चैनल के लिए 5.0% बिजली (तरंग दैर्ध्य 633 एनएम) uorescence FL के लिए DPSS 561-10 (तरंग दैर्ध्य 561 एनएम) 1.1% बिजली पर: निम्नलिखित लेज़रों का प्रयोग करें।

6. 3 डी Organotypic त्वचा सह संस्कृति

  1. कास्ट एक कोलेजन जेल, fibroblasts समझाया साथ, एक सेल संस्कृति डालने (6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप) में।
    1. विभाज्य एक ठंड बीकर चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार मैं के 10 मिलीलीटर।
    2. ठंड DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 1 एम NaOH के 0.5 मिलीलीटर अम्लीय कोलेजन को बेअसर करने के लिए जोड़ें। fibroblast निलंबन (1,200,000 fibroblasts युक्त) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 6 अच्छी तरह से थाली के भीतर सेल संस्कृति सम्मिलित करने के लिए समाधान स्थानांतरण, सर्दी पिपेट में। कुल समाधान के 12 मिलीलीटर समान रूप से 6 सेल संस्कृति आवेषण में बांटा गया है।
    4. 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जेल सेते हैं, 1 घंटे के लिए।
    5. बाद जेल जम गया है, एफएम में जेल डूब। 24 घंटे के बाद, पुराने मीडिया त्यागने और ताजा मीडिया के साथ की जगह है, macromolecular crowders हैं। सेल संस्कृति डालने के इंटीरियर के लिए 2 मिलीलीटर और 2 मिलीलीटर की एक मात्रा सेल संस्कृति डालने के बाहर करने के लिए जोड़ें।
  2. 24 घंटे के बाद,कोलेजन जेल के शीर्ष पर केरेटिनकोशिकाएं बीज।
    1. Trypsinize 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.125% trypsin / chelating एजेंट का उपयोग कर keratinocytes। कोशिकाओं को बेदखल और सीरम युक्त मीडिया के साथ trypsin बेअसर करने के लिए कुप्पी के पक्ष ठोकर धीरे। कोशिकाओं की गणना और keratinocyte निलंबन तैयार (जेल प्रति 300,000 केरेटिनकोशिकाओं और 200 μl मीडिया में निलंबित कर दिया)।
    2. सेल संस्कृति डालने से महाप्राण पुराने मीडिया। जेल के शीर्ष पर केरेटिनकोशिकाओं जोड़ें।
    3. 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जेल सेते हैं, 1 घंटे के लिए।
    4. बाद केरेटिनकोशिकाओं जेल सतह से जुड़ी है, 2 मिलीलीटर KSFM या के साथ जेल डूब सीएनटी-57-सेल संस्कृति डालने के बाहर करने के लिए एफएम के सेल संस्कृति डालने के अंदर करने के लिए और 2 मिलीलीटर।
  3. 24 घंटे के बाद, पुराने मीडिया त्यागने और ताजा मीडिया के साथ की जगह है, macromolecular crowders हैं।
  4. जलमग्न संस्कृति के 7 दिनों के बाद, एक हवा तरल इंटरफेस संस्कृति बढ़ा।
    1. सेल संस्कृति आईएनएस स्थानांतरणएक गहरी अच्छी तरह से थाली करने के लिए ईआरटी। सेल संस्कृति डालने के बाहर करने के लिए 10 मिलीलीटर स्तरीकरण मीडिया जोड़ें। सेल संस्कृति डालने सूखे के इंटीरियर रखें।
  5. 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृतियों सेते हैं और हर 3 दिन बदल मीडिया अगले 14 दिनों के लिए।
    नोट: हवा तरल इंटरफेस में 2 सप्ताह के बाद, त्वचा बराबर परिपक्व है और काटा जा सकता है (या तो तस्वीर जमे हुए या formalin तय)।

7. हार्वेस्ट और Organotypic की विशेषता त्वचा समकक्ष

  1. महाप्राण स्तरीकरण मीडिया।
  2. चिमटी का प्रयोग, एक कागज तौलिया पर स्थानांतरित संस्कृति सम्मिलित करता है और डालने के आधार से शेष मीडिया दूर थपका।
  3. एक छुरी का प्रयोग, संस्कृति डालने के भीतरी परिधि के साथ काटा।
  4. (पीईटी झिल्ली के साथ एक साथ) organotypic त्वचा सह संस्कृति को ठीक करें।
    1. स्नैप रुक
      1. एक cryomold को जेल का निर्माण स्थानांतरण। अक्टूबर साथ cryomold के इंटीरियर को कवरयौगिक। तरल नाइट्रोजन में cryomold 10 सेकंड के लिए रखें।
      2. चिमटी का प्रयोग, तरल नाइट्रोजन से जमे हुए cryomold हटाने एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए नमूनों की दुकान।
      3. धारा cryostat के साथ जमे हुए नमूने, 7 माइक्रोन मोटाई के एक वर्ग के साथ।
    2. formalin निर्धारण
      1. एक 'बायोप्सी स्पंज पैड' 'बायोप्सी कैसेट' में रखें। स्थानांतरण जेल स्पंज पैड पर निर्माण। जेल निर्माण के शीर्ष पर धीरे एक और स्पंज पैड रखें। कैसेट बंद करें।
      2. पूरी तरह से 48 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में कैसेट डूब कमरे के तापमान पर। कैसेट निकालें और formalin अपशिष्ट त्यागें।
      3. पहले एक इथेनॉल श्रृंखला के साथ dehydrating और फिर धीरे-धीरे मोम के साथ नमूना घुसपैठ द्वारा एक मोम ब्लॉक में निश्चित नमूना शामिल करें। खंड एक microtome साथ मोम ब्लॉक।
  5. त्वचा के बराबर की विशेषता
    1. immunostaining
      1. जमे हुए वर्गों के लिए:
        1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10% बकरी सीरम (1x पीबीएस में पतला) में वर्गों सेते हैं। 1x पीबीएस में धो वर्गों बकरी सीरम हटा दें।
        2. कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते (10% बकरी सीरम में 100 कमजोर पड़ने 1)। तीन बार, धोने प्रति 5 मिनट 1x पीबीएस में वर्गों को धो लें।
        3. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं (1: 10% बकरी सीरम में 400 कमजोर पड़ने) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए, एक कंटेनर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाता है। तीन बार, धोने प्रति 5 मिनट 1x पीबीएस में वर्गों को धो लें।
        4. माउंट स्लाइड, मीडिया बढ़ते, एक coverglass पर साथ। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर के नमूने और रातोंरात सूखे की अनुमति देते हैं।
        5. छवि एक 40X / 1.30 तेल उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग।
      2. Formalin तय आयल एम्बेडेड वर्गों के लिए:
        1. Dewax वर्गों (और rehydrate) पानी के लिए इथेनॉल का प्रतिशत उतरते में (ज़ाइलीन - 100% इथेनॉल- 90% इथेनॉल - 80% इथेनॉल - 70% इथेनॉल - पानी)। पूरी तरह से समाधान में नमूने डूब। प्रत्येक डीवैक्सिंग चरण 3 मिनट होना चाहिए।
        2. 30 मिनट के लिए 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में वर्गों सेते हैं। 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में वर्गों को धो लें।
        3. 20 मिनट के लिए साइट्रेट समाधान में वर्गों (10 मिलीलीटर साइट्रेट समाधान 90 मिलीलीटर पानी में भंग कर रहा है) 120 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। स्लाइड कमरे के तापमान पर, रात भर शांत करने के लिए अनुमति दें। तीन बार, धोने प्रति 5 मिनट 1x पीबीएस में वर्गों को धो लें।
        4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10% बकरी सीरम (1x पीबीएस में पतला) में वर्गों सेते हैं। 1x पीबीएस में धो वर्गों बकरी सीरम हटा दें।
        5. कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते (10% बकरी सीरम में 100 कमजोर पड़ने 1)। तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट 1x पीबीएस में वर्गों को धो लें।
        6. 30 मिनट के लिए एचआरपी लेबल बहुलक (undiluted), कमरे के तापमान पर साथ वर्गों सेते हैं। 1x पीबीएस, तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट के साथ वर्गों को धो लें।
        7. एक microcentrifuge ट्यूब, 1 मिलीलीटर गठबंधनथपका सब्सट्रेट (3,3'-diaminobenzidine) वर्णकोत्पादक की 1 बूंद के साथ। 15 सेकंड के लिए इस समाधान के साथ वर्गों सेते - 5 मिनट (भूरे रंग = सकारात्मक संकेत)।
        8. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, पानी चलाने में वर्गों धो लें।
        9. hematoxylin साथ Counterstain नाभिक, 5 मिनट के लिए। पानी चलाने में वर्गों कुल्ला।
        10. एसिड शराब समाधान में वर्गों सेते हैं, 1 मिनट के लिए। पानी चलाने में वर्गों कुल्ला।
        11. स्कॉट के नल के पानी के घोल में वर्गों सेते हैं, 2 मिनट के लिए। पानी चलाने में वर्गों कुल्ला।
        12. वैकल्पिक: 1 मिनट के लिए eosin में वर्गों सेते हैं और बहते पानी में धो लें।
        13. इथेनॉल के आरोही प्रतिशत xylene करने में वर्गों निर्जलीकरण (- 80% इथेनॉल - 70% इथेनॉल के 90% इथेनॉल - 100% इथेनॉल - xylene)। सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से मंच प्रति 3 मिनट के लिए डूबे हुए हैं।
        14. माउंट स्लाइड, बढ़ते मीडिया का उपयोग कर एक coverglass करने के लिए। शुष्क हवा रातोंरात।
        15. छवि एक 40X / 1.30 तेल उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग।
    2. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एंकरिंग फाइब्रिल्स कल्पना करने के लिए)
      1. 72 घंटे के लिए 2.5% glutaraldehyde में नमूने को ठीक करें।
      2. 1x पीबीएस में धो नमूने, तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट।
      3. छोटे-छोटे टुकड़ों (1 मिमी 3) में काटें। 1% आज़मियम tetroxide, 7.4 पीएच, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पोस्ट तय नमूने हैं। आसुत जल में धो नमूने हैं।
        सावधानी: आज़मियम tetroxide जहरीला और विषैला होता है और एक धूआं हुड में सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
      4. कदम प्रति 20 मिनट के लिए (एसीटोन - 50% इथेनॉल - 75% इथेनॉल - 95% इथेनॉल - - 100% इथेनॉल के 25% इथेनॉल) एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण।
      5. 100% एसीटोन में नमूने भिगोने से घुसपैठ: araldite राल (1: 1): 1 घंटे के लिए 3, द्वारा पीछा किया 1: 6 रातों-रात 1 में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए और फिर। कमरे के तापमान पर 2 घंटा, एक दूसरे 40 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नए सिरे से araldite राल के परिवर्तन के द्वारा पीछा के लिए ताजा araldite राल में नमूना लेना। तीसरे ताजा एक छोड़ दो45 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए raldite राल परिवर्तन और 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए चौथे ताजा araldite राल परिवर्तन छोड़ दें।
      6. 24 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते polymerization की अनुमति है।
      7. एक गिलास चाकू का उपयोग कर धारा नमूने 1 माइक्रोन की मोटाई के साथ अर्द्ध पतली वर्गों प्राप्त करने के लिए। methylene नीले रंग के साथ दाग खंड ऊतक विज्ञान निरीक्षण करने के लिए। धारा नमूना 70 एनएम के अति पतली वर्गों को प्राप्त करने और एक तांबे ग्रिड पर प्रत्येक अनुभाग इकट्ठा करने के लिए।
      8. 15 मिनट 10 मिनट के लिए 3% का नेतृत्व साइट्रेट समाधान द्वारा पीछा के लिए 5% uranyl एसीटेट समाधान के साथ दाग वर्गों।
      9. एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (100 केवी) के साथ छवियों, 30,000X की एक बढ़ाई मोल।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Macromolecular भीड़ ईसीएम बयान को बढ़ाने के लिए, विशेष रूप से सक्षम था, fibroblasts अधिक कोलेजन मैं, चतुर्थ और fibronectin के रूप में संस्कृतियों को नियंत्रित करने की तुलना में जमा (चित्रा 1, सेल परत; 1 ए, कोलेजन मैं; 1 बी, कोलेजन चतुर्थ, 1C, फ़ाइब्रोनेक्टिन)। Decellularization पर, यह स्पष्ट हो गया था कि fibroblasts थे कोलेजन मैं, चतुर्थ और fibronectin का मुख्य जमाकर्ताओं keratinocytes (चित्रा 1, मैट्रिक्स) की तुलना में।

चित्रा 2 में, यह देखा गया है कि केरेटिनकोशिकाओं fibroblasts के बजाय कोलेजन सातवीं के मुख्य निर्माता थे। यह कोलेजन सातवीं की पहली रिपोर्ट में इन विट्रो में सफलतापूर्वक जमा (बेनी एट अल, 2015) है।

सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स विशिष्ट antibod का उपयोग कर immunofluorescence के माध्यम से होती थीएँ। हालांकि यह एक क्लासिक दृष्टिकोण है, यह महत्वपूर्ण था उसकी समग्रता में ईसीएम कल्पना करने के लिए और पूरी तरह से macromolecular crowders के प्रभाव की सराहना करते हैं। हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) का उपयोग करना, मैट्रिक्स की पूर्ण सीमा तक कब्जा कर लिया था (चित्रा 3)। आईआरएम छवि के साथ एंटीबॉडी धुंधला के ओवरले रिश्तेदार ईसीएम की कुल राशि के संबंध में है कि ईसीएम घटक की मात्रा से पता चलता है।

एक 3 डी में इन विट्रो त्वचा मॉडल में, एमएमसी एक परिपक्व organotypic त्वचा सह संस्कृति (चित्रा 4) प्राप्त करने के लिए 3 सप्ताह के लिए सघन 5 हफ्तों से संस्कृति का समय है। एक hematoxylin और eosin धुंधला से पता चला है कि 3 हफ्तों में, macromolecular crowders के साथ संस्कृति एक pluri-स्तरीकृत एपिडर्मिस और stromal अमीर डर्मिस की, uncrowded नियंत्रण संस्कृतियों जो एक पूरी तरह से अलग-अलग एपिडर्मिस कमी रह गई थी की तुलना में थे। इसके अलावा, तीव्र और सतत कोलेजन सातवीं immunostaining वास्त्विक में पता चला थाभीड़ सेल संस्कृतियों के एल एपिडर्मल जंक्शन, नियंत्रण संस्कृतियों में एक कमजोर और धब्बेदार कोलेजन सातवीं immunostaining की तुलना में। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) organotypic संस्कृतियों में तंतुओं प्रस्तोता, कार्यात्मक कोलेजन सातवीं दिखा की उपस्थिति देखी गई।

आकृति 1
चित्रा 1: मिश्रित macromolecular भीड़ (mMMC) इन विट्रो में त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन घटकों के बयान को बढ़ाता है (ए) कोलेजन मैं बयान फाई broblasts ही में mMMC (सेल परत और मैट्रिक्स) द्वारा बढ़ाया है।। सह संस्कृतियों की भीड़ सबसे अधिक कोलेजन मैं और शो keratinocytes कि फाई broblasts द्वारा कोलेजन मैं उत्पादन को प्रेरित उत्पादन। (बी) फाई broblasts द्वारा कोलेजन चतुर्थ बयान भीड़ द्वारा बढ़ाया है। इस भीड़ भरे सह संस्कृतियों में और भी अधिक स्पष्ट रूप से देखा जाता है। ध्यान से, keratinocytज्यादातर सेल जुड़े कोलेजन चतुर्थ शो या intracellular कोलेजन चतुर्थ, लेकिन नहीं एक pericellular मैट्रिक्स के लिए दाग तों। सह संस्कृतियों में, दोनों प्रकार की कोशिकाओं कोलेजन चतुर्थ मुख्य रूप से keratinocyte द्वीपों बख्शते फाई broblasts के साथ जुड़े होने के साथ अलग। (सी) fibronectin बयान केवल फाई broblasts के साथ देखा गया था, और उसमें जोरदार (सेल परत और मैट्रिक्स) भीड़ द्वारा बढ़ाया। सह संस्कृतियों में, फाई bronectin की एक जालीदार जाल केवल फाई broblasts के साथ जुड़े थे, केरेटिनकोशिकाओं के द्वीपों बख्शते। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा बेनी एट अल से संशोधित किया गया है। 2015 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मिश्रित macromolecular भीड़ (mMMC) के बयान की सुविधाप्रस्तोता फाई bril इमारत कोलेजन सातवीं। कोलेजन सातवीं बयान की (ए) एक जालीदार बयान पैटर्न ही mMMC तहत फाई broblasts के साथ स्पष्ट है। सह संस्कृतियों में, बाह्य कोलेजन सातवीं जोरदार keratinocyte द्वीपों के बीच में वाई-फ़ाई broblast कालोनियों के साथ जुड़ा हुआ है। केरेटिनकोशिकाएं दिखाने pericellular और intracellular कोलेजन सातवीं अधिक दृढ़ता mMMC की उपस्थिति में व्यक्त किया। सेल के बाद, कोलेजन सातवीं पैरों के निशान mMMC इलाज फाई broblast संस्कृतियों में एक फाई ne बारीक परत में देखा जाता है, लेकिन एक नमूदार फाई brillar बयान सह संस्कृतियों से लिया गया है। (बी) lysed सेल परतों के immunoblot विश्लेषण से पता चलता है कि दोनों भीड़ फाई broblasts और keratinocyte संस्कृतियों उल्लेखनीय बात यह फाई अधिक कोलेजन सातवीं uncrowded नियंत्रण के साथ तुलना में होते हैं। पुनः प्राप्त कोलेजन सातवीं मुख्य रूप से pericellular ली गई है। (सी) बी के densitometric विश्लेषण से पता चलता है कि mMMC सेल सहयोगी की मात्रा बढ़ जाती हैडी कोलेजन सातवीं फाई broblasts में 8 का एक पहलू और केरेटिनकोशिकाओं में 2 का एक पहलू से। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा बेनी एट अल से संशोधित किया गया है। 2015 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। चित्रा 3: के रूप में हस्तक्षेप पुन FL ection माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) बाह्य बयान अलग-अलग ईसीएम घटकों (कोलेजन चतुर्थ और फाई bronectin) के विश्लेषण पर, mMMC के तहत संस्कृति बढ़ाया द्वारा कल्पना तंतुकोशिका पैरों के निशान और अधिक कुल ईसीएम होते हैं। कुल ईसीएम जमा कल्पना, आईआरएम सब ईसीएम यों के रूप में एंटीबॉडी धुंधला अपनी सीमाओं था इस्तेमाल किया गया था। आईआरएम स्पष्ट रूप से कुल मैट्रिक्स मात्रा और mMMC के तहत पैटर्न से पता चला नियंत्रण की शर्तों के साथ तुलना में। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा दिया गया हैसे बेनी एट अल। संशोधित, 2015 को यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। मिश्रित macromolecular भीड़ (mMMC) जलमग्न चरण के दौरान त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन (DEJ) त्वचा समकक्ष में की परिपक्वता को बढ़ाता है तंतुकोशिका युक्त कोलेजन जैल शीर्ष पर केरेटिनकोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त और 1 सप्ताह के लिए जलमग्न रखा गया था, तो एक को उठाया हवा तरल इंटरफेस। शास्त्रीय प्रोटोकॉल में, कोलेजन सप्तम (हरा) संस्कृति में 3 सप्ताह के कुल के बाद अनुपस्थित था, लेकिन 5 हफ्तों के बाद त्वचा समकक्ष में दिखाई दिया। इसके विपरीत, mMMC के तहत, कोलेजन सातवीं पहले से ही 3 हफ्तों के बाद जोरदार स्पष्ट और यहां तक ​​कि अधिक दृढ़ता मानक संस्कृतियों के साथ तुलना में 5 हफ्तों के बाद सना हुआ था। Hematoxylin और eosin (20x बढ़ाई) धुंधला गफाई पर rmed कि इस तेजी से प्रोटोकॉल, STRATI जिया और त्वचा बराबर की परिपक्वता के साथ बनाए रखा और त्वरित किया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा बेनी एट अल से संशोधित किया गया है। 2015 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। MMMC के साथ एक 3 सप्ताह संस्कृति प्रोटोकॉल के बाद organotypic सह संस्कृतियों की नवजात त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन के mMMC Ultrastructural के अध्ययन के तहत उत्पन्न त्वचा समकक्ष में फाई brils प्रस्तोता का नए सिरे से गठन के साक्ष्य (ए, बी) प्रस्तोता के लिए समान संरचनाओं का सुझाव फाई brils (तीर) है कि गैर भीड़ त्वचा समकक्ष (सी) संस्कृति के 3 सप्ताह बाद में अनुपस्थित रहे हैं। यह आंकड़ा शुक्रवार संशोधित किया गया हैओम बेनी एट अल।, 2015 को यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Wako 013-12061 Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format) Greiner Bio-One 657610 Organotypic cultures
Citrate solution Dako S2369 DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail) Corning 354236 Organotypic cultures
CnT-57 CELLnTEC CnT-57 Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kit Dako K3468 Histology
Deep-well plate (6-well format) Corning 355467 Organotypic cultures
ECL detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM)  JEOL   JEM-1010 (100kV) Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM) High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70 GE Healthcare Life Sciences 17-0310-05 Macromolecular crowder
Ficoll PM400 GE Healthcare Life Sciences 17-0300-05 Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM) Life Technologies 17005-042 Cell culture media
Lysis buffer ThermoFisher Scientific 89900 Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. 
Microscope Zeiss LSM510 Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount) National Diagnostics HS-106 Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal) ThermoFisher Scientific 8310-16 Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek) Sakura 4583 Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibiotics Sigma Aldrich A5955 Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibody Abcam #ab6308
Anti-Collagen Type IV Novocastra #NCL-COLL-IV
Anti-collagen VII LH7.2 (in house) 
Anti-Fibronectin antibody Abcam #ab2413
Reducing agent  ThermoFisher Scientific NP0009 Western blot
Sample buffer ThermoFisher Scientific NP0008 Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma Aldrich #D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit ThermoFisher Scientific #A-11037 
AlexaFluor 594 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific  #A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit ThermoFisher Scientific #A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific #A-11001
Secondary antibodies (HRP) Dako Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse undiluted
Sodium deoxycholate Prodotti Chimicie Alimentari Decellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12    Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisone Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulin Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine   Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrin Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Trypsin Biopolis Shared Facilities 0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3  Used to trypsinize cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 114 केरेटिनकोशिकाओं fibroblasts macromolecular भीड़ 2 डी सेल संस्कृति 3 डी सेल संस्कृति त्वचा organotypic सह संस्कृतियों बाह्य मैट्रिक्स कोलेजन प्रकार मैं कोलेजन प्रकार चतुर्थ सप्तम कोलेजन प्रकार, Dermo-एपिडर्मल जंक्शन
सुधार के 2 डी और 3 डी त्वचा<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Macromolecular भीड़ का प्रयोग मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benny, P., Badowski, C., Lane, E.… More

Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding. J. Vis. Exp. (114), e53642, doi:10.3791/53642 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter