Summary
我々は、高分子crowders（MMC）を使用して、細胞外マトリックスタンパク質に富む細胞由来のマトリックスを得るためのプロトコルを提示します。また、我々は、コンストラクトの成熟度を維持しながら、培養時間を減少させる3D器官型皮膚共培養世代でMMCを組み込むプロトコルを提示します。
Abstract
コラーゲンの糖タンパク質ファミリーは、ヒトの体内での主な構造タンパク質を示しており、近代的な組織工学で使用される生体材料の主要コンポーネントです。それは、特に皮膚モデルにおいて、結合組織およびその後の組織の凝集の次善の形成をもたらす、悪名高い遅いような技術ボトルネックは、in vitroでのコラーゲンの沈着です。ここでは、コラーゲン沈着の劇的な向上をもたらす分子クラウディング（MMC）を生成するために、皮膚培養物に差次サイズスクロース共重合体を添加することを含む方法を記載します。特に、皮膚線維芽細胞は、対照と比較して、MMCの下のI / IV / VIIおよびフィブロネクチン、コラーゲンを大量に堆積しました。
プロトコルはまたimmunocyによって証明されるように培養表面上に保持された細胞外マトリックス（ECM）の著しい量を露光、混雑した細胞層を脱細胞化する方法を記載します組織化学。トータルマトリックス質量および分布パターンは、干渉反射顕微鏡を用いて調べました。興味深いことに、線維芽細胞、ケラチノサイトおよび共培養は、様々な組成や形態の細胞由来のマトリックス（CDM）を生産しました。 CDMは、より臨床的に関連するアプリケーションに向けて移動させる、コーティングまたは足場の現在の使用は、典型的には、異種動物源から、回避することができる二次電池の播種用「バイオ足場」として使用することができます。
また、このプロトコルは、特に、真皮 - 表皮接合部（DEJ）にECMの沈着を増強するのに十分であった3次元器官型皮膚共培養モデル、コラーゲンVII、主成分の浸漬段階中にMMCの適用を記載しますフィブリルを固定します。電子顕微鏡は、対照と比較して、MMCを使用して開発の文化にフィブリルを固定するの存在を確認しました。アンカーフィブリル従って、表皮と真皮をつなぐので、これは重要です予め形成された成熟DEJは、移植片の安定性と全体的な創傷治癒の点で皮膚移植片レシピエントの利益を得ることができる持ちます。また、培養時間は、コストを削減、MMCを使用する場合に、成熟した構築物を得るために、3週間、5週間から濃縮しました。
Introduction
皮膚は、水の損失及び病原体侵入を防止することにより、保護バリアを形成します。これは、3つの主要コンポーネントで構成されています。間質豊富な真皮1、その上に層状表皮2,3,4、および5,6間における真皮表皮接合部。真皮は主にコラーゲンと弾性繊維で構成されており、まばら線維芽細胞7が入力されます。対照的に、細胞が豊富な表皮ケラチノサイトの複数の層で構成されています。最も内側の層のケラチノサイトは、増殖され、更新し、常に皮膚の最も外側の層に移動して受ける角質層で、その結果、それらの核と細胞質材料を失った末端分化するケラチノサイトを置き換える新たな基底細胞を提供します落屑。
真皮 - 表皮接合部、基底膜の特定のタイプは、tethe相互接続マトリックス分子からなる複合構造体であります真皮に表皮をRS。真皮のコラーゲンI繊維は、コラーゲンIV豊富な緻密層に固定されているコラーゲンVIIアンカリングフィブリルと交錯します。順番にアンカリングフィラメント（ラミニン5、コラーゲンXVIIおよびインテグリン）は、基底ケラチノサイトのヘミデスモゾームに緻密層を接続します。基底ケラチノサイト（基底層）が分化し、基底上層を形成するために階層化だけでなく、増殖して更新する能力を持っています。有棘層、顆粒層、および環境と肌の接触面を示し、最終的に角質層、。角質層の基底層からエンルート 、ケラチノサイトは、サイトケラチンの発現パターンを切り替えて、最終的にアポトーシスを受けるし、角質化で自分自身を包みます封筒、共有結合トランスグルタミナーゼ活性によって架橋されている特定のタンパク質の殻。
の複雑な構造を含む、in vitroで皮膚とその層の再作成真皮 - 表皮接合部および真皮細胞外マトリックス、および角化プロセスをエミュレートするには、やりがいのある仕事であれば、興味をそそら科学者や生体工学を持っています。例えば、患者の生検から皮膚細胞の正常な抽出および患者由来の皮膚細胞8を用いて皮膚の器官培養物の生成皮膚組織工学における重要な進歩がありました。しかし、未解決の問題は、皮膚細胞自体による細胞外マトリックスタンパク質の悪い分泌に関係し、次善の皮膚モデルで得られたままです。さらに、現在のプロトコルを使用して3次元器官型皮膚共培養物を生成するのに必要な時間は、4〜8週間、潜在的に巨大分子crowdersの取り込みと短縮することができる時間枠の間で変化します。培養時間を減少させること、試薬コストを節約し、細胞老化の発生率を低減し、製品が臨床で使用されるべき患者の待ち時間を減少させます。
トン">高分子は、（MMC）混雑は排除体積効果。これらは、標準的な水性の培養条件9-13の下で遅刻であるプロコラーゲンのタンパク質分解切断を含む酵素反応速度に影響を与える。MMCの下では、酵素反応を生成するために、培養培地に特定の高分子を導入することを含みます空い対照10と比較して、混雑した培養物中のIは分子コラーゲンの量の増加、プロコラーゲン切断の場合には、その結果、試薬14,15の量を増加させることなく早めている。コラーゲンとプロコラーゲンの変換は、コラーゲンの形成を可能にするようにアセンブリ、48時間MMCを用いて培養した線維芽細胞は、最大4週間11,16,17のために監視混雑していない線維芽細胞培養物と比較して有意に多くのコラーゲンIを得た。ECMの形成、安定化およびリモデリングに影響を与える酵素活性への影響のほか、MMCも直接コラーゲンを増強し、調節することが示されています繊維形成18,19。我々はここでは特に、真皮線維芽細胞と表皮角化細胞における細胞外マトリックスの皮膚細胞による（ECM）の生産を増強する方法を提示します。また、我々は、単層培養でMMCで製造富化ECMは、脱細胞化し、純粋な細胞由来のマトリックス（CDM）として使用することができることを示しています。
私たちは、視覚化するために非従来型のアプローチを使用し、完全にMMCで培養皮膚細胞によって堆積ECMを感謝しています。干渉反射顕微鏡は、典型的には、細胞 - マトリックス相互作用または細胞 - ガラス接触点を研究するために使用されます。この技術は、ガラス表面上に堆積されたマトリックスの合計量を表示するために、我々のシステムで利用されました。干渉反射顕微鏡は、MMCの存在下および非存在下で、細胞外マトリックス組成物及びパターンの点でほとんどの情報量を得るために、蛍光免疫染色を用いてカップリングさせました。
OrganotypiC皮膚共培養は、三次元の文脈において、インビトロで皮膚をモデル化するための古典的な方法です。二次元の共培養は、重要な情報を提供することができるが、このデータを変換し、バック本質的に三次元構造であり、インビボ環境にそれを適用する場合、それは限られています。皮膚ケラチノサイトは、特に、偏光であり、恒常性と細胞接着のために必須である頂端および基底セグメントを含みます。また、このようなケラチン1、ケラチン10およびフィラグリンのように基底層以上のケラチノサイト、中の典型的な基底上のタンパク質の発現は、層化およびケラチノサイトの分化の過程で唯一の存在です。分化は、典型的な単層培養物中にほとんど存在するように、基底層直上タンパク質の発現は、通常、この培養系では達成されません。したがって、器官培養物は、培養培地中に浸漬開始、その後keratinocytを駆動するための気液界面に持ち上げられます電子分化。これは、層別マーカーの発現、さえ角化および表皮生理学の一般より良い反射が生じます。他のグループが以前に成功した器官皮膚共培養を生成しているが、機能的真皮 - 表皮接合ゾーンの確立が課題となっています。ここでは、凝縮された時間枠内で、これらの構築物の成熟度を損なうことなく、強化された基底膜と器官皮膚共培養を培養するための新しい方法を提示します。これは、in vitroでのモデリングのための皮膚模倣薬、皮膚生物学の研究およびスクリーニングアッセイの品揃えを提供するであろう。
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Protocol
2D皮膚細胞培養物における1分子クラウディング
- 24ウェルプレートのウェル当たり種子50,000個の細胞（初代線維芽細胞または初代ケラチノサイトまたは一次線維芽細胞及びケラチノサイトの共培養）。対応する細胞型の増殖培地1ml中の種子細胞。
- 5％CO 2で37℃のインキュベーター中で、細胞を一晩接着させます。
- 古いメディアを廃棄し、1ミリリットルで高分子crowdersおよび100μMアスコルビン酸を含む新鮮な培地を交換してください。 37.5 Mgからなるクラウダーカクテルを使用/ mlのDMEMからなるフィコール70および25 mg / mlでフィコール400を使用する線維芽細胞培地（FM）は、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン抗生物質を補充しました。無血清培地、KSFMまたはCNT-57での角化細胞を成長させます。 50％FMと50％の無血清培地の混合物中で共培養を維持します。
- 2日ごとに培地を交換して、5％CO 2で37℃インキュベーターで6日間培養をインキュベートします。
皮膚細胞培養2.蛍光免疫染色
- 1×PBSで2回細胞培養物を洗います。
- メタノール又はパラホルムアルデヒド（抗体の仕様に応じて）のいずれかで細胞培養物を固定してください。
- メタノール固定用
- それぞれに小分けし、冷メタノール500μlのをよくし、10分間-20℃でインキュベートします。吸引除去は、固定剤とメタノールの廃棄物を捨てます。層状ヒュームフード内の空気乾燥。
- パラホルムアルデヒド固定用
- 各ウェルにアリコートを2％パラホルムアルデヒド溶液500μlを、室温で15分間インキュベートします。吸引除去は、固定剤およびパラホルムアルデヒドの廃棄物を捨てます。
- 3回の洗浄、洗浄あたり5分間、1×PBSで洗浄します。
- アリコートを各ウェルに1×PBSの1ミリリットル。
- メタノール固定用
- 抗体を用いた蛍光免疫染色
- 各ウェルにアリコート（1×PBSで希釈）の3％ウシ血清アルブミン500μlのを。 3室温でインキュベート0分。ブロッキング溶液を吸引し、廃棄します。
- 一次抗体
- イメージングのための直接プレートから：アリコート一次抗体200μlの（1：10％ヤギ血清で100倍希釈）ソリューションは、それぞれによく、室温で90分間インキュベートします。
- 小分けの一次抗体を50μl（1：100希釈10％ヤギ血清）溶液をパラフィルムの平坦な一片の上にカバースリップのため。ソリューションが直面しているセル側（細胞とカバーガラスの一部）で、パラフィルム上にカバーガラスを置きます。無気泡で、セル全体側をカバーしています。室温で90分間インキュベートします。
- 吸引し、一次抗体溶液および廃棄。
- 3回の洗浄、洗浄あたり5分間、1×PBSで洗浄します。
- 二次抗体
- イメージングのための直接プレートから：アリコート二次抗体を200μl（1：10％ヤギ血清で400希釈）溶液を各ウェルへとfoのアルミニウムでプレートをカバーし、室温で30分間インキュベート IL。
- 小分け二次抗体を50μl（1：400希釈の10％ヤギ血清）溶液をパラフィルムの平坦な一片の上にカバースリップのため。ソリューションが直面しているセル側（細胞とカバーガラスの一部）で、パラフィルム上にカバーガラスを置きます。無気泡で、セル全体側をカバーしています。アルミ箔でパラフィルムを被覆、室温で30分間インキュベートします。
- 吸引し、二次抗体溶液および廃棄。
- 3回の洗浄、洗浄あたり5分間、1×PBSで洗浄します。アリコートを各ウェルに1×PBSの1ミリリットル。
- 取り付け
- プレートから直接画像化するために：マウントされません。顕微鏡に進みます。
- マウントカバースリップ、スライドガラス上に、メディアをマウント中：カバースリップのイメージングのため。アルミ箔で覆われた容器中で一晩乾燥します。顕微鏡に進みます。
- 40X / 1.30油浸対物レンズで共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を取得します。
- 1×PBSで2回細胞層を洗ってください。
- アリコートを各ウェル（6ウェルプレート形式）に溶解バッファー100μl（材料リストを参照）。マイクロ遠心チューブに細胞スクレーパーと転送溶液で細胞層を削ります。
- 4℃で30分間、15330×gで遠心分離液。別のマイクロ遠心チューブに上清を移し、ペレットを捨てます。
- （材料リストを参照してください）サンプルバッファーを5μlと還元剤の2μlの各サンプルの13μLを混ぜます。 10分間95℃で熱サンプル。
- 凝縮水を収集するために1分間15330×gで遠心分離サンプル。負荷サンプルプレキャストPAGEゲルへと約1時間、100Vで動作します。
- ニトロセルロース膜に分離されたタンパク質を転送するには、紙の作品や（同じサイズの）スポンジの間にゲルと膜を挟みます。ゲル、膜、紙とスポンジの間に気泡がないことを確認秒。サンドイッチカセットを閉じて、2時間で70 Vで転送を実行します。
- 転送が完了したかどうかを確認するには、0.1％PBS-Tween-20で、3回、1回の洗浄あたり10分で10ミリリットルポンソーS.ウォッシュ膜で膜をインキュベートします。
- 室温で1時間、5％ミルク10mlでブロック。 0.1％PBS-Tween-20で膜を洗浄し、3回、1回の洗浄あたり10分。
- 90分間、10ミリリットル一次抗体（：1,000希釈の5％ミルク中のマウス抗コラーゲンVII、LH 7.2、1）でインキュベートします。 0.1％PBS-Tween-20で膜を洗浄し、3回、1回の洗浄あたり10分。
- 30分間10mlの二次抗体（1：2,000希釈の5％ミルク中でヤギ抗マウスHRP、1）とインキュベートします。 0.1％PBS-Tween-20で膜を洗浄し、3回、1回の洗浄あたり10分。
- カセットにメンブレンを移し、ECL検出試薬の1ミリリットルを追加します。メンブレン上をクリア、薄いプラスチックシートを配置します。
- 化学発光を検出するために、プラスチックシートの上に感光性フィルムを配置し、カセットを閉じます。 2後-5分は、カセットから膜を除去し、開発者にそれを置きます。
4.細胞由来のマトリックスを作成し、使用します
- 24ウェルプレートのウェル当たり種子50,000個の細胞（初代線維芽細胞または初代ケラチノサイトまたは一次線維芽細胞及びケラチノサイトの共培養）。
- 5％CO 2で37℃のインキュベーター中で、細胞を一晩接着させます。
- 古いメディアを廃棄し、新鮮な培地は、高分子crowdersおよび100μMアスコルビン酸を含むと交換してください。クラウダーカクテルを、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したDMEMから成る37.5ミリグラムから成る/ mlのフィコール70および25 mg / mlでのFicoll 400線維芽細胞培地（FM）。ケラチノサイトは無血清培地、KSFMまたはCNT-57で栽培されています。 50％FMと50％KSFMまたはCNT-57の混合物中で共培養を維持します。
- 2日おきにメディアを変更し、5％CO 2で37℃インキュベーターで6日間培養をインキュベートします。
- 細胞由来のマトリを得るために、細胞層を脱細胞化X（F-マット =線維芽細胞およびケラチノサイトの共培養由来線維芽細胞由来のマトリックス、K-マット =ケラチノサイト由来のマトリックス、 共同マット =マトリックス）。
- 1×PBSで2回細胞層を洗ってください。
- 0.5％デオキシコール酸ナトリウム250μlのを追加します。 10分間、氷上で、インキュベートします。吸引細胞溶解物。
- 繰り返しステップ4.5.2三度。
- 蒸留H 2 Oで二回細胞由来のマトリックスを洗います1×PBSで細胞由来のマトリックスを保管してください。マトリックスは、4℃で1週間まで保存することができます。
- （F-マットの上にケラチノサイトを播種、例えば）二次細胞懸濁液を準備します。
- 吸引し、1×PBS。
- 細胞由来のマトリックス（F-マット ）の上に50,000ケラチノサイトをシード。 5％CO 2で37℃のインキュベーター中で、細胞を一晩接着させます。
注：アッセイは、接着細胞上で直接実行することができます。
細胞 - の5キャラクタリゼーション派生行列
- 蛍光免疫染色：プロトコル2を参照してください。
- 干渉反射顕微鏡
- プロトコル4.1から4.5以下のカバーガラスに上にシード細胞、。
- 細胞由来のマトリックスを取得した後、プロトコル2.2以下のサンプルを修正します。
注：抗体染色はオプションです。必要な場合は、議定書2.3を参照してください。 - 40X / 1.30油浸対物レンズを用いて共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像の取得を行います。 74ミリメートルでピンホールを設定します。
- フィルター用の赤チャンネルuorescence FLに対する干渉再FL ection顕微鏡（IRM）チャネルとBP 575から615 IRのためのLP 505を使用してください。 IRMチャネルとHFT 405/488/561、NFT 565、ビームスプリッタ用の赤チャンネルuorescence FLためのプレートのためのNT 80/20使用。 IRMチャネルに対して5.0％の電力で赤チャネルとHeNe633（波長633 nm）のuorescence FL 1.1％の出力でDPSS 561から10（波長561 nm）を次のレーザーを使用してください。
6. 3D器官スキン共培養
- 細胞培養インサート（6ウェルプレート形式）で、線維芽細胞カプセル化して、コラーゲンゲルをキャストします。
- アリコート寒ビーカーにラット尾コラーゲンI型の10ミリリットル。
- 冷たいDMEMの1ミリリットルを追加します。酸性コラーゲンを中和するために1 M NaOHを0.5ミリリットルを追加します。 （120万線維芽細胞を含む）、線維芽細胞懸濁液0.5ミリリットルを追加します。
- 6ウェルプレート内の細胞培養インサートに、冷たいピペットで、ソリューションを転送します。全溶液12mlを均等に6細胞培養インサートに分割されます。
- 1時間、5％CO 2で37℃のインキュベーター中でゲルをインキュベートします。
- ゲルが固化した後、FMでゲルを浸します。高分子crowdersを含む、24時間後、古いメディアを廃棄し、新鮮な培地と交換してください。細胞培養インサートの外側に細胞培養インサートの内部に2ミリリットルと2ミリリットルの容量を追加します。
- 24時間後、コラーゲンゲルの上にケラチノサイトをシード。
- トリプシン処理を、37℃で5分間、0.125％トリプシン/キレート剤を使用したケラチノサイト。細胞を除去し、血清含有培地でトリプシンを中和するために静かにフラスコの側面をタップします。細胞をカウントし、ケラチノサイト懸濁液を調製（ゲル30万ケラチノサイトおよび200μlの培地に懸濁）。
- 細胞培養インサートから吸引除去古いメディア。ゲルの上ケラチノサイトを追加します。
- 1時間、5％CO 2で37℃のインキュベーター中でゲルをインキュベートします。
- 細胞培養インサートの外側にケラチノサイトした後、ゲル表面に付着している細胞培養インサートの内側に2ミリリットルKSFMまたはCNT-57でゲルを沈めるとFMの2ミリリットル。
- 高分子crowdersを含む、24時間後、古いメディアを廃棄し、新鮮な培地と交換してください。
- 深部培養の7日後に、気液界面に文化を上げます。
- 細胞培養インを転送ディープウェルプレートにERT。細胞培養インサートの外側に10ミリリットル層化メディアを追加します。細胞培養インサートドライの内部を保管してください。
- 5％CO 2で37℃インキュベーターで培養液をインキュベートし、次の14日間、3日おきにメディアを変更します。
注意：気液界面での2週間後、皮膚等価物は成熟しており、収穫することができる（いずれかのスナップ凍結またはホルマリン固定）。
7.収穫と特性器官の皮膚等価物
- 吸引成層メディア。
- ピンセットを使用して、文化を転送することはペーパータオルの上に挿入し、インサートのベースから離れて、残りのメディアを軽くたたきます。
- メスを用いて、培養インサートの内周に沿って切断します。
- （PET膜と一緒に）器官皮膚共培養を修正しました。
- スナップフリーズ
- cryomoldにゲル構造体を転送します。 10月にcryomoldの内部をカバー化合物。 10秒間液体窒素にcryomoldを置きます。
- ピンセットを使用して、アルミホイルで包み、-80℃の冷凍庫で凍結したサンプルを格納、液体窒素から冷凍cryomoldを削除します。
- セクションでは、7ミクロンの切片厚で、クライオスタットでサンプルを凍結しました。
- ホルマリン固定
- 「生検カセット」に「生検スポンジパッド」を配置します。スポンジパッド上にゲル構造体を転送します。ゲル構造物の上に静かに別のスポンジパッドを配置します。カセットを閉じます。
- 完全に室温で、48時間、10％中性緩衝ホルマリン中でカセットを沈めます。カセットを取り外し、ホルマリン廃棄物を捨てます。
- 最初のエタノール系列で脱水した後、徐々にワックスでサンプルを浸透させてワックスブロックに固定されたサンプルを埋め込みます。セクションミクロトームでワックスブロック。
- スナップフリーズ
- 皮膚同等物のキャラクタリゼーション
- 免疫染色
- 凍結切片の場合：
- 室温で1時間（1×PBSで希釈した）を、10％ヤギ血清中で切片をインキュベートします。ヤギ血清を除去するために、1×PBSでセクションを洗ってください。
- 室温で90分間（10％ヤギ血清で100倍希釈1）一次抗体を用いて切片をインキュベートします。 1×PBS、3回、1回の洗浄あたり5分でセクションを洗ってください。
- アルミ箔で覆われた容器中で、室温で30分間（10％ヤギ血清で400希釈1）二次抗体を用いて切片をインキュベートします。 1×PBS、3回、1回の洗浄あたり5分でセクションを洗ってください。
- マウントカバーガラス上に、メディアをマウントして、スライドします。アルミホイルでカバーサンプルとは、一晩乾燥させます。
- 40X / 1.30油浸対物レンズとの共焦点顕微鏡を用いた画像。
- ホルマリン固定パラフィン包埋切片の場合：
- 脱ワックス部（及び再水和）水エタノールの割合を降順に（キシレン - 100％エタノール- 90％のエタノール - 80％エタノール - 70％エタノール - 水）。完全ソリューションでサンプルを沈めます。各脱ロウ工程は、3分でなければなりません。
- 30分間、1％過酸化水素で切片をインキュベートします。 5分間、1×PBS中でセクションを洗ってください。
- 20分間120℃（10 mlのクエン酸溶液を90 mlの水に溶解させた）クエン酸塩溶液中で切片をインキュベートします。スライドを室温で、一晩冷却させます。 1×PBS、3回、1回の洗浄あたり5分でセクションを洗ってください。
- 室温で1時間（1×PBSで希釈した）を、10％ヤギ血清中で切片をインキュベートします。ヤギ血清を除去するために、1×PBSでセクションを洗ってください。
- 室温で90分間（10％ヤギ血清で100倍希釈1）一次抗体を用いて切片をインキュベートします。 1×PBS、3回、1回の洗浄あたり10分でセクションを洗ってください。
- 室温で、30分間、HRP標識ポリマー（原液）を持つセクションをインキュベートします。 1×PBS、3回、1回の洗浄あたり10分でセクションを洗ってください。
- マイクロチューブに、1ミリリットルを組み合わせます色原体の1滴とDAB基質（3,3'-ジアミノベンジジン）。 15秒間この溶液でのセクションをインキュベートします - 5分（ブラウン色=正の信号）。
- 反応を停止するには、流水中でセクションを洗います。
- 5分間、ヘマトキシリンで核を対比染色。流水でセクションをすすぎます。
- 1分間、酸性アルコール溶液中で切片をインキュベートします。流水でセクションをすすぎます。
- 2分間、スコットの水道水溶液中でセクションをインキュベートします。流水でセクションをすすぎます。
- オプション：1分間エオシンでセクションをインキュベートし、流水で洗います。
- キシレン、エタノールの上昇率のセクション脱水（ - 80％エタノール - 70％エタノール、90％エタノール - 100％エタノール - キシレン）。サンプルが完全に段あたり3分間水没されていることを確認。
- マウントカバーガラスに、取り付けメディアを使用して、スライドします。空気乾燥一夜。
- 40X / 1.30油浸対物レンズとの共焦点顕微鏡を用いた画像。
- 凍結切片の場合：
- 透過型電子顕微鏡（アンカリング線維を可視化するために）
- 72時間、2.5％グルタルアルデヒド中のサンプルを修正しました。
- 1×PBSで洗浄サンプル、3回、1回の洗浄あたり10分。
- 小片（1ミリメートル3）にカット。室温で1時間1％四酸化オスミウム、pHが7.4、でポストフィックスサンプル。蒸留水で洗浄サンプル。
注意：四酸化オスミウムは、有毒、有毒であり、ドラフト内で慎重に処理しなければなりません。 - ステップごとに20分間上昇エタノール系列（アセトン - 50％エタノール - 75％エタノール - 95％エタノール - - 100％エタノール、25％エタノール）を介して試料を脱水。
- 6一晩：1、続いて1時間、のために3：室温で30分間、その後、1：（1 1）アラルダイト樹脂：100％のアセトンに試料を浸漬することにより潜入。 40°Cで1時間の新鮮なアラルダイト樹脂の第2の変更に続いて室温で2時間、新鮮なアラルダイト樹脂にサンプルを浸します。第三の新鮮なAを残します45℃で1時間raldite樹脂の変更とは、50℃で1時間のための第四の新鮮なアラルダイト樹脂の変更を残します。
- 重合を可能にするために、24時間、60℃でサンプルをインキュベートします。
- セクションサンプルを1μmの厚さの半薄切片を得るために、ガラスナイフを用いて。メチレンブルーで染色部分は、組織像を観察しました。セクション70nmの超薄切片を取得し、銅グリッド上に各セクションを収集するサンプル。
- 10分間、3％クエン酸鉛溶液、続いて15分間、5％酢酸ウラニル溶液で染色切片。
- 30,000Xの倍率で、透過型電子顕微鏡（100キロボルト）で画像を取得します。
- 免疫染色
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Representative Results
分子クラウディングは、特に、ECMの沈着を向上させることができた、線維芽細胞培養物対照と比較してより多くのコラーゲンI、IVおよびフィブロネクチン堆積（ 図1、細胞層を、 図1A、コラーゲンI、1B、コラーゲンIV、1C、フィブロネクチン）。脱細胞化の際には、線維芽細胞はケラチノサイト（ 図1、マトリックス）と比較して、コラーゲンI、IVおよびフィブロネクチンの主要な預金であったことが明らかでした。
図2においては、線維芽細胞ではなく、ケラチノサイトは、コラーゲンVIIの主な生産者であったことが観察されました。これは、in vitro（ベニーら 、2015） で正常に堆積したコラーゲンVIIの最初の報告です。
細胞由来のマトリックスは、特定の不格好なやつを使用して免疫蛍光法を介して特徴付けられましたIES。これは古典的なアプローチがあるが、その全体でECMを視覚化し、完全に高分子crowdersの効果を理解することが重要でした。干渉反射顕微鏡（IRM）を使用して、マトリックスの完全な範囲は、（ 図3）を捕捉しました。 IRMイメージで抗体染色のオーバーレイは、ECMの合計量との関係でそのECM成分の相対量を示しています。
3D のin vitro皮膚モデルでは、MMCは、成熟した器官、皮膚の共培養（ 図4）を得るために3週間に5 週間の培養時間を凝縮しました。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は完全に分化した表皮を欠いていた混雑していない対照培養物と比較して3週間目に、高分子crowdersと文化は、多能層状表皮および間質豊富な真皮から成っていることを示しました。また、強烈な、連続コラーゲンVIIの免疫染色は、真皮で検出されました対照培養物に弱いとむらコラーゲンVIIの免疫染色と比較して、混雑した細胞培養物のリットル - 表皮接合部、。透過型電子顕微鏡法（ 図 5）の機能コラーゲンVIIを示す、器官培養において線維アンカーの存在を示しました。
図1：混合分子クラウディング（MMMC）は、in vitroでの真皮-表皮接合成分の付着を強化する （A）コラーゲンI蒸着のみのfi broblastsにMMMC（細胞層およびマトリックス）によって強化されます。共培養の混雑はほとんどコラーゲンIを生成し、ケラチノサイトがのfi broblastsによるコラーゲンIの産生を刺激したことを示しています。 （B）のfi broblastsによりIV型コラーゲンの沈着は混雑によって強化されています。これは、混雑した共培養物に一層明確に示されています。注目すべきは、keratinocyt主に細胞関連コラーゲンIV番組や細胞内のコラーゲンIVはなく、細胞周囲マトリックスのために染色エス。共培養では、両方の細胞型は、主にケラチノサイト島を温存のfi broblastsに関連付けられているコラーゲンIVで分離します。 （C）フィブロネクチン沈着のみのfi broblastsで見られ、そこに強く（細胞層およびマトリックス）を混雑によって増強されました。共培養では、のfiフィブロネクチンの網状のメッシュは、ケラチノサイトの島々を温存、のみのfi broblastsと関連していました。スケールバー=20μmです。この図は、ベニーらから変更されている。2015年は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：混合分子クラウディング（MMMCは）の堆積を促進しますfi BRIL建物コラーゲンVIIを固定する。コラーゲンVII沈着の（A）網状蒸着パターンのみMMMC下のfi broblastsと明らかです。共培養では、細胞外コラーゲンVIIを強くケラチノサイトの島の間でのfi broblastコロニーに関連付けられています。ケラチノサイトはより強くMMMCの存在下で発現細胞周囲および細胞内コラーゲンVIIを示しています。細胞溶解後、コラーゲンVIIの足跡はMMMC処理されたのfi broblast培養における微細粒状層に見られているが、識別可能なのfi brillar堆積は共培養から取得されます。溶解した細胞層の（B）イムノブロット分析は、混雑のfi broblastsとケラチノサイト培養の両方が混雑していない対照と比較して著しくより多くのコラーゲンVIIを含んでいることを示しています。検索されたコラーゲンVIIは、主に細胞周囲導出されます。 （C）Bのデンシトメトリー分析はMMMCが細胞会合の量を増加させることを示していますfi broblastsで8倍とケラチノサイトにおける2倍のDコラーゲンVII。スケールバー=20μmです。この図は、ベニーらから変更されている。2015年は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図3：干渉再FL ection顕微鏡（IRM）は、個々 の ECM成分（コラーゲンIVとのfiフィブロネクチン）の分析では、MMMC下の文化が強化された細胞外沈着により可視化線維芽細胞の足跡は、より多くの合計ECMが含まれています。合計ECM堆積を視覚化するために、IRMは、抗体染色は限界があったように、すべてのECMを定量しました。 IRMは明らかに対照条件と比較してMMMC下の総マトリックス量やパターンを示しました。 =20μmのスケールバー。この図は、されていますベニーらから変更された。2015年には、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：水没フェーズの間（MMMC）の混雑混合高分子は、皮膚同等物における真皮-表皮接合部（DEJ）の成熟を 増強する線維芽細胞含有コラーゲンゲルを上にケラチノサイトを播種し、1週間のために水没し続け、その後に持ち上げました。気液界面。古典的なプロトコルでは、コラーゲンVII（緑）は、培養3週間の合計後に不在だったが、5週間後に皮膚同等物に登場しました。これとは対照的に、MMMCの下で、コラーゲンVIIは3週間後にすでに強く明白であったことがさらに強く標準培養物と比較して5週間後に染色しました。ヘマトキシリンおよびエオシン（20X倍率）染色CFiの上で、この急速なプロトコルで、皮膚同等物のstratusの複数形のfiカチオンと成熟度が維持され、加速されたことrmed。スケールバー=100μmです。この図は、ベニーらから変更されている。2015年は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：MMMCの下で生成された皮膚同等物でのfi brilsを固定するのデノボ形成の証拠器官の共培養の新生真皮-表皮接合部の微細構造の研究MMMC（A、B）で3週間培養プロトコルはアンカーに構造が似示唆した後、培養3週間後の非混雑皮膚同等物（C）には存在しないのfi brils（矢印）。この図は、FRが変更されましたオムベニーら 、2015年には、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
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