Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Förbättra 2D och 3D Skin Published: August 22, 2016 doi: 10.3791/53642
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 1,2,3
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Epithelial Biology Laboratory, Institute of Medical Biology, A*STAR, 3Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att erhålla cell härledda matriser rik på extracellulära matrixproteiner, med hjälp av makromolekylära Crowders (MMC). Dessutom presenterar vi ett protokoll som omfattar MMC i 3D organotypic hud co-kultur generation, vilket minskar kultur tid med bibehållen löptid konstruktion.

Abstract

Glykoproteinet familjen gener representerar de viktigaste strukturella proteiner i människokroppen, och är viktiga komponenter i biomaterial som används i moderna vävnadsteknik. En teknisk flaskhals är avsättningen av kollagen in vitro, eftersom det är notoriskt långsam, vilket resulterar i suboptimal bildandet av bindväv och efterföljande vävnads sammanhållning, särskilt i hud modeller. Här beskriver vi en metod som innebär tillsättning av differentiellt stora sackaros sampolymerer till hud- kulturer för att generera makromolekylära utträngning (MMC), vilket resulterar i en dramatisk förbättring av kollagendeponering. Särskilt hudfibroblaster deponerat en betydande mängd av kollagen I / IV / VII och fibronektin i MMC i jämförelse med kontroller.

Protokollet beskriver också en metod för att decellularize trångt cellager, utsätta betydande mängder extracellulärt matrix (ECM) som kvarhölls på odlingsytan, vilket framgår av immunocytochemistry. Totalt matrismassa och distributionsmönster studerades med hjälp av störnings eftertanke mikroskopi. Intressant, fibroblaster, keratinocyter och co-kulturer framställda cell härledda matriser (CDM) av varierande sammansättning och morfologi. CDM skulle kunna användas som "bio-ställningar" för sekundär cellsådd, där den nuvarande användningen av beläggningar eller ställningar, typiskt från xenogena djurkällor, kan undvikas, vilket rör sig mot mer kliniskt relevant applikationer.

Dessutom har denna protokoll beskriver tillämpningen av MMC under den nedsänkta fasen av en 3D-organotypic hud sam-odlingsmodell som var tillräcklig för att förstärka ECM nedfall i dermo-epidermala förbindelsen (DEJ), i synnerhet kollagen VII, huvudkomponenten förankrings fibriller. Elektronmikroskopi bekräftade förekomsten av förankrings fibriller i kulturer utvecklas med MMC, jämfört med kontroller. Detta är betydelsefullt eftersom förankrings fibriller tjudra dermis till epidermis därmedsom har en förformad mogen DEJ kan gynna hudtransplantat mottagare i termer av transplantat stabilitet och allmänt sårläkning. Vidare odlingstiden kondenseras från 5 veckor till 3 veckor för att erhålla en mogen konstruktion, vid användning av MMC, minska kostnaderna.

Introduction

Huden bildar en skyddande barriär genom att förhindra vattenförlust och patogen inträde. Det består av tre huvudkomponenter; de stromala rika dermis 1, en ​​skiktad epidermis 2,3,4 ovanpå det, och dermo-epidermal junction mellan 5,6. Dermis består till stor del av kollagen och elastiska fibrer och är glest befolkat med fibroblaster 7. Däremot är cellrika epidermis består av flera lager av keratinocyter. Keratinocyterna i den innersta lagret är proliferativ och ge nya basalceller som förnyar och ersätter terminalt differentierande keratinocyter som ständigt flyttar till det yttre rsta lagret av huden och har förlorat sina kärnor och cytoplasma material, vilket resulterar i en hornlager som genomgår deskvamation.

Den dermala-epidermala förbindelsen, en specifik typ av basalmembran, är en komplex struktur som består av sammankopplade matrismolekyler, vilka tetheRS epidermis till dermis. Kollagen I-fibrer i dermis vävs med kollagen VII förankrings fibriller som är förankrade till kollagen IV rika lamina densa. Förankringsfilament (laminin 5, kollagen XVII och integriner) i sin tur ansluta lamina densa med hemidesmosomer av basala keratinocyter. Basala keratinocyter (stratum basale) har kapacitet att proliferera och förnya, samt differentiera och stratify att bilda de suprabasala skikten; stratum spinosum, stratum granulosum, och slutligen stratum corneum, som utgör kontaktytan av huden med miljön. På resa från det basala skiktet till det kornifierade lagret, keratinocyter växla uttrycksmönster av cytokeratiner och slutligen genomgår apoptos och inlägga sig i förhornade kuvert, skrov av specifika proteiner som är kovalent tvärbundna genom transglutaminasaktivitet.

Återskapa hud och dess skikt in vitro, inklusive de komplexa strukturer av dermal-epidermal korsning och huden extracellulära matrisen och att emulera cornification processen har länge fascinerat forskare och bioengineers som en utmanande uppgift. Det har skett betydande framsteg i hudens vävnadsteknik, till exempel, en framgångsrik utvinning av hudceller från patientens biopsier och generering av huden organotypic kulturer med hjälp av patientgenererade hudceller 8. Men fortfarande olösta problem som hänför sig till dålig utsöndring av extracellulära matrixproteiner av hudceller själva och resulterar i suboptimala hud modeller. Dessutom den tid som krävs för att generera 3D organotypic hud co-kultur med dagens protokoll varierar mellan fyra till åtta veckor, en tidsram som potentiellt skulle kunna förkortas med införlivandet av makromolekylära Crowders. Minska odlingstiden sparar reagenskostnader, minskar förekomsten av cellåldrande och minskar väntetiden för patienten ska produkten användas i kliniken.

t "> Makromolekylär utträngning (MMC) består i att införa specifika makromolekyler till odlingsmediet för att generera uteslutna volymeffekter. Dessa påverkar enzymatiska reaktionshastigheterna inklusive den proteolytiska klyvningen av prokollagen som är tardy under standard vattenhaltiga odlingsbetingelser 9-13. Under MMC, enzymatiska reaktioner är påskyndas utan att öka mängden av reagens 14,15 resulterar i, i fallet med prokollagen klyvning, en ökad mängd av kollagen i-molekyler i trånga kulturer jämfört med uncrowded kontroller 10. eftersom omvandlingen av prokollagen till kollagen medger bildning av kollagen heter, fibroblaster odlade med MMC under 48 timmar gav betydligt mer kollagen i jämfört med uncrowded fibroblastkulturer övervakas i upp till fyra veckor 11,16,17. Förutom effekter på enzymatiska aktiviteter som påverkar bildandet, stabilisering och ombyggnad av ECM, MMC också har visat sig direkt öka och modulera kollagenfiberbildning 18,19.

Vi presenterar här en metod för att öka den extracellulära matrisen (ECM) produktion genom hudceller, i synnerhet, dermala fibroblaster och epidermala keratinocyter. Dessutom visar vi att den anrikade ECM producerad under MMC i monolagerkulturer kan decellulariseras och användas som rena cellhärledda matris (CDM).

Vi använder ett icke-konventionella sättet att visualisera och fullo uppskatta ECM deponerats av hudceller odlade med MMC. Interferensreflektions mikroskopi används typiskt för att studera cell-matrix-interaktioner eller cell-till-glas kontaktpunkter. Denna teknik användes i vårt system för att visa den totala mängden av matris avsattes på glasytan. Störningar reflektion mikroskopi i kombination med fluorescerande immunfärgning att få så mycket information i form av extracellulära matriskomposition och mönster, i närvaro och frånvaro av MMC.

Organotypic huden samkulturer är en klassisk metod för att modellera huden in vitro i ett tredimensionellt sammanhang. Medan tvådimensionella co-kulturer kan ge viktig information, är den begränsad vid omräkning dessa data och tillämpa den tillbaka till en in vivo miljö, som till sin natur är en tredimensionell struktur. Hudkeratinocyter, i synnerhet, är polariserade och innehåller apikala och basala segment som är nödvändiga för homeostas och cellvidhäftning. Dessutom är ett uttryck för typiska suprabasala proteiner i keratinocyter ovanför basalskiktet, såsom keratin 1, keratin 10 och filaggrin endast förekommer i samband med stratifiering och terminal differentiering av keratinocyter. Som terminal differentiering är knappast förekommer i typiska monoskiktsodlingar, är suprabasala proteinuttryck normalt inte uppnås i detta odlingssystem. Därför börjar organotypic kulturer nedsänkt i odlingsmedium, men är därefter lyfts till en luft-vätske-gränssnittet för att driva keratinocyte differentiering. Detta resulterar i expressionen av skiktnings markörer, även cornification och en generellt bättre återspegling av epidermal fysiologi. Medan andra grupper har tidigare genererat organotypic hud co-kulturer framgångsrikt har inrättandet av en funktionell dermo-epidermal korsning zon varit ett problem. Här presenterar vi en ny metod för att odla organotypic hud co-kulturer med en förbättrad basalmembran, i en kondenserad tidsram och utan att äventyra mognad av dessa konstruktioner. Detta skulle ge huden härmare för undersökning in vitro modellering, studiet av huden biologi och ett sortiment av screeningsanalyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Macro Trängsel i 2D Skin cellkulturer

  1. Seed 50000 celler (primära fibroblaster eller primära keratinocyter eller samodling av primära fibroblaster och keratinocyter) per brunn av en 24-brunnar. Fröceller i 1 ml av den motsvarande celltyp tillväxtmedia.
  2. Tillåta cellerna att vidhäfta över natt, i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2.
  3. Kasta gamla medier och ersätta med 1 ml färskt medium innehållande makromolekylära Crowders och 100 ^ M askorbinsyra. Använda en Crowder cocktail bestående av 37,5 mg / ml Ficoll 70 och 25 mg / ml Ficoll 400. Använd fibroblast media (FM) bestående av DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin antibiotika. Växa keratinocyter i ett serumfritt medium, KSFM eller CnT-57. Upprätthålla samodlingar i en blandning av 50% FM och 50% serumfritt medium.
  4. Inkubera kulturer i 6 dagar i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2, med en mediaändring var 2 dagar.

2. Fluorescerande immunfärgning på huden cellkulturer

  1. Tvätta cellkulturer två gånger med 1 x PBS.
  2. Fix cellkulturer med antingen metanol eller paraformaldehyd (beroende på specifikationerna antikropps).
    1. För Metanol Fixering
      1. Alikvot 500 pl kall metanol till varje brunn och inkubera vid -20 ° C under 10 min. Aspirera fixativ och kassera metanol avfall. Lufttorka i ett laminärt dragskåp.
    2. För Paraformaldehyd Fixering
      1. Alikvot 500 pl 2% paraformaldehydlösning i varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 15 min. Aspirera fixativ och kassera paraformaldehyd avfall.
      2. Tvätta med 1 x PBS, för tre tvättningar, 5 min per tvätt.
      3. Alikvotera 1 ml 1x PBS i varje brunn.
  3. Fluorescerande immunfärgning med användning av antikroppar
    1. Alikvot 500 pl 3% bovint serumalbumin (utspädd i 1 x PBS) i varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur under 30 min. Aspirera blockerande lösningen och kassera.
    2. primär antikropp
      1. För avbildning direkt från plattan: Alikvot 200 pl av primär antikropp (1: 100 spädning i 10% getserum) lösning till varje brunn och inkubera under 90 minuter vid rumstemperatur.
      2. För täckglas: Alikvotera 50 pl av primär antikropp (1: 100 spädning i 10% getserum) lösning på en plan bit av Parafilm. Placera täck på Parafilm, med cellsidan (del av täck med celler) mot lösningen. Täck hela cell sida, med inga bubblor. Inkubera i 90 minuter vid rumstemperatur.
    3. Sug primära antikroppen lösning och kasta.
    4. Tvätta med 1 x PBS, för tre tvättningar, 5 min per tvätt.
    5. sekundär antikropp
      1. För avbildning direkt från plattan: Alikvot 200 pl av sekundär antikropp (1: 400 spädning i 10% getserum) lösning till varje brunn och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur, som täcker plattan med aluminium fo il.
      2. För täck: Alikvotera 50 il sekundär antikropp (1: 400 utspädning i 10% getserum) lösning på en plan bit av Parafilm. Placera täck på Parafilm, med cellsidan (del av täck med celler) mot lösningen. Täck hela cell sida, med inga bubblor. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur, som täcker Parafilm med aluminiumfolie.
    6. Sug sekundär antikropp lösning och kasta.
    7. Tvätta med 1 x PBS, för tre tvättningar, 5 min per tvätt. Alikvotera 1 ml 1x PBS i varje brunn.
    8. Montering
      1. För avbildning direkt från plattan: inte montera. Fortsätt till mikroskop.
      2. För avbildning av täck: Montera täck, i montering media, på en glasskiva. Torka över natten i en behållare täckt med aluminiumfolie. Fortsätt till mikroskop.
  4. Förvärva bilder med en Confocal laserscanning mikroskop med en 40X / 1,30 olja mål.
e "> 3. Western blotting av hudcell kulturer

  1. Tvätta cellskikt två gånger med 1 x PBS.
  2. Alikvotera 100 pl lysbuffert (se Materials List) i varje brunn (6-brunnar format). Skrapa cellskiktet med en cellskrapa och överföring lösningen i ett mikrocentrifugrör.
  3. Centrifugera lösningen vid 15.330 xg under 30 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett annat mikrocentrifugrör och kasta pelleten.
  4. Blanda 13 pl av varje prov med 5 pl provbuffert och 2 pl reduktionsmedel (se Materials List). Värme prover vid 95 ° C under 10 minuter.
  5. Centrifugera proverna vid 15.330 xg i 1 min för att samla kondens vatten. Belastnings prov till en pre-cast PAGE-gel och kördes vid 100 V i ungefär en timme.
  6. Att överföra separerade proteinerna till ett nitrocellulosamembran, smörgås gelén och membranet mellan bitar av papper och svampar (av samma storlek). Se till att det inte finns några bubblor mellan gel, membran, papper och svamps. Stäng smörgåskassetten och kör överföring vid 70 V under två timmar.
  7. För att kontrollera om överföringen var fullständig, inkubera membranet med 10 ml Ponceau S. Tvätt membran med 0,1% PBS-Tween-20, tre gånger, 10 min per tvätt.
  8. Blockera med 10 ml 5% mjölk under 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta membranet med 0,1% PBS-Tween-20, tre gånger, 10 minuter per tvätt.
  9. Inkubera med 10 ml primär antikropp under 90 min (mus-anti-kollagen VII, LH 7,2, 1: 1000 spädning i 5% mjölk). Tvätta membranet med 0,1% PBS-Tween-20, tre gånger, 10 minuter per tvätt.
  10. Inkubera med 10 ml sekundär antikropp under 30 min (get-anti-mus-HRP, 1: 2000 spädning i 5% mjölk). Tvätta membranet med 0,1% PBS-Tween-20, tre gånger, 10 minuter per tvätt.
  11. Över membran till en kassett och tillsätt 1 ml ECL Detection Reagent. Placera en klar, tunn plastfolie över membranet.
  12. För att detektera kemiluminiscens, placera en ljuskänslig film över plastarket och stäng kassetten. efter 2-5 Min, ta bort filmen från kassetten och placera den i en utvecklare.

4. Ringa och använda en cell-derived matris

  1. Seed 50000 celler (primära fibroblaster eller primära keratinocyter eller samodling av primära fibroblaster och keratinocyter) per brunn av en 24-brunnar.
  2. Tillåta cellerna att vidhäfta över natt, i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2.
  3. Kasta gamla medier och ersätt med färskt medium innehållande makromolekylära Crowders och 100 ^ M askorbinsyra. Den Crowder cocktail består av 37,5 mg / ml Ficoll 70 och 25 mg / ml Ficoll 400. Fibroblast media (FM) består av DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% pen-strep. Keratinocyter odlas i ett serumfritt medium, KSFM eller CnT-57. Upprätthålla samodlingar i en blandning av 50% FM och 50% KSFM eller CnT-57.
  4. Inkubera kulturer i 6 dagar i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2, föränderliga medie var 2 dagar.
  5. Decellularize cellskikt för att erhålla en cellhärledda MATRIx (f-mat = fibroblast-härledd matris, k-mat = keratinocythärledda matris, co-mat = matris som härrör från en samodling av fibroblaster och keratinocyter).
    1. Tvätta cellskikt två gånger i 1 x PBS.
    2. Lägg 250 pl 0,5% natriumdeoxikolat. Inkubera, på is, under 10 min. Aspirera cellysat.
    3. Upprepa steg 4.5.2 tre gånger.
    4. Tvätta cell-derived matris två gånger i destillerat H2O Hålla cellhärledda matris i 1 x PBS. Matriserna kan förvaras i upp till en vecka vid 4 ° C.
  6. Förbered sekundär cell Suspension (Till exempel, sådd keratinocyter på toppen av f-matta).
    1. Aspirera 1x PBS.
    2. Seed 50.000 keratinocyter ovanpå cell härledda matrisen (f-matta). Tillåta cellerna att vidhäfta över natt, i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2.
      Notera: Analyser kan utföras direkt på de vidhäftande cellerna.

5. Karakterisering av cell-härledd Matrix

  1. Fluorescerande immunfärgning: Se protokoll 2.
  2. Interferens Reflektion Mikroskopi
    1. Fröceller om att täckglas av glas, följande protokoll 4,1-4,5.
    2. Efter att ha fått cell härledda matris, fixa prov efter protokoll 2,2.
      Obs: Antibody färgning är valfritt. Om så krävs, se till protokoll 2,3.
    3. Utför bildtagning med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop med en 40X / 1,30 olja mål. Ställ hål på 74 mm.
    4. Använd LP 505 för störningar re fl ektion mikroskop (IRM) kanal och BP 575-615 IR för fl uorescence röda kanalen för filter. Använd NT 80/20 för IRM kanal och HFT 405/488/561, NFT 565, plåt för fl uorescence röda kanalen för stråldelare. Använd följande lasrar: DPSS 561-10 (våglängd 561 nm) vid 1,1% effekt för fl uorescence röda kanalen och HeNe633 (våglängd 633 nm) på 5,0% effekt för IRM-kanalen.

6. 3D Organotypic Skin Co-kultur

  1. Kasta en kollagengel, med Fibroblaster Encapsulated, i en cell-odlingsinsatsen (6-brunnar format).
    1. Alikvotera 10 ml råttsvanskollagen typ I till en kall bägare.
    2. Tillsätt 1 ml kall DMEM. Tillsätt 0,5 ml av 1 M NaOH för att neutralisera den sura kollagen. Tillsätt 0,5 ml av fibroblast suspension (innehållande 1.200.000 fibroblaster).
    3. Överför lösningen, i ett kallt pipett, till cellodlingsinsatser inom en 6-brunnsplatta. 12 ml av den totala lösningen jämnt uppdelade i 6 cellkulturinsatser.
    4. Inkubera gelén i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2, under 1 timme.
    5. Efter det att gelén har stelnat, dränka gelén i FM. Efter 24 timmar, kasta gamla medier och ersätta med nytt medium, innehållande makromolekylära Crowders. Lägga till en volym av 2 ml till det inre av cellodlingsinsatsen och 2 ml till utsidan av cellen-odlingsinsatsen.
  2. Efter 24 timmar,Seed Keratinocyter ovanpå kollagengelen.
    1. Trypsinize keratinocyter med användning av 0,125% trypsin / kelatbildare under 5 minuter vid 37 ° C. Knacka sidor av kolven försiktigt för att lösgöra celler och neutralisera trypsin med serum innehållande media. Räkna celler och förbereda keratinocyt fjädring (300.000 keratinocyter per gel och suspenderades i 200 pl media).
    2. Aspirera gamla medier från cellkulturinsats. Lägg keratinocyter ovanpå gelén.
    3. Inkubera gelén i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2, under 1 timme.
    4. Efter keratinocyter har fäst till gelytan, översvämmas gelén med 2 ml KSFM eller CnT-57 till insidan av den cellodlingsinsatsen och 2 ml FM till utsidan av cellen-odlingsinsatsen.
  3. Efter 24 timmar, kasta gamla medier och ersätta med nytt medium, innehållande makromolekylära Crowders.
  4. Efter 7 dagars submers kultur, höja kulturen till en luft-vätskegränsytan.
    1. Överför cellkultur insERT till en djup-brunnar. Tillsätt 10 ml stratifieringsmedium till utsidan av cellen-odlingsinsatsen. Hålla det inre av cellodlingsinsats torr.
  5. Inkubera kulturer i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och ändra media var 3 dagar, för de närmaste 14 dagarna.
    Obs: Efter 2 veckor vid luft-vätske-gränssnitt, är huden motsvarande mogna och kan skördas (antingen snap frysta eller formalinfixerade).

7. Skörd och karakterisering av Organotypiska hudekvivalenter

  1. Aspirera stratifieringsmedium.
  2. Med hjälp av pincett, överföra kulturen sätter på en pappershandduk och badda bort återstående material från botten av insatsen.
  3. Med användning av en skalpell, skär längs den inre omkretsen av odlingsinsatsen.
  4. Fäst organotypic hud co-kultur (tillsammans med PET-membran).
    1. snap Freeze
      1. Överför gelén konstruktet till en cryomold. Täcka det inre av cryomold med oktoberförening. Placera cryomold in i flytande kväve under 10 sek.
      2. Med hjälp av pincett, ta bort den frusna cryomold från det flytande kvävet, linda in i aluminiumfolie och förvara de frysta proverna i en -80 ° C frys.
      3. Avsnitt frysta prover med en kryostat, med en snittjocklek av 7 pm.
    2. formalin Fixering
      1. Placera en "biopsi svamp pad" i "biopsi kassetten. Överför gelen konstruera på svamp pad. Placera en annan svamp pad försiktigt ovanpå gelén konstruktionen. Stänga kassett.
      2. Fullständigt dränka kassetten i 10% neutral buffrad formalin under 48 h, vid rumstemperatur. Ta ur kassetten och kasta formalin avfall.
      3. Bädda fast provet i en vaxblock genom att först dehydratisering med en etanolserie och sedan gradvis infiltrera provet med vax. Avsnittet vax block med en mikrotom.
  5. Karakterisering av Skin Equivalent
    1. Immunfärgning
      1. För frysta snitt:
        1. Inkubera sektioner i 10% getserum (utspätt i 1 x PBS) under 1 h vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt i 1x PBS för att avlägsna den getserum.
        2. Inkubera sektioner med primär antikropp (1: 100 spädning i 10% getserum) under 90 min vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt i 1x PBS tre gånger, 5 min per tvätt.
        3. Inkubera sektioner med sekundär antikropp (1: 400 spädning i 10% getserum) under 30 min vid rumstemperatur, i en behållare täckt med aluminiumfolie. Tvätta avsnitt i 1x PBS tre gånger, 5 min per tvätt.
        4. Mount glider, med montering media, på en coverglass. Täck prover med aluminiumfolie och låt torka över natten.
        5. Bild med en konfokalmikroskop med en 40x / 1,30 olja mål.
      2. För formalinfixerade paraffininbäddade Sektioner:
        1. Avvaxa sektioner (och rehydrera) i fallande procentsatser av etanol till vatten (Xylen - 100% etanol- 90% etanol - 80% etanol - 70% etanol - vatten). Helt dränka prover lösningar. Varje awaxning steg bör vara 3 min.
        2. Inkubera sektioner i en% väteperoxid under 30 minuter. Tvätta sektioner i 1x PBS i 5 min.
        3. Inkubera avsnitt i citratlösning (10 ml citratlösning löses i 90 ml vatten) vid 120 ° C under 20 min. Låt objektglasen svalna över natten, vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt i 1x PBS tre gånger, 5 min per tvätt.
        4. Inkubera sektioner i 10% getserum (utspätt i 1 x PBS) under 1 h vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt i 1x PBS för att avlägsna den getserum.
        5. Inkubera sektioner med primär antikropp (1: 100 spädning i 10% getserum) under 90 min vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt i 1x PBS tre gånger, 10 min per tvätt.
        6. Inkubera sektioner med HRP-märkt polymer (outspätt) under 30 minuter, vid rumstemperatur. Tvätta sektioner med 1x PBS tre gånger, 10 min per tvätt.
        7. Till ett mikrocentrifugrör, kombinera 1 mlDAB Substrate (3,3'-diaminobensidin) med en droppe av kromogen. Inkubera avsnitt med denna lösning under 15 sekunder - 5 minuter (brun färg = positiv signal).
        8. För att stoppa reaktionen, tvätta avsnitt i rinnande vatten.
        9. Motfärga kärnor med hematoxylin, under 5 min. Skölj avsnitt i rinnande vatten.
        10. Inkubera sektioner i sur alkohollösning, under 1 minut. Skölj avsnitt i rinnande vatten.
        11. Inkubera avsnitt i Scotts kranvatten lösningen, under 2 minuter. Skölj avsnitt i rinnande vatten.
        12. Valfritt: Inkubera avsnitt i eosin under 1 minut och tvätta i rinnande vatten.
        13. Torka sektioner i stigande procentsatser av etanol till xylen (70% etanol - 80% etanol - 90% etanol - 100% etanol - xylen). Säkerställa att proven är helt under vatten i tre minuter per steg.
        14. Mount glider med hjälp av monterings media, till en coverglass. Lufttorka över natten.
        15. Bild med en konfokalmikroskop med en 40x / 1,30 olja mål.
    2. Transmissionselektronmikroskopi (För att visualisera Förankring Fibriller)
      1. Fix prover i 2,5% glutaraldehyd under 72 timmar.
      2. Tvätta prover i 1x PBS, tre gånger, 10 min per tvätt.
      3. Skär i små bitar (1 mm 3). Post-fix prov i 1% osmiumtetroxid, pH 7,4, under 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta prover i destillerat vatten.
        Varning: Osmiumtetroxid är giftig och giftig och bör hanteras varsamt i ett dragskåp.
      4. Dehydrera prover genom en stigande etanolserie (25% etanol - 50% etanol - 75% etanol - 95% etanol - 100% etanol - aceton) under 20 min per steg.
      5. Infiltrera genom blötläggning prover i 100% aceton: Araldite harts (1: 1) under 30 min vid rumstemperatur och sedan vid 1: 3 i 1 h, följt av 1: 6 över natten. Blötlägg prov i färskt Araldite harts under 2 h vid rumstemperatur, följt av en andra ändring av färskt Araldite harts under 1 h vid 40 ° C. Låt tredje färsk enraldite harts förändring för en timme vid 45 ° C och lämnar den fjärde färskt Araldite harts förändring för en timme vid 50 ° C.
      6. Inkubera proverna vid 60 ° C under 24 timmar för att tillåta polymerisation.
      7. Sektions prover med användning av en glaskniv, för att erhålla semi-tunna sektioner med en tjocklek av 1 | im. Fläck avsnitt med metylenblått för att observera histologi. § provet för att få ultratunna sektioner av 70 nm och samla varje avsnitt på en koppargaller.
      8. Stain sektioner med 5% uranylacetat lösningen under 15 min följt av 3% bly citratlösning under 10 min.
      9. Förvärva bilder med ett transmissionselektronmikroskop (100 kV), vid en förstoring av 30,000X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Makromolekylär utträngning kunde förbättra ECM-inlagring, i synnerhet, fibroblaster deponeras mer kollagen I, IV och fibronektin jämfört med kontrollkulturer (Figur 1, Cell skikt; 1A, kollagen I, 1B, kollagen IV, 1C, fibronektin). Vid decellularisering, var det uppenbart att fibroblaster var huvud insättare av kollagen I, IV och fibronektin jämfört med keratinocyter (figur 1, Matrix).

I figur 2, konstaterades att fibroblaster snarare än keratinocyter var de största producenterna av kollagen VII. Detta är den första rapporten av kollagen VII deponeras framgångsrikt in vitro (Benny et al, 2015).

Cell härrörande matris präglades genom immunofluorescens med användning av specifika Antibodtalet. Även om detta är en klassisk metod, var det viktigt att visualisera ECM i sin helhet och till fullo uppskatta effekten av makromolekylära Crowders. Använda interferensreflektionsmikroskop (IRM), var den fulla omfattningen av matrisen fångas (Figur 3). En överlagring av antikroppar färgning med IRM bilden visar den relativa mängden av den ECM komponent i förhållande till den totala mängden ECM.

I en 3D in vitro hud modell, MMC kondenseodlingstiden från 5 veckor till 3 veckor för att erhålla en mogen organotypic hud co-kultur (Figur 4). En hematoxylin och eosin-färgning visade att vid 3 veckor, kulturen med makromolekylära Crowders bestod av en fler stratifierades epidermis och stromala rika dermis, jämfört med uncrowded kontrollkulturer som saknade en helt differentierade epidermis. Dessutom var intensiv och kontinuerlig kollagen VII immunfärgning detekteras vid Dermal-epidermala förbindelsen av trånga cellkulturer, jämfört med en svag och prickig kollagen VII immunfärgning i kontrollkulturer. Transmissionselektronmikroskop (figur 5) visade närvaron av förankrings fibriller i organotypic kulturer, visar funktionell kollagen VII.

Figur 1
Figur 1: Blandat makromolekylära trängsel (MMMC) förbättrar avsättningen av huden-epidermal junction komponenter in vitro (A) Collagen I avsättning förstärks av MMMC (cellskiktet och matrisen) i endast fi broblasts.. Trängsel av samodlingar producerar mest kollagen I och visar att keratinocyterna stimulerade kollagen I produktionen av fi broblasts. (B) Kollagen IV avsättning av fi broblasts förstärks av trängsel. Detta ses ännu tydligare i trånga samkulturer. Notera keratinocytes färgade för kollagen IV visar mestadels cellassocierade eller intracellulär kollagen IV, men inte en pericellulär matris. I co-kulturer, båda celltyperna segregera med kollagen IV övervägande associerade med fi broblasts sparande keratinocytceller öar. (C) fibronektin avsättning sågs endast med fi broblasts, och däri starkt förbättras genom trängsel (cellskiktet och matrisen). I co-kulturer, var en retikulär nät av fi bronectin samband med endast fi broblasts och skonar öar av keratinocyter. Skalstrecken = 20 | im. Denna siffra har ändrats från Benny et al., 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Blandat makromolekylära trängsel (MMMC) underlättar avsättningen avförankrings fi bril byggnad kollagen VII. (A) En retikulära depositionsmönster av kollagen VII nedfall är uppenbar med fi broblasts endast under MMMC. I co-kulturer, är extracellulärt kollagen VII starkt förknippad med fi broblast kolonier mellan keratinocytceller öar. Keratinocyter visar pericellulär och intracellulär kollagen VII starkare uttryck i närvaro av MMMC. Efter cellys, är kollagen VII fotspår sett i en fi ne granulära skiktet i MMMC-behandlade fi broblast kulturer, men en urskiljbar fi brillar nedfall hämtas från co-kulturer. (B) Immunoblot analys av lyserade cellager visar att både trångt fi broblasts och keratinocytkulturer innehåller signi fi bart mer kollagen VII jämfört med uncrowded kontroller. Den hämtade kollagen VII är huvudsakligen pericellulära härrör. (C) Densitometrisk analys av B visar att MMMC ökar mängden cell associerad kollagen VII med en faktor 8 i fi broblasts och en faktor av 2 i keratinocyter. Skalstrecken = 20 | im. Denna siffra har ändrats från Benny et al., 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Fibroblast fotspår innehåller mer total ECM som visualiseras genom störningar re fl ektion mikroskop (IRM) Vid analys av enskilda ECM-komponenter (kollagen IV och fi bronectin), kultur under MMMC förbättrade extracellulära nedfallet.. Att visualisera totala ECM deponerade var IRM användes för att kvantifiera alla ECM som antikroppar färgning hade sina begränsningar. IRM visade tydligt den totala matris kvantitet och mönster enligt MMMC jämfört med kontrollbetingelser. Skalstreck = 20 | im. Denna siffra har varitmodifierad från Benny et al., 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4:. Blandad makromolekylärt utträngning (MMMC) under den nedsänkta fasen förbättrar mognaden av den dermala-epidermala förbindelsen (DEJ) i hudekvivalenter fibroblastliknande innehållande kollagengeler ympades med keratinocyter på toppen och hålls nedsänkt under 1 vecka, lyfts sedan till en luft-vätskegränsytan. I den klassiska protokollet, kollagen VII (grön) var frånvarande efter totalt 3 veckor i odling, men verkade i hudekvivalenter efter 5 veckor. I motsats, enligt MMMC, kollagen VII var redan starkt uppenbar efter 3 veckor och ännu starkare färgas efter 5 veckor jämfört med standard kulturer. Hematoxylin och eosin (20X förstoring) färgning cpå fi rmed som med denna snabba protokoll, Strati fi ering och mognad av huden motsvarande upprätthållas och accelereras. Skalstreck = 100 | j, m. Denna siffra har ändrats från Benny et al., 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Bevis på de novo bildning av förankrings fi brils i hudekvivalenter erhållits under MMMC Ultra studier av begynnande dermal-epidermal korsning av organotypic co-kulturer efter en tre veckor långa odlingsprotokoll med MMMC (A, B) föreslår strukturer besläktad med förankring fi brils (pilar) som är frånvarande i icke-överbefolkade hudekvivalenter (C) efter 3 veckors odling. Denna siffra har ändrats frOm Benny et al., 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Wako 013-12061 Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format) Greiner Bio-One 657610 Organotypic cultures
Citrate solution Dako S2369 DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail) Corning 354236 Organotypic cultures
CnT-57 CELLnTEC CnT-57 Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kit Dako K3468 Histology
Deep-well plate (6-well format) Corning 355467 Organotypic cultures
ECL detection reagent GE Healthcare Life Sciences RPN2106 Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM)  JEOL   JEM-1010 (100kV) Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM) High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70 GE Healthcare Life Sciences 17-0310-05 Macromolecular crowder
Ficoll PM400 GE Healthcare Life Sciences 17-0300-05 Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM) Life Technologies 17005-042 Cell culture media
Lysis buffer ThermoFisher Scientific 89900 Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. 
Microscope Zeiss LSM510 Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount) National Diagnostics HS-106 Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal) ThermoFisher Scientific 8310-16 Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek) Sakura 4583 Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibiotics Sigma Aldrich A5955 Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibody Abcam #ab6308
Anti-Collagen Type IV Novocastra #NCL-COLL-IV
Anti-collagen VII LH7.2 (in house) 
Anti-Fibronectin antibody Abcam #ab2413
Reducing agent  ThermoFisher Scientific NP0009 Western blot
Sample buffer ThermoFisher Scientific NP0008 Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma Aldrich #D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit ThermoFisher Scientific #A-11037 
AlexaFluor 594 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific  #A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit ThermoFisher Scientific #A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouse ThermoFisher Scientific #A-11001
Secondary antibodies (HRP) Dako Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse undiluted
Sodium deoxycholate Prodotti Chimicie Alimentari Decellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12    Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisone Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulin Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine   Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrin Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Trypsin Biopolis Shared Facilities 0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3  Used to trypsinize cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Tags

Bioteknik keratinocyter fibroblaster makromolekylära trängsel 2D cellodling 3D cellodling hud organotypic co-kulturer extracellulära matrisen typ kollagen I kollagen typ IV kollagen typ VII, dermo-epidermal korsning
Förbättra 2D och 3D Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Använda Macro Trängsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benny, P., Badowski, C., Lane, E.… More

Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding. J. Vis. Exp. (114), e53642, doi:10.3791/53642 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter