Summary
Мы представляем протокол для получения клеточных производных матрицы, богатые белками внеклеточного матрикса, используя высокомолекулярные crowders (MMC). Кроме того, мы приводим протокол, который включает MMC в 3D органотипического поколения кожи сокультуры, что сокращает время, сохраняя при этом культуру зрелости конструкции.
Abstract
Гликопротеина семейство коллагенов представляет основные структурные белки в организме человека, и являются ключевыми компонентами биоматериалов, используемых в современной тканевой инженерии. Технический узкое место является отложение коллагена в пробирке, как это известно , медленно, что приводит к неоптимальной образованию соединительной ткани и последующего сцепления тканей, особенно в моделях кожи. Здесь мы опишем метод, который включает в себя добавление дифференцированно размера сахарозы сополимеров в культурах кожи для создания макромолекулярных Crowding (MMC), что приводит к резкому повышению отложения коллагена. В частности, дермальные фибробласты на хранение значительное количество коллагена I / IV / VII и фибронектина при MMC, по сравнению с контрольной группой.
Протокол также описывает способ decellularize переполненном клеточных слоев, подвергая значительные количества внеклеточного матрикса (ЕСМ), которые были сохранены на поверхности культуры, о чем свидетельствует immunocytochemistry. Общая картина матрицы масс и распределение было изучено с использованием интерференции отражения микроскопии. Интересно, что фибробласты, кератиноциты и сокультурах полученные клеточные производные матрицы (МЧР) различного состава и морфологии. МЧР может быть использован как "био-строительные леса» для вторичного посева клеток, где текущее использование покрытий или строительных лесов, как правило, от ксеногенных животных источников, можно избежать, таким образом, переход к более клинически значимых приложений.
Кроме того, этот протокол описывает применение MMC при глубинном фазы 3D-Органотипической кожи модели совместного культивирования, который достаточен, чтобы усилить осаждение ЕСМ в кожно-эпидермального соединения (DEJ), в частности, коллаген VII, основным компонентом анкерных фибриллы. Электронная микроскопия подтвердила наличие анкерных фибриллы в культурах, разработанных с MMC, по сравнению с контрольной группой. Это имеет большое значение в качестве анкерных фибриллы привязывать дермы в эпидермис, следовательно,имеющий предварительно сформированный зрелый DEJ может льготники кожный трансплантат с точки зрения стабильности трансплантата и общего заживления раны. Кроме того, время культивирования конденсируют от 5 недель до 3-х недель, чтобы получить зрелую конструкцию, при использовании MMC, снижая затраты.
Introduction
Кожа образует защитный барьер, предотвращая потерю воды и поступление патогенных микроорганизмов. Она состоит из трех основных компонентов; стромальные богатые дермы 1, стратифицированной эпидермис 2,3,4 поверх него, а также кожно-эпидермального соединения между 5,6. Дерма состоит в основном из коллагена и эластичных волокон и является малонаселенной с фибробластами 7. В противоположность этому, клеточные богатые Эпидермис состоит из нескольких слоев кератиноцитов. В кератиноцитов самого внутреннего слоя являются пролиферативная и обеспечивают новые базальные клетки, которые обновляют и заменяют терминально дифференцирующие кератиноциты, которые постоянно перемещаются к наружному-самый слой кожи и потеряли их ядра и цитоплазматического материала, в результате чего в ороговевший слой, который подвергается шелушение.
Кожный-эпидермального соединения, определенный тип базальной мембраны, представляет собой сложную структуру, состоящую из взаимосвязанных молекул матрицы, которые tetheRs эпидермис в дерму. Волокна коллагена I дермы сплетаются с коллагеном VII анкерных фибриллы, которые прикреплены к коллагена IV богатых пластинкой Densa. Якорные нити (ламинин 5, коллаген XVII и интегрины), в свою очередь подключить пластинку Densa с гемидесмосома базальных кератиноцитов. Базальных кератиноцитов (базальный слой) обладают способностью к пролиферации и возобновить, а также дифференцируются и наслаиваются с образованием супрабазальном слоев; слой Spinosum, зернистого слоя, и , наконец , роговой слой, который представляет собой контактную поверхность кожи с окружающей средой. следовавшего из базального слоя рогового слоя, кератиноциты переключаться паттерны экспрессии цитокератины и , наконец , подвергаются апоптозу и упаковывают себя в роговой конверты, шелуха специфических белков, которые ковалентно поперечно-сшитыми с помощью трансглутаминазы активностью.
Воссоздание кожи и ее слоев в лабораторных условиях , в том числе сложных структур дермально-эпидермального соединения и кожная внеклеточный матрикс, и эмулировать процесс ороговения, уже давно заинтриговал ученых и биоинженеры как сложной задачей. Там были достигнуты значительные успехи в коже тканевой инженерии, например, успешное извлечение клеток кожи из биопсий пациентов и генерирование органотипических кожи культур с использованием клеток кожи пациента , полученных 8. Тем не менее, нерешенные проблемы остаются, относящиеся к плохой секреции белков внеклеточного матрикса клетками кожи себя и приводит к неоптимальной модели кожи. Кроме того, время, необходимое для создания 3D органотипической кожи совместно культуры, используя современные протоколы колеблется от четырех до восьми недель, а временные рамки, которые потенциально могут быть укороченный с включением макромолекулярных crowders. Сокращение времени культивирования снижает стоимость реагентов, снижает частоту клеточного старения и уменьшает время ожидания пациента должны продукт использоваться в клинике.
т "> Макромолекулярный скученности (MMC) , включает в себя введение специфических макромолекулы к культуральной среде для создания эффектов исключенного объема. Они влияют на ферментативные скорости реакции , включая протеолитического расщепления проколлагена , который запаздывает в стандартных условиях культивирования водных 9-13. Под ММС, ферментативные реакции которые ускорили без увеличения количества реагентов 14,15 в результате чего, в случае проколлагена расщепления, повышенное количество коллагена молекул I в перенаселенных культурах по сравнению с безлюдных управления 10. в качестве превращения проколлагена в коллаген обеспечивает образование коллагена узлы, фибробласты , культивированные с ММС в течение 48 часов получали значительно больше коллагена I по сравнению с безлюдных культур фибробластов мониторинг в течение четырех недель 11,16,17. Помимо воздействия на ферментативной активности , которые влияют на формирование, стабилизацию и ремоделирование ECM, MMC также было показано, что непосредственно усиливать и модулировать коллагенформирование волокна 18,19.Мы представляем здесь способ повышения производства внеклеточного матрикса (ЕСМ) клетками кожи, в частности, дермальные фибробласты и кератиноциты эпидермиса. Кроме того, мы покажем, что обогащенная ECM выпускается под MMC в однослойных культурах могут быть decellularized и использовать в качестве чистого клеток полученной матрицы (МЧР).
Мы используем нетрадиционный подход к визуализации и в полной мере оценить ЕСМ, осажденный клетками кожи, культивируемых с MMC. отражения интерференционной микроскопии обычно используется для изучения клетка-матрица взаимодействий или клетка-стекло точек контакта. Этот метод был использован в нашей системе, чтобы просмотреть общую сумму матрицы, нанесенной на поверхность стекла. отражение помех микроскопию в сочетании с флуоресцентным иммунным окрашиванием, чтобы получить наибольшее количество информации в терминах внеклеточной матрицы композиции и рисунка, в присутствии и в отсутствие MMC.
OrganotypiC кожи сокультурах является классическим методом для моделирования кожи в пробирке в трехмерном контексте. В то время как двумерные сокультурах может обеспечить существенную информацию, оно ограничено при переводе эти данные и применять его обратно в окружающую среду в естественных условиях, которая по своей природе является трехмерной структурой. кератиноциты кожи, в частности, являются поляризованными и содержат апикальные и базальные сегменты, которые имеют важное значение для гомеостаза и присоединения клеток. Кроме того, экспрессия типичных супрабазальных белков в кератиноцитах над базальным слоем, такие как кератин 1, кератин 10 и Filaggrin присутствует только в процессе стратификации и терминальной дифференцировки кератиноцитов. Как терминальная дифференцировка вряд ли присутствует в типичных культурах монослоя, супрабазальном экспрессии белка обычно не достигается в этой системе культуры. Поэтому органотипической культуры начинают погружена в культуральной среде, но затем поднимается до воздушно-жидкостной интерфейс к вождению keratinocytе дифференциация. Это приводит к экспрессии маркеров стратификации, даже ороговения и в целом лучше отразить эпидермального физиологии. В то время как другие группы ранее генерироваться Органотипической кожи сопутствующих культур успешно, создание функционального кожно-эпидермального соединения зоны была проблема. Здесь мы представляем новый метод культивирования Органотипической кожи сопутствующих культур с повышенной базальной мембраны, в конденсированной сроки и без ущерба для погашения этих конструкций. Это обеспечит миметики кожи для моделирования в лабораторных условиях , изучение биологии кожи и ассортимент скрининговых анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Макромолекулярные Давка в 2D культур клеток кожи
- Семенной 50000 клеток (первичные фибробласты или первичные кератиноциты или совместное культивирование первичных фибробластов и кератиноцитов) на лунку 24-луночного планшета. Семенной клеток в 1 мл соответствующего питательной среды, типа клеток.
- Разрешить клетки придерживаться в течение ночи в 37 ° C инкубаторе при 5% CO 2.
- Выбросьте старые средства массовой информации и заменить 1 мл свежей среды, содержащей высокомолекулярные crowders и 100 мкМ аскорбиновой кислоты. Используйте Crowder коктейль, состоящий из 37,5 мг / мл Ficoll 70 и 25 мг / мл Ficoll 400. Использование фибробласты носителя (FM), состоящую из DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина антибиотиков, дополненной. Grow кератиноцитов в не содержащей сыворотки среде, KSFM или CNT-57. Поддерживать совместное культивирование в смеси 50% FM и 50% сыворотки среды.
- Инкубируйте культур в течение 6 дней в инкубаторе C 37 ° в 5% CO 2, с изменением среды каждые 2 дня.
2. Люминесцентные Иммунологическое на клетки кожи культур
- Промыть культур клеток дважды 1x PBS.
- Фикс клеточные культуры либо с метанолом или параформальдегида (в зависимости от технических характеристик антител).
- Для Метанол Фиксации
- Аликвоты 500 мкл холодного метанола в каждую лунку и инкубировали при -20 ° С в течение 10 мин. Отберите фиксаж и выбросить метанол отходов. Воздух сухой в ламинарном вытяжном шкафу.
- Для ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ Фиксации
- Алиготе 500 мкл 2% -ного раствора параформальдегида в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин. Отберите фиксаж и выбросить параформальдегида отходов.
- Мытье с 1x PBS, в течение трех стирок, 5 мин на каждую промывку.
- Алиготе 1 мл 1x PBS в каждую лунку.
- Для Метанол Фиксации
- Флуоресцентные Иммунологическое с использованием антител
- Аликвоты в 500 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (разведенного в 1x PBS) в каждую лунку. Выдержите при комнатной температуре в течение 30 мин. Аспирируйте блокирующий раствор и выбросить.
- Первичные антитела
- Для получения изображения непосредственно из пластины: аликвоту 200 мкл первичного антитела (разведение 1: 100 в 10% козьей сыворотки) раствора в каждую лунку и инкубировать в течение 90 мин при комнатной температуре.
- Для покровных: аликвотами по 50 мкл первичного антитела (разведение 1: 100 в 10% козьей сыворотки, в) раствора на плоский кусок Parafilm. Поместите покровное на Parafilm, с сотовым стороне (часть покровного с клетками), обращенной раствора. Покройте всю клеточную сторону, без пузырьков. Инкубировать в течение 90 мин при комнатной температуре.
- Решение Аспирируйте первичное антитело и выбросьте.
- Мытье с 1x PBS, в течение трех стирок, 5 мин на каждую промывку.
- Вторичные антитела
- Для получения изображения непосредственно из пластины: Аликвоту 200 мкл вторичного антитела (разведение 1: 400 в 10% козьей сывороткой) раствора в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, накрывая планшету с алюминием Fo ил.
- Для покровных: аликвотами по 50 мкл вторичного антитела (разведение 1: 400 в 10% козьей сыворотки, в) раствора на плоский кусок Parafilm. Поместите покровное на Parafilm, с сотовым стороне (часть покровного с клетками), обращенной раствора. Покройте всю клеточную сторону, без пузырьков. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, покрытие парафином с алюминиевой фольгой.
- Решение Аспирируйте вторичное антитело и выбросьте.
- Мытье с 1x PBS, в течение трех стирок, 5 мин на каждую промывку. Алиготе 1 мл 1x PBS в каждую лунку.
- монтаж
- Для получения изображения непосредственно из пластины: не устанавливайте. Перейдите к микроскопом.
- Для визуализации покровных: Mount покровные, в монтаже средств массовой информации, на предметное стекло. Сухой ночь в контейнере, покрытой алюминиевой фольгой. Перейдите к микроскопом.
- Получение изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с 40X / 1.30 Oil Цель.
- Вымойте клеточные слои дважды с 1x PBS.
- Алиготе 100 мкл буфера для лизиса (см список материалов) в каждую лунку (6-луночного формата пластины). Выскоблите слой клеток с помощью скребка и клеточного переноса раствора в микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга решение при 15,330 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Передача супернатант в другую пробирку микроцентрифужных и отбросить осадок.
- Смешайте 13 мкл каждого образца с 5 мкл буфера для образцов и 2 мкл восстановителя (см список материалов). Образцы тепла при 95 ° С в течение 10 мин.
- Центрифуга образцов при 15,330 мкг в течение 1 мин для сбора конденсата. Загружают образцы в страницу геля Сборный и работать при 100 В в течение приблизительно 1 ч.
- Для передачи Разделенные белки на нитроцеллюлозную мембрану, сэндвич-гель и мембрану между кусками бумаги и губок (одного и того же размера). Убедитесь, что нет пузырей между гелем, мембраны, бумаги и губкиs. Закройте сандвич кассету и запустить передачу на 70 В для в 2 ч.
- Для того, чтобы проверить, если передача была завершена, инкубировать мембрану с 10 мл Понсо S. промывочного мембраны с 0,1% PBS-Tween-20, три раза, 10 мин на каждую промывку.
- Блок с 10 мл 5% -ного молока в течение 1 ч при комнатной температуре. Мытье мембрану с 0,1% PBS-Tween-20, в три раза, 10 мин на каждую промывку.
- Выдержите с 10 мл первичного антитела в течение 90 мин (мыши анти-коллаген VII, LH 7.2, 1: 1000 разведение в 5% молока). Мытье мембрану с 0,1% PBS-Tween-20, в три раза, 10 мин на каждую промывку.
- Инкубируют 10 мл вторичного антитела в течение 30 мин (козий анти-мыши-HRP, 1: 2000 разбавление в 5% молока). Мытье мембрану с 0,1% PBS-Tween-20, в три раза, 10 мин на каждую промывку.
- Перенесите мембрану на кассету и добавьте 1 мл ECL Detection реактивом. Поместите прозрачный, тонкий пластиковый лист над мембраной.
- Для обнаружения хемилюминесценции, поместить светочувствительный пленку поверх пластикового листа и закройте кассету. После того, как 2-5 Мин, удалите пленку из кассеты и поместить его в качестве разработчика.
4. Создание и использование сотового происхождения Matrix
- Семенной 50000 клеток (первичные фибробласты или первичные кератиноциты или совместное культивирование первичных фибробластов и кератиноцитов) на лунку 24-луночного планшета.
- Разрешить клетки придерживаться в течение ночи в 37 ° C инкубаторе при 5% CO 2.
- Выбросьте старые средства массовой информации и заменить свежей средой, содержащей высокомолекулярные crowders и 100 мкМ аскорбиновой кислоты. Crowder коктейль состоит из 37,5 мг / мл Ficoll 70 и 25 мг / мл Ficoll 400. фибробластов медиа (FM), состоит из DMEM, дополненной 10% FBS и 1% перо-стрептококк. Кератиноцитов выращивают в бессывороточной СМИ, KSFM или CNT-57. Поддерживать совместное культивирование в смеси 50% FM и 50% KSFM или CNT-57.
- Инкубируйте культур в течение 6 дней в инкубаторе C 37 ° при 5% СО 2, изменение средств массовой информации каждые 2 дня.
- Decellularize клеточных слоев для получения клеток, полученных Матрих (е-мат = фибробласты полученный матрица, K-мат = кератиноцитов , полученных матрица, со-мат = матрица получена из совместной культуры фибробластов и кератиноцитов).
- Вымойте клеточные слои дважды в 1x PBS.
- Добавить 250 мкл 0,5% деоксихолатом натрия. Выдержите, на льду, в течение 10 мин. Отберите лизат клеток.
- Повторите шаг 4.5.2 трижды.
- Вымойте клеток , полученных матрицу дважды в дистиллированной H 2 O. Держите клеток, полученных в матрицу 1x PBS. Матрицы могут быть сохранены в течение 1 недели при температуре 4 ° С.
- Подготовка вторичной клеточной суспензии (например, Посев Кератиноциты на вершине ф-мата).
- Отберите 1x PBS.
- Семенной 50000 кератиноцитов поверх клеток , полученных матрице (F-мат). Разрешить клетки придерживаться в течение ночи в 37 ° C инкубаторе при 5% CO 2.
Примечание: Анализы могут быть выполнены непосредственно на прилипшие клетки.
5. Характеристика сотовомМатрица получена
- Флуоресцентные иммунное: Обратитесь к Протоколу 2.
- Помехи Отражение Микроскопия
- Семенной клетки на стеклянных покровных, в соответствии с протоколом 4.1-4.5.
- После получения клеток, полученных матрицу, фиксируют образцы в соответствии с протоколом 2.2.
Примечание: Антитело окрашивание не является обязательным. При необходимости обратитесь к протоколу 2.3. - Выполните получение изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с целью масл 40X / 1.30. Установите крошечное отверстие на 74 мм.
- Используйте LP 505 для интерференционной рефлексия микроскопии (IRM) канала и BP 575-615 ИК для флуоресценции красного канала для фильтров. Использование NT 80/20 для канала IRM и HFT 405/488/561, NFT 565, пластина для флуоресценции красного канала для светоделителях. Используйте следующие лазеры: DPSS 561-10 (длина волны 561 нм) на 1,1% мощности для флуоресценции красного канала и HeNe633 (длина волны 633 нм) на 5,0% мощности для канала IRM.
6. 3D Органотипической кожи Co-культуры
- Литые коллагеновый гель, с фибробластами инкапсулированные, в клеточной культуре Вставка (6-луночный планшет).
- Алиготе 10 мл крысы хвост коллагена типа I в холодный стакан.
- Добавляют 1 мл холодной DMEM. Добавить 0,5 мл 1 М NaOH для нейтрализации кислотного коллагена. Добавить 0,5 мл суспензии фибробластов (содержащей 1200000 фибробласты).
- Переносят раствор в холодном пипетку, к вставкам клеточных культур в течение 6-луночный планшет. 12 мл общего раствора равномерно разделены на 6 клеточных культур вставок.
- Инкубируйте геля в инкубаторе C 37 ° при 5% СО 2, в течение 1 часа.
- После того, как гель затвердеет, погрузить гель в FM. Через 24 часа, выбросьте старые средства массовой информации и заменить свежей средой, содержащие высокомолекулярные crowders. Добавить объем 2 мл во внутреннюю часть вставки культивирования клеток и 2 мл на наружной стороне вставки клеточной культуры.
- Через 24 часа,Семенной Кератиноциты на вершине коллагеновый гель.
- Trypsinize кератиноцитов с использованием 0,125% трипсина / хелатирующего агента в течение 5 мин при 37 ° С. Нажмите стороны колбы осторожно, чтобы вытеснять клетки и нейтрализовать трипсина с сывороточным средах. Граф клеток и подготовить кератиноцитов суспензии (300000 кератиноциты за гель и суспендировали в 200 мкл среды).
- Отберите старые медиа из клеточной культуры вставки. Добавить кератиноцитов поверх геля.
- Инкубируйте геля в инкубаторе C 37 ° при 5% СО 2, в течение 1 часа.
- После того, как кератиноциты присоединили к поверхности геля, погрузить гель с 2 мл KSFM или CNT-57 к внутренней поверхности вставки культивирования клеток и 2 мл FM к наружной стороне вставки клеточной культуры.
- Через 24 часа, выбросьте старые средства массовой информации и заменить свежей средой, содержащие высокомолекулярные crowders.
- Через 7 дней погруженной культуре, поднять культуру на воздухе жидкость.
- Передача плюсами клеточной культурыERT к глубокому-луночного планшета. Добавьте 10 мл послойного средства массовой информации к наружной стороне вставки клеточной культуры. Держите внутреннюю часть клеточной культуры вставки сухой.
- Инкубируйте культур в инкубаторе C 37 ° при 5% CO 2 и изменение среды каждые 3 дня, в течение следующих 14 дней.
Примечание: Через 2 недели на границе раздела воздух-жидкость, эквивалентная кожа является зрелым и могут быть собраны (либо быстро замораживают или фиксированных формалином).
7. Сбор урожая и характеристика Органотипической Эквиваленты кожи
- Отберите стратификации СМИ.
- С помощью пинцета, передачи культуры вставляет на бумажное полотенце и промокните прочь оставшиеся средства массовой информации от основания вставки.
- Используя скальпель, разрезанной вдоль внутренней окружности вставки культуры.
- Закрепить органотипической кожи совместное культивирование (вместе с мембраной ПЭТ).
- мгновенного замораживания
- Перенести конструкцию геля в cryomold. Накройте интерьер cryomold с ОКТсоединение. Поместите cryomold в жидкий азот в течение 10 сек.
- С помощью пинцета удалите замерзший cryomold из жидкого азота, завернуть в алюминиевую фольгу и хранить замороженные образцы в C морозильнике -80 °.
- Раздел замороженные образцы с криостата, с толщиной секции 7 мкм.
- Формалин Фиксирование
- Поместите 'биопсии губка площадку' в '' биопсии кассеты. Перенесите гель построить на губку площадку. Поместите другой губки подушку аккуратно поверх конструкции геля. Закройте кассету.
- Полностью погрузить кассету в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 ч, при комнатной температуре. Извлеките кассету и выбросить формалина отходов.
- Встраивание установленного образца в восковой блок сначала дегидратацией с серии этанола, а затем постепенно пропитывая образец с воском. Раздел воск блок с микротома.
- мгновенного замораживания
- Характеристика эквивалента кожи
- Иммунологическое
- Для замороженных секций:
- Инкубируйте секций в 10% сыворотки козьего (разведенного в 1x PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Стирать в секции 1x PBS для удаления сыворотки козы.
- Инкубировать срезы с первичным антителом (разведение 1: 100 в 10% козьей сывороткой) в течение 90 мин при комнатной температуре. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 5 мин на промывку.
- Инкубировать срезы с вторичным антителом (разведение 1: 400 в 10% козьей сывороткой) в течение 30 мин при комнатной температуре, в контейнере, покрытой алюминиевой фольгой. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 5 мин на промывку.
- Маунт-сползает, с монтажными СМИ, на более покровного стекла. Образцы крышка с алюминиевой фольгой и дать высохнуть в течение ночи.
- Изображение с помощью конфокальной микроскопии с целью масл 40X / 1.30.
- Для фиксированных формалином и залитых парафином:
- разделы депарафинизации (и регидратации) в нисходящем процент этанола в воде (Ксилол - 100% этанол- 90% этанол - 80% этанол - 70% этанол - вода). Полностью погрузить образцы в растворах. Каждый шаг должен быть депарафинизации 3 мин.
- Инкубируйте разделы в 1% перекиси водорода в течение 30 мин. Промыть секции в 1х PBS в течение 5 мин.
- Инкубируйте разделы в растворе цитрата (10 мл раствор цитрата растворяют в 90 мл воды) при 120 ° С в течение 20 мин. Разрешить слайды остыть в течение ночи при комнатной температуре. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 5 мин на промывку.
- Инкубируйте секций в 10% сыворотки козьего (разведенного в 1x PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Стирать в секции 1x PBS для удаления сыворотки козы.
- Инкубировать срезы с первичным антителом (разведение 1: 100 в 10% козьей сывороткой) в течение 90 мин при комнатной температуре. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 10 мин на промывку.
- Инкубировать срезы с HRP-меченым полимером (в неразбавленном виде) в течение 30 мин при комнатной температуре. Вымойте секций с 1x PBS, три раза, 10 мин на промывку.
- Для микроцентрифужных трубки, смешайте 1 млДАБ Субстрат (3,3'-диаминобензидин) с 1 каплей хромогена. Инкубируйте разделы с этим раствором в течение 15 сек - 5 мин (коричневый цвет = положительный сигнал).
- Для того, чтобы остановить реакцию, мыть секций в проточной воде.
- Проводят контрастное ядер гематоксилином, в течение 5 мин. Промыть участки в проточной воде.
- Инкубировать срезы в кислотном растворе спирта, в течение 1 мин. Промыть участки в проточной воде.
- Инкубировать срезы в растворе водопроводной воды Скотта, в течение 2 мин. Промыть участки в проточной воде.
- Дополнительно: Инкубируйте разделы в эозином в течение 1 мин и промойте в проточной воде.
- Дегидрировать секции в восходящих процентах этанола ксилола (70% этанола - 80% этанола - 90% этанол - 100% этанол - ксилол). Убедитесь, что образцы полностью погружена в течение 3 мин на ступень.
- Mount сползает, используя крепежные средства массовой информации, к покровного стекла. Воздух сухой в течение ночи.
- Изображение с помощью конфокальной микроскопии с целью масл 40X / 1.30.
- Для замороженных секций:
- Просвечивающей электронной микроскопии (для визуализации анкеровки фибрилл)
- Фикс образцы в 2,5% глутаральдегида в течение 72 ч.
- Образцы Стирать в 1x PBS, три раза, 10 мин на промывку.
- Нарезать на мелкие кусочки (1 мм 3). Образцы после починки в 1% осмия, рН 7,4, в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы Стирать в дистиллированной воде.
Внимание: осмий Четырехокись ядовит и токсичен и следует обращаться осторожно в вытяжном шкафу. - Высушить образцов через серии восходящий этанол (25% этанол - 50% этанол - 75% этанол - 95% этанол - 100% этанол - ацетон) в течение 20 мин на шаг.
- Инфильтрат путем вымачивания образцов в 100% ацетона: Araldite смолы (1: 1) в течение 30 мин при комнатной температуре и затем в соотношении 1: 3 в течение 1 ч, а затем 1: 6 в течение ночи. Замачивание образец в свежей Araldite смолы в течение 2 ч при комнатной температуре, с последующей второй сменой свежей Araldite смолы в течение 1 часа при 40 ° C. Оставьте третий свежеraldite изменение смолы в течение 1 ч при 45 ° С и оставляют четвертый свежие изменения Araldite смолы в течение 1 часа при 50 ° С.
- Инкубируйте образцы при температуре 60 ° С в течение 24 ч, чтобы обеспечить полимеризацию.
- Образцы раздел с использованием стеклянного ножа, чтобы получить полу-шлифы толщиной 1 мкм. Пятно секция с метиленовым синим, чтобы наблюдать за гистологию. Раздел образец, чтобы получить ультратонкие срезы 70 нм и собирают каждую секцию на медную сетку.
- Пятно секции с 5% -ным раствором уранилацетате в течение 15 мин, а затем 3% -ным раствором цитратом свинца в течение 10 мин.
- Серии изображений с помощью просвечивающего электронного микроскопа (100 кВ) при увеличении 30,000X.
- Иммунологическое
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Макромолекулярный сгущение удалось усилить осаждение ЕСМ, в частности, фибробласты осаждается больше коллагена I, IV и фибронектина по сравнению с контрольными культурами (рисунок 1, клеточный слой; 1A, коллаген I, 1B, коллаген IV; 1C, фибронектин). После decellularization, было очевидно , что фибробласты были основными вкладчиками коллагена I, IV и фибронектина по сравнению с кератиноцитов (рисунок 1, Matrix).
На рисунке 2, было отмечено , что фибробласты , а не кератиноциты были основными производителями коллагена VII. Это первый доклад коллагена VII успешно депонированы в пробирке (Benny и др, 2015).
Клетка-матрица получена характеризовалась через иммунофлуоресценции с использованием специфических antibodх годов. В то время как это классический подход, важно визуализировать ECM во всей его полноте и в полной мере оценить эффект макромолекулярных crowders. Использование интерференция отражения микроскопии (IRM), в полной мере матрицы был взят в плен (рисунок 3). Накладку с использованием меченых антител с IRM изображением показывает относительное количество этого ЕСМ компонента по отношению к общему количеству ECM.
В 3D пробирке модель кожи в ГМК конденсируется времени культивирования от 5 недель до 3 -х недель , чтобы получить зрелые органотипической кожи совместного культивирования (рисунок 4). Гематоксилином и эозином показал, что через 3 недели, культура с макромолекулярных crowders состояла из pluri стратифицированной эпидермиса и дермы стромальных богатых, по сравнению с безлюдных культурами, которые не хватало полностью дифференцированным эпидермисом. Кроме того, интенсивное и непрерывное коллаген VII иммунное был обнаружен в дермел-эпидермального соединения людных культур клеток, по сравнению с слабой и неравномерной коллаген VII иммунное окрашивание в контрольных культурах. Просвечивающей электронной микроскопии (рис 5) показал наличие анкерных фибрилл в органотипических культурах, показывая функциональный коллаген VII.
Рисунок 1: Смешанный макромолекулярная скученности (mMMC) усиливает депонирование дермально-эпидермального компонентов перехода в пробирке (А) отложение коллагена I усиливается mMMC (клеточного слоя и матрицы) в только фи фибробластов.. Давка сопутствующих культур производят самый коллагена I и показывают, что кератиноциты стимулируется производство коллагена I Ф.И. фибробластов. (B) Коллаген IV осаждение Ф.И. фибробластов усиливается скученности. Это видно еще более отчетливо в многолюдных совместных культурах. Следует отметить, что keratinocytэс окрашивали коллагена IV показывают, в основном связанную с клетками или внутриклеточного коллагена IV, но не околоклеточном матрицы. В совместных культурах, оба типа клеток разделения с коллагеном IV будучи преимущественно связанные с фи щадящих кератиноцитов фибробластов островов. Осаждения (C) фибронектина был замечен только с фи фибробластов, и в нем сильно повышается за счет скученности (клеточный слой и матрицы). В совместных культурах, сетчатой сетки фи bronectin была связана только с фи фибробластов, не щадя острова кератиноцитов. Шкала бар = 20 мкм. Эта цифра была изменена с Бенни и др., 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Смешанный макромолекулярная скученности (mMMC) способствует отложениюякорь фи Бриль здание коллагена VII. (A) ретикулярная осаждения структура коллагена VII осаждения очевидно с фи только под фибробластов mMMC. В совместных культурах, внеклеточного коллагена VII тесно связан с фи broblast колоний между кератиноцитов островов. Кератиноциты показывают околоклеточный и внутриклеточный коллаген VII более сильно выражено в присутствии mMMC. После лизиса клеток, следы коллагена VII наблюдаются в зернистом слое фи пе в mMMC обработанных фи broblast культур, но заметное осаждение фи brillar извлекается из совместных культур. (Б) иммуноблот анализ лизированных слоев клеток показывает , что оба переполненном фи и кератиноцитов фибробластов культуры содержат означаемое тельно больше коллагена VII по сравнению с безлюдных контролем. Извлеченный коллагена VII в основном околоклеточный происходит. (С) Денситометрический анализ В показывает , что mMMC увеличивает количество клеток-ассоциированнойг коллагена VII с коэффициентом 8 в О и фибробластов 2 раза в кератиноциты. Шкала бар = 20 мкм. Эта цифра была изменена с Бенни и др., 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Фибробласт следы содержат больше общего ECM , как визуализировали помех отражения микроскопии (IRM) При анализе отдельных компонентов ECM (коллаген IV и фи bronectin), культура под mMMC усиливается внеклеточный осаждения.. Для того, чтобы визуализировать общее ECM осажденный, ИРМ использовали для количественной оценки всех ECM в качестве меченых антител имеет свои ограничения. IRM ясно показали, что общее количество матрицы и шаблон под mMMC по сравнению с контрольными условиями. Шкала бар = 20 мкм. Эта цифра быларедактировался Бенни и др., 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Смешанные макромолекулярная скученности (mMMC) при глубинном фазы усиливает созревание дермально-эпидермального соединения (DEJ) в эквивалентах кожных фибробластов , содержащие коллаген гели затравку кератиноцитов на вершине и держали под водой в течение 1 недели, а затем поднимается до воздух-жидкость. В классическом протоколе, коллаген VII (зеленый) отсутствовал после того, как в общей сложности 3 недель в культуре, но появилась в эквивалентах кожи через 5 недель. В отличие от этого, при mMMC, коллаген VII был уже сильно ощутима после 3-х недель и даже более сильно окрашивают через 5 недель по сравнению со стандартными культурами. Гематоксилином и эозином (20х увеличение) окрашивание сна фи rmed, что с этим быстрым протоколом, стратификации и зрелости эквивалента кожи были сохранены и ускорены. Шкала бар = 100 мкм. Эта цифра была изменена с Бенни и др., 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Доказательства формирования De Novo анкерных фи brils в эквивалентах кожи , полученных при исследованиях mMMC Ультраструктурный зарождающегося дермально-эпидермального стыке органотипических сокультурах после протокола культуры 3 недели с mMMC (А, В) предполагает структуры сродни анкеровки Fi brils (стрелки), которые отсутствуют в не переполненных эквивалентов кожи (C) после 3 -х недель культуры. Эта цифра была изменена фром Бенни и др., 2015. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
