Summary
Vi presenterer en protokoll for å oppnå celle-stammer matriser rik på ekstracellulære matrix proteiner, ved hjelp av makromolekylære Crowders (MMC). I tillegg presenterer vi en protokoll som inkorporerer MMC i 3D organotypiske hud co-kultur generasjon, noe som reduserer kultur tid samtidig modenhet konstruksjon.
Abstract
Den glykoprotein familien av kollagener representerer de viktigste strukturelle proteiner i menneskekroppen, og er viktige komponenter i biomaterialer som anvendes i moderne prosjektering vev. En teknisk flaskehals er avsetningen av kollagen in vitro, som det er svært langsom, noe som resulterer i sub-optimal dannelse av bindevev og kohesjon påfølgende vev, særlig i huden modeller. Her beskriver vi en fremgangsmåte som innebærer tilsetning av forskjellig størrelse sukrose kopolymerer til huden kulturer for å generere makromolekylære trenging (MMC), noe som resulterer i en dramatisk forbedring av kollagen avsetning. Spesielt, dermale fibroblaster avsatt en vesentlig mengde av kollagen I / IV / VII og fibronektin i henhold til MMC i forhold til kontrollene.
Protokollen beskriver også en fremgangsmåte for å decellularize fylt cellelag, utsette betydelige mengder av ekstracellulær matriks (ECM) som ble holdt tilbake på kulturoverflaten som vist ved immunocytochemistry. Total matrise masse og distribusjon mønsteret ble undersøkt ved hjelp av forstyrrelser refleksjon mikroskopi. Interessant, fibroblaster, keratinocytter og ko-kulturer produserte celle-stammer matriser (CDM) med varierende sammensetning og morfologi. CDM kan brukes som "Bio-stillas" for sekundær cellen såing, hvor den nåværende bruk av belegg eller stillaser, typisk fra xenogene animalske kilder, kan unngås, og dermed beveger seg i retning av mer klinisk relevante anvendelser.
I tillegg beskriver denne protokollen anvendelsen av MMC under den neddykkede fase av en 3D-organotypiske hud ko-kulturmodell som var tilstrekkelig til å forbedre ECM deponering i den dermo-epidermale knutepunkt (DEJ), særlig kollagen VII, hovedkomponenten av forankring fibriller. Elektronmikroskopi bekreftet tilstedeværelsen av forankrings fibriller i kulturer utviklet med MMC, sammenlignet med kontroller. Dette er viktig som forankring fibriller tjore dermis til epidermis, dermedå ha en pre-formet moden DEJ kan ha nytte hud pode mottakere i form av pode stabilitet og generell sårtilheling. Videre ble kulturen tid kondensert fra 5 uker til 3 uker for å oppnå en moden konstruksjon, ved bruk av MMC, redusere kostnader.
Introduction
Huden danner en beskyttende barriere ved å hindre vanntap og patogen oppføring. Den består av tre hovedkomponenter; de stromale rike dermis 1, et stratifisert epidermis 2,3,4 på toppen av det, og det Dermo-epidermal junction i mellom 5,6. Dermis består hovedsakelig av kollagen og elastiske fibre, og er tynt befolket med fibroblaster 7. I motsetning til dette er cellerike epidermis sammensatt av flere lag av keratinocytter. Keratinocytter fra den innerste lag er proliferative og gi nye basale celler som fornye og erstatte terminalt differensierende keratinocytter som hele tiden beveger seg til den ytterste lag av huden og har mistet sine kjerner og cytoplasmatisk materiale, noe som resulterer i en forhomede sjikt som undergår avskalling.
Den dermale-epidermale knutepunkt, en bestemt type grunnmembranen, er en sammensatt struktur bestående av sammenhengende matriks-molekyler, som TetheRS epidermis til dermis. Collagen I fibre av dermis sammenflettes med kollagen VII forankrings fibriller som er forankret til kollagen IV rik lamina densa. Forankring filamenter (laminin 5, kollagen XVII og inte) i sin tur kobler lamina densa med hemidesmosomes av basale keratinocytter. Basale keratinocytter (basal) har kapasitet til å proliferere og fornye, samt differensiere og stratify å danne suprabasal lagene; stratum spinosum, stratum granulosum, og endelig stratum corneum, som representerer kontakt overflaten av huden med omgivelsene. Underveis fra basallaget til forhomede lag, keratinocytter bytte uttrykk mønstre av cytokeratins og til slutt gjennomgår apoptose og omslutter seg i forhomede konvolutter, skrog av spesifikke proteiner som er kovalent kryssbundet av transglutaminase aktivitet.
Gjenskape hud og dens lagene in vitro, inkludert de komplekse strukturene i dermal-epidermal junction og dermal ekstracellulære matrise, og å etterligne horndannelse prosessen, har lenge fascinert forskere og bioingeniører som en utfordrende oppgave. Det har vært betydelige fremskritt innen hud tissue engineering, for eksempel, en vellykket utvinning av hudceller fra pasient biopsier og generering av huden organotypiske kulturer ved hjelp av pasient avledet hudceller 8. Men uløste problemer forbli knyttet til dårlig sekresjon av ekstracellulære matrix proteiner ved hudcellene seg og resulterer i sub-optimale hud modeller. Videre den tiden som kreves for å generere 3D organotypiske hud co-kultur med dagens protokoller varierer mellom fire til åtte uker, en tidsramme som potensielt kan bli forkortet med inkorporering av makromolekylære Crowders. Redusere kultur tide sparer reagens kostnader, reduserer forekomsten av cellen senescence og reduserer ventetiden for pasienten bør preparatet brukes i klinikken.
t "> Macromolecular crowding (MMC) involverer å introdusere spesifikke makromolekyler til kulturmediet for å generere utelukkede volumeffekter. Disse påvirker enzymatiske reaksjonshastigheter, inkludert den proteolytiske spaltning av prokollagen som er treg under standard vandige kulturbetingelser 9-13. Under MMC, enzymatiske reaksjoner er ilte uten å øke mengden av reagenser 14,15 resulterer i, i tilfelle av prokollagen spalting, en økt mengde av kollagen i-molekyler i overfylte kulturer sammenlignet med kontroller urørte 10. som omdannelsen av prokollagen til kollagen tillater dannelse av kollagen forsamlinger, fibroblaster dyrket med MMC i 48 timer ga betydelig mer kollagen i forhold til urørte fibroblast kulturer overvåkes i opptil fire uker 11,16,17. Foruten effekter på enzymatiske aktiviteter som påvirker dannelsen, stabilisering og ombygging av ECM, MMC også har vist seg å direkte øke og modulere kollagenfiberdannelse 18,19.Vi presenterer her en metode for å øke den ekstracellulære matriks (ECM) produksjon av hudceller, særlig, dermale fibroblaster og epidermale keratinocytter. I tillegg, viser vi at det anrikede ECM fremstilt under MMC i monolagskulturer kan decellularized og brukes som ren celle-avledet matrise (CDM).
Vi bruker en ikke-konvensjonell tilnærming til å visualisere og fullt utbytte av den ECM avsatt av hudceller dyrket med MMC. Interferens refleksjon mikroskopi brukes typisk for å studere celle-matriks-interaksjoner eller celle-til-glass kontaktpunkter. Denne teknikk ble benyttet i systemet for å vise den totale mengden av matrise avsatt på glassoverflaten. Interferens refleksjon mikroskopi ble kombinert med fluorescerende farging for å oppnå den mest mengden av informasjon i form av ekstracellulære matrise sammensetning og mønster, i nærvær og fravær av MMC.
Organotypic hud ko-kulturer er en klassisk metode for å modellere hud in vitro i en tre-dimensjonal kontekst. Selv om todimensjonale ko-kulturer kan gi vesentlig informasjon, er det begrenset til å oversette disse data, og å anvende det tilbake til et in vivo miljø, som i seg selv er en tre-dimensjonal struktur. Skin keratinocytter, i særdeleshet, er polarisert og inneholder apikale og basale segmenter som er avgjørende for homeostase og celle etterlevelse. I tillegg er ekspresjonen av typiske suprabasal proteiner i keratinocytter over basallaget, så som keratin 1, keratin 10 og filaggrin bare til stede i løpet av lagdelingen og terminal differensiering av keratinocytter. Som terminal differensiering er nesten ikke til stede i typiske monolagskulturer, er suprabasal protein uttrykk vanligvis ikke oppnås i dette kultursystem. Derfor organotypiske kulturer start neddykket i kulturmedium, men blir deretter løftet til en luft-væske-grenseflate for å drive keratinocyte differensiering. Dette resulterer i ekspresjonen av lagdeling markører, og med horndannelse og en generelt bedre refleksjon av epidermal fysiologi. Mens andre grupper har tidligere generert organotypiske hud co-kulturer med hell, har etableringen av en funksjonell Dermo-epidermal junction sonen vært et problem. Her presenterer vi en ny metode for dyrking organotypiske hud co-kulturer med en forbedret basalmembran, i en kondensert tidsramme og uten at løpetiden på disse konstruksjonene. Dette vil gi huden etterligninger for in vitro modellering, studiet av huden biologi og et utvalg av utvelgelsesassays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. makromolekylær gruppering i 2D Skin cellekulturer
- Seed 50.000 celler (fibroblaster primære eller primære keratinocyter eller ko-kultur av primære fibroblaster og keratinocytter) per brønn i en 24-brønns plate. Seed celler i 1 ml av den tilsvarende celletype vekstmedier.
- La cellene få feste seg over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Kast gamle media og erstatte med 1 ml ferske medier som inneholder makromolekylCrowDers og 100 mikrometer askorbinsyre. Bruke en Crowder cocktail bestående av 37,5 mg / ml Ficoll 70 og 25 mg / ml Ficoll 400. Bruk fibroblast media (FM) som består av DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin antibiotika. Grow keratinocytter i et serum-frie medier, KSFM eller CnT-57. Opprettholde ko-kulturer i en blanding av 50% FM og 50% serumfritt medium.
- Inkubere kulturene i 6 dager i en 37 ° C inkubator ved 5% CO2, med en endring av medium hver 2. dag.
2. Fluorescent Farging på huden cellekulturer
- Vask cellekulturer to ganger med 1x PBS.
- Løs cellekulturer med enten metanol eller paraformaldehyd (avhengig av antistoff-spesifikasjonene).
- For Metanol Fixation
- Alikvoter 500 ul kald metanol i hver brønn og inkuber ved -20 ° C i 10 min. Aspirer fiksativ og kast metanol avfall. Lufttørke i en laminær avtrekkshette.
- For Paraformaldehyde Fixation
- Alikvoter 500 ul av 2% paraformaldehydløsning i hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 15 min. Aspirer fiksativ og kast paraformaldehyde avfall.
- Vask med 1x PBS, for tre vasker, 5 min per vask.
- Delmengde 1 ml 1x PBS i hver brønn.
- For Metanol Fixation
- Fluorescent Farging Bruke Antistoffer
- Alikvoter 500 ul 3% bovint serumalbumin (fortynnet i 1 x PBS) i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i tre0 min. Aspirer blokkering løsningen og kast.
- primær antistoff
- For avbildning direkte fra platen: Alikvoter 200 ul primære antistoff (1: 100 fortynning i 10% geiteserum) oppløsning i hver brønn og inkuber i 90 min ved romtemperatur.
- For Dekk: Delmengde 50 mL av primær antistoff (1: 100 fortynning i 10% geit serum) løsning på et flatt stykke Parafilm. Plassere dekkglass på Parafilm, med den celle-side (en del av dekkglass med celler) som vender mot løsningen. Dekke hele celle-side, med ingen bobler. Inkuber i 90 minutter ved romtemperatur.
- Sug primær antistoff løsning og kast.
- Vask med 1x PBS, for tre vasker, 5 min per vask.
- sekundært antistoff
- For avbildning direkte fra platen: Alikvoter 200 pl sekundært antistoff (1: 400 fortynning i 10% geiteserum) oppløsning til hver brønn og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, som dekker platen med aluminium fo il.
- For Dekk: Delmengde 50 mL av sekundært antistoff (1: 400 fortynning i 10% geit serum) løsning på et flatt stykke Parafilm. Plassere dekkglass på Parafilm, med den celle-side (en del av dekkglass med celler) som vender mot løsningen. Dekke hele celle-side, med ingen bobler. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, som dekker Parafilm med aluminiumsfolie.
- Sug sekundært antistoff løsning og kast.
- Vask med 1x PBS, for tre vasker, 5 min per vask. Delmengde 1 ml 1x PBS i hver brønn.
- monterings~~POS=TRUNC
- For bildebehandling direkte fra plate: ikke montere. Fortsett til mikroskop.
- For avbildning av dekkglass: Mount dekk, i montering media, på et objektglass. Tørke over natten i en beholder dekket med aluminiumsfolie. Fortsett til mikroskop.
- Acquire Images Bruke en Confocal Laser Scanning Microscope med 40X / 1,30 Oil Objective.
- Vask cellelag to ganger med 1x PBS.
- Delmengde 100 mL av lysis buffer (se Materials List) i hver brønn (6-brønns plate format). Skrap celleskiktet med en celleskrape og overføre oppløsningen til et mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger oppløsningen ved 15 330 xg i 30 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et mikrosentrifugerør og kast pellet.
- Bland 13 ul av hver prøve med 5 pl prøvebuffer og 2 ul av reduksjonsmiddel (se Materialer List). Varme prøvene ved 95 ° C i 10 min.
- Sentrifuger prøver ved 15 330 xg i 1 min for å samle kondens vann. Laste prøvene i en pre-cast PAGE gel og kjøre på 100 V i omtrent en time.
- Slik overfører separerte proteiner til en nitrocellulosemembran, sandwich gel og membran mellom biter av papir og svamper (av samme størrelse). Pass på at det ikke er noen bobler mellom gel, membran, papirer og svamps. Lukk sandwich kassett og kjøre overføring på 70 V for 2 timer.
- For å sjekke om overføringen var fullført, inkuber membranen med 10 ml Ponceau S. Vaskes membran med 0,1% PBS-Tween-20, tre ganger, 10 min per vask.
- Blokk med 10 ml 5% melk i 1 time ved romtemperatur. Vask membran med 0,1% PBS-Tween-20, tre ganger, 10 minutter per vask.
- Inkuber med 10 ml primært antistoff i 90 min (mus anti-kollagen VII, LH 7,2, 1: 1000 fortynning i 5% melk). Vask membran med 0,1% PBS-Tween-20, tre ganger, 10 minutter per vask.
- Inkuber med 10 ml sekundært antistoff i 30 minutter (geite-anti-muse-HRP, 1: 2000 fortynning i 5% melk). Vask membran med 0,1% PBS-Tween-20, tre ganger, 10 minutter per vask.
- Overfør membranen til en kassett og tilsett 1 ml ECL Detection Reagent. Plasser en klar, tynn plast ark over membranen.
- For å detektere kjemiluminescens, plassere en lysfølsom film over plastfolien og lukke kassetten. etter 2-5 Min, fjerne filmen fra kassetten og plassere den i en utvikler.
4. Lage og bruke en Cell-avledet Matrix
- Seed 50.000 celler (fibroblaster primære eller primære keratinocyter eller ko-kultur av primære fibroblaster og keratinocytter) per brønn i en 24-brønns plate.
- La cellene få feste seg over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Kast gamle media og erstatte med nye medier som inneholder makromolekylCrowDers og 100 mikrometer askorbinsyre. Den Crowder cocktail består av 37,5 mg / ml Ficoll 70 og 25 mg / ml Ficoll 400. Fibroblast media (FM) består av DMEM supplert med 10% FBS og 1% pen-strep. Keratinocyter blir dyrket i et serumfritt medium, KSFM eller CnT-57. Opprettholde ko-kulturer i en blanding av 50% FM og 50% KSFM eller CnT-57.
- Inkubere kulturene i 6 dager i en 37 ° C inkubator ved 5% CO2, endrer media hver 2 dager.
- Decellularize cellelagene for å oppnå en celle-avledet Matrix (f-mat = fibroblast-avledet matrise, k-mat = keratinocyte-avledet matrise, co-mat = matrise avledet fra en co-kultur av fibroblaster og keratinocytter).
- Vask cellelag to ganger i 1x PBS.
- Tilsett 250 ul av 0,5% natriumdeoksycholat. Inkuber, på is i 10 min. Sug cellelysat.
- Gjenta trinn 4.5.2 tre ganger.
- Vask celle-avledede matrisen to ganger i destillert H2O Hold celle-avledede matrisen i 1 x PBS. Matriser kan lagres i opp til en uke ved 4 ° C.
- Forbered Sekundær Cell Suspension (for eksempel Seeding Keratinocytter på toppen av f-mat).
- Sug 1x PBS.
- Seed 50000 keratinocytter på toppen av celle-avledet matrise (f-matte). La cellene få feste seg over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
Merk: Analyser kan utføres direkte på de adherente celler.
5. Karakterisering av det Celle-avledet Matrix
- Fluorescent farging: Se protokoll 2.
- Interferens Refleksjon Mikroskopi
- Seed cellene på å glass, følgende protokoll 04.01 til 04.05.
- Etter innhenting av celle-avledede matrisen, feste prøver følgende protokoll 2,2.
Merk: Antistoff farging er valgfritt. Hvis det er nødvendig, se protokoll 2.3. - Utfør image oppkjøpet ved å bruke en konfokal laser scanning mikroskop med en 40X / 1,30 olje objektiv. Sett pinhole på 74 mm.
- Bruk LP 505 for forstyrrelser re fl ection mikroskopi (IRM) kanal og BP 575-615 IR for fl uorescence røde kanalen for filtre. Bruk NT 80/20 for IRM kanal og HFT 405/488/561, NFT 565, plate for fl uorescence røde kanalen for stråledelere. Bruk følgende lasere: dpss 561-10 (bølgelengde 561 nm) på 1,1% strøm for fl uorescence røde kanalen og HeNe633 (bølgelengde 633 nm) på 5,0% strøm til IRM kanal.
6. 3D organotypiske Skin Co-kultur
- Støpes en Collagen Gel, med Fibroblaster Encapsulated, i en celle-kultur Insert (6-brønners plateformat).
- Alikvot 10 ml rottehale kollagen type I til en kald begerglass.
- Tilsett 1 ml kald DMEM. Tilsett 0,5 ml 1 M NaOH for å nøytralisere den sure kollagen. Tilsett 0,5 ml fibroblast suspensjon (inneholdende fibroblaster 1.200.000).
- Overfør løsningen, i en kald pipette til cellekultur-innsatser i en 6-brønns plate. 12 ml total oppløsning er jevnt delt inn i 6-celle-dyrkningsinnsatser.
- Inkuber gelen i en 37 ° C inkubator ved 5% CO2 i 1 time.
- Etter at gelen har stivnet, senk gel i FM. Etter 24 timer, kast de gamle media og erstatte med nye medier, som inneholder makromolekylære Crowders. Legge til et volum på 2 ml til det indre av cellekulturinnsats og 2 ml til utsiden av cellekulturen innsatsen.
- Etter 24 timerSeed Keratinocytter på toppen av Collagen Gel.
- Trypsineres keratinocytter ved bruk av 0,125% trypsin / chelateringsmiddel i 5 minutter ved 37 ° C. Trykk sider av flasken forsiktig for å løsne celler og nøytralisere trypsin med serum som inneholder media. Telle celler og forberede keratinocyte suspensjon (300.000 keratinocytter per gel og suspendert i 200 mL media).
- Sug gammel media fra cellekultur innsatsen. Legg keratinocytter på toppen av gelen.
- Inkuber gelen i en 37 ° C inkubator ved 5% CO2 i 1 time.
- Etter keratinocytter har festet til gelen overflate, dyppes gel med 2 ml KSFM eller CnT-57 til innsiden av det cellekulturinnsats og 2 ml av FM til utsiden av cellekulturen innsatsen.
- Etter 24 timer, kast de gamle media og erstatte med nye medier, som inneholder makromolekylære Crowders.
- Etter 7 dager med neddykket kultur, heve kulturen til en luft-væske-grenseflate.
- Overfør cellekultur insERT til et dyp-brønns plate. Tilsett 10 ml stratifisering media til utsiden av cellekulturen innsatsen. Hold det indre av cellekulturinnsats tørr.
- Inkuber kulturer i en 37 ° C inkubator ved 5% CO 2 og endre media hver 3 dager, for de neste 14 dagene.
Merk: Etter 2 uker på luft-væske-grensesnittet, er huden tilsvarende modne og kan høstes (enten smekk frossen eller formalin fast).
7. Harvest og karakterisering av organotypiske Skin Equivalents
- Sug lagdeling medier.
- Ved hjelp av pinsett, overføre kulturen setter på et papirhåndkle og bearbeid bort gjenværende media fra bunnen av innsatsen.
- Ved hjelp av en skalpell, kuttet langs den indre omkrets av kulturen innsatsen.
- Fest organotypiske huden co-kultur (sammen med PET membran).
- Snap Freeze
- Overfør gel konstruere en cryomold. Dekk innsiden av cryomold med oktobersammensatte. Plasser cryomold inn i flytende nitrogen i 10 sekunder.
- Ved hjelp av pinsett, fjerner den frosne cryomold fra flytende nitrogen, pakk inn i aluminiumsfolie og lagre den frosne prøvene i en -80 ° C fryser.
- Seksjon frosne prøver med en kryostat, med en seksjon tykkelse på 7 pm.
- formalin Fixation
- Plasser en biopsi svamp pad 'inn i' biopsi kassett '. Overfør gel bygge på svamp pad. Plasser en annen svamp pad forsiktig på toppen av gelen konstruksjonen. Lukk kassett.
- Fullt senk kassetten i 10% nøytral bufret formalin i 48 timer, ved romtemperatur. Ta ut kassetten og kast formalin avfall.
- Bygge inn den faste prøven i en voksblokk ved først å dehydrere med en etanol-serien og deretter gradvis infiltrering av prøven med voks. Seksjon voksblokken med en mikrotom.
- Snap Freeze
- Karakterisering av det hudekvivalent
- farging
- For frossen seksjoner:
- Inkuber seksjoner i 10% geiteserum (fortynnet i 1 x PBS) i 1 time ved romtemperatur. Vask 1x seksjoner i PBS for å fjerne geiteserum.
- Inkuber seksjoner med primære antistoff (1: 100 fortynning i 10% geiteserum) i 90 minutter ved romtemperatur. Vask seksjoner 1x PBS, tre ganger, 5 min per vask.
- Inkuber seksjoner med sekundært antistoff (1: 400 fortynning i 10% geiteserum) i 30 minutter ved romtemperatur, i en beholder dekket med aluminiumsfolie. Vask seksjoner 1x PBS, tre ganger, 5 min per vask.
- Mount lysbilder, med montering media, på et dekkglass. Cover prøver med aluminiumsfolie og la det tørke over natten.
- Bilde ved hjelp av en konfokal mikroskop med en 40X / 1,30 olje objektiv.
- For Formalin Fast Parafin Embedded Seksjoner:
- Dewax seksjoner (og rehydratiseres) i synkende prosentandeler av etanol og vann (Xylene - 100% etanol- 90% etanol - 80% etanol - 70% etanol - vann). Fullt senk prøver i løsninger. Hver avvoksing skritt bør være 3 min.
- Inkuber seksjoner i 1% hydrogenperoksyd i 30 minutter. Vask 1x seksjoner i PBS i 5 min.
- Inkuber seksjoner i citrat-løsning (10 ml citrat-oppløsning ble oppløst i 90 ml vann) ved 120 ° C i 20 min. Tillat lysbilder for å avkjøles over natten, ved værelsetemperatur. Vask seksjoner 1x PBS, tre ganger, 5 min per vask.
- Inkuber seksjoner i 10% geiteserum (fortynnet i 1 x PBS) i 1 time ved romtemperatur. Vask 1x seksjoner i PBS for å fjerne geiteserum.
- Inkuber seksjoner med primære antistoff (1: 100 fortynning i 10% geiteserum) i 90 minutter ved romtemperatur. Vask seksjoner i 1 x PBS, tre ganger, 10 minutter per vask.
- Inkuber seksjoner med HRP-merket polymer (ufortynnet) i 30 min, ved romtemperatur. Vask seksjoner med 1x PBS, tre ganger, 10 min per vask.
- Til en mikrosentrifugerør, kombinere 1 mlDAB substrat (3,3'-diaminobenzidin) med en dråpe kromogen. Inkuber seksjonene med denne løsningen i 15 sekunder - 5 minutter (brun farge = positivt signal).
- For å stoppe reaksjonen, vaske delene i rennende vann.
- Counterstain kjerner med hematoksylin, i 5 minutter. Skyll delene i rennende vann.
- Inkuber seksjoner i sur alkoholoppløsning, i 1 min. Skyll delene i rennende vann.
- Inkuber seksjoner i Scotts vann fra springen løsning, for 2 min. Skyll delene i rennende vann.
- Valgfritt: Inkuber seksjoner i eosin for 1 min og vask i rennende vann.
- Dehydrere seksjoner i stigende andeler av etanol og xylen (70% etanol - 80% etanol - 90% etanol - 100% etanol - xylen). Sørg for at prøvene er helt under vann i 3 minutter per scenen.
- Mount lysbilder, med feste media, til en dekkglass. Lufttørke over natten.
- Bilde ved hjelp av en konfokal mikroskop med en 40X / 1,30 olje objektiv.
- For frossen seksjoner:
- Transmisjonselektronmikroskopi (For å visualisere Forankring Fibriller)
- Fix prøver i 2,5% glutaraldehyd i 72 timer.
- Vask prøver i 1x PBS, tre ganger, 10 min per vask.
- Skjær i små biter (1 mm 3). Post-fix prøver i 1% osmiumtetroksyd, pH 7,4, i 1 time ved romtemperatur. Vask prøver i destillert vann.
Forsiktig: osmiumtetroksyd er giftig og giftig og bør håndteres forsiktig i en avtrekkshette. - Dehydrere prøvene gjennom en stigende serie etanol (25% etanol - 50% etanol - 75% etanol - 95% etanol - 100% ethanol - aceton) i 20 minutter per trinn.
- Infiltrere ved å dyppe prøvene i 100% aceton: araldite harpiks (1: 1) i 30 minutter ved romtemperatur og deretter ved 1: 3 til 1 time, fulgt av 1: 6 over natten. Suge prøven i frisk araldite harpiks i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av en annen endring av frisk araldite harpiks i 1 time ved 40 ° C. La den tredje frisk enraldite harpiksen Endringen i 1 time ved 45 ° C og forlater den fjerde frisk araldite harpiksen Endringen i 1 time ved 50 ° C.
- Inkuber prøvene ved 60 ° C i 24 timer for å tillate polymeriseringen.
- § prøver ved å bruke et glass kniv, for å oppnå semi-tynne snitt med en tykkelse på 1 pm. Stain seksjon med metylenblått å observere histologi. Seksjon av prøven for å oppnå ultra-tynne snitt av 70 nm og samle hver seksjon på et kobbergitter.
- Flekk-seksjoner med 5% uranylacetat løsningen i 15 minutter, etterfulgt av 3% bly-citrat-løsning i 10 min.
- Hente bilder med en transmisjonselektronmikroskop (100 kV), ved en forstørrelse på 30.000.
- farging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Makromolekylært trenging var i stand til å forbedre ECM avsetning, særlig fibroblaster avsatt mer kollagen I, IV og fibronektin sammenlignet med kontrollkulturer (fig 1, Cell lag, 1A, collagen I, 1B, kollagen IV; 1C, fibronektin). Ved decellularization, var det tydelig at fibroblaster var hoved innskytere av kollagen I, IV og fibronektin sammenlignet med keratinocytter (figur 1, Matrix).
I figur 2, ble det observert at fibroblaster i stedet for keratinocytter var hoved produsenter av kollagen VII. Dette er den første rapport av kollagen VII deponert med hell in vitro (Benny et al, 2015).
Cellen-avledet matrise ble karakterisert gjennom immunfluorescens med bestemte antibodtallet. Selv om dette er en klassisk tilnærming, var det viktig å visualisere ECM i sin helhet, og fullt ut forstår effekten av makromolekylære Crowders. Bruke forstyrrelser refleksjon mikroskopi (IRM), ble det fulle omfanget av matrisen fanget (figur 3). En overlapping av antistoffarging med IRM bilde viser den relative mengden av den ECM komponent i forhold til den totale mengden av ECM.
I et 3D in vitro modell hud, MMC kondenseres kulturen tid fra 5 uker til 3 uker for å oppnå en moden organotypiske hud ko-kultur (figur 4). En hematoxylin og eosin farging viste at ved 3 uker, kulturen med makromolekylære Crow besto av et pluri-stratifisert epidermis og dermis stromale rik, sammenlignet med kontrollkulturer urørte som manglet en helt differensiert epidermis. I tillegg ble intens og kontinuerlig kollagen VII immunofarging detekteres ved dermal-epidermal krysset av overfylt cellekulturer, sammenlignet med en svak og ustabil kollagen VII immunofarging i kontrollkulturer. Transmisjonselektronmikroskopi (figur 5) viste tilstedeværelse av fibriller forankring i organotypiske kulturer, som viser funksjonell kollagen VII.
Figur 1: Mixed macromolecular trengsel (mMMC) forbedrer deponering av dermal-epidermal junction komponenter in vitro (A) Collagen I nedfall er forbedret med mMMC (cellelaget og matrise) i fi broblasts bare.. Trengsel av co-kulturer produsere de mest kollagen jeg og viser at keratinocytter stimulert kollagen I produksjon av fi broblasts. (B) Kollagen IV deponering av fi broblasts forsterkes av trengsel. Dette er sett enda mer tydelig i overfylte co-kulturer. Av notatet, keratinocytes farget for kollagen IV viser for det meste celleassosiert eller intracellulær kollagen IV, men ikke en pericellulær matrise. I co-kulturer, begge celletyper skille med kollagen IV er hovedsakelig forbundet med fi broblasts spar keratinocytt øyer. (C) Fibronektin deponering ble bare sett med fi broblasts, og deri sterkt forbedret med trengsel (cellelaget og matrise). I co-kulturer, ble en retikulære maske av fi bronectin forbundet med bare fi broblasts, sparing øyene keratinocytter. Skala barer = 20 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Benny et al., 2015. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mixed macromolecular trengsel (mMMC) forenkler deponering avforankring fi bril bygningen kollagen VII. (A) En retikulære deponering mønster av kollagen VII deponering er tydelig med fi broblasts kun i henhold mMMC. I co-kulturer er ekstracellulært kollagen VII sterkt assosiert med fi broblast kolonier i mellom keratinocytt øyene. Keratinocytter viser pericellulær og intracellulær kollagen VII mer sterkt uttrykt, i nærvær av mMMC. Etter cellelyse, er kollagen VII fotavtrykk sett i en fi ne kornet lag i mMMC-behandlede fi broblast kulturer, men en merkbar fi brillar nedfall er hentet fra co-kulturer. (B) immunoblotanalyse av lyserte cellelagene viser at både overfylte fi broblasts og keratinocytt kulturer inneholde signifikant mer kollagen VII sammenlignet med urørte kontroller. Den hentet kollagen VII er hovedsakelig pericellulær utledet. (C) Densitometrisk analyse av B viser at mMMC øker mengden av celle-knytted kollagen VII med en faktor på 8 i fi- broblasts og en faktor på 2 i keratinocytter. Skala barer = 20 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Benny et al., 2015. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: fibroblast fotavtrykk inneholde mer total ECM som visualiseres ved forstyrrelser re fl ection mikroskopi (IRM) På analyse av enkelt ECM komponenter (kollagen IV og fi bronectin), kultur henhold mMMC forbedret ekstracellulære deponering.. For å visualisere den totale ECM avsatt, ble IRM brukt til å kvantifisere alle ECM som antistoff farging hadde sine begrensninger. IRM viste tydelig den totale mengde grunnmasse og mønster i henhold mMMC sammenlignet med kontrollforhold. Scale bar = 20 mikrometer. Dette tallet har værtmodifisert fra Benny et al., 2015. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Mixed macromolecular trengsel (mMMC) i neddykket fasen forbedrer modning av dermal-epidermal junction (DEJ) i huden ekvivalenter fibroblastlignende inneholder kollagen gels ble sådd med keratinocytter på toppen og holdt under vann i en uke, deretter løftet til et luft-væske-grensesnittet. I den klassiske protokollen, kollagen VII (grønn) var fraværende etter totalt 3 uker i kultur, men først i hud-ekvivalenter etter 5 uker. I motsetning til dette, i henhold til mMMC, kollagen VII var allerede sterkt tydelig etter 3 uker, og enda sterkere farget etter 5 uker, sammenlignet med vanlige kulturer. Hematoxylin og eosin (20X forstørrelse) farging cpå fi RMED at med denne raske protokollen, Strati fi sering og modenhet av huden tilsvar ble opprettholdt og akselerert. Scale bar = 100 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Benny et al., 2015. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5:. Bevis på de novo dannelsen av forankring fi brils i huden ekvivalenter oppnådd under mMMC ultrastructural studier av den gryende dermal-epidermal krysset organotypiske co-kulturer etter en 3 ukers kultur protokoll med mMMC (A, B) antyder strukturer beslektet med forankring fi brils (piler) som er fraværende i ikke-overfylte hud ekvivalenter (C) etter 3 uker med kultur. Dette tallet har blitt endret from Benny et al., 2015. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
