Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist weit verbreitet, um ein besseres Verständnis der Zellfunktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung 1 zu gewinnen. FRET wird Energie von einem angeregten Donor-Fluorophor mit einem Akzeptor-Fluorophor übertragen. FRET-Effizienz hängt stark von der Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor-Fluorophor und deren Ausrichtung und damit eine empfindliche Auslesen von Konformationsänderungen, welche die beiden Fluorophore beeinflussen. Dieses Phänomen wird genutzt, um FRET-Biosensoren für die Bildgebung von kleinen Molekülen zu erzeugen. Änderungen in deren Konzentration überwacht werden erhöht / verringert sich im Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors gegen Donorfluorophors 2. Zum Beispiel ermöglichen eine schnelle und stabile Erfassung von freien Calciumkonzentrationen in lebenden Zellen 3 FRET-basierten Biosensoren Calcium. Weitere Vorteile der FRET-Biosensoren sind in einzelnen lebenden Zellen Bildgebung, tErben Nichtinvasivität, ihrer Fähigkeit, an verschiedenen Zelltypen und Zellkompartimente 4 ausgerichtet sein.
Viele Aspekte der intrazellulären Gallensäure Dynamik noch weitgehend unverstanden. Zum Beispiel ist wenig über den Mechanismus zugrunde liegende Regelung von konjugierten und nicht konjugierten Gallensäure-Transport bekannt. Bestehende Techniken zur Überwachung dieser Transport vor allem nutzen Luciferase-basierte Reportern, radioaktiv markierte Gallensäuren oder fluoreszierenden Gallensäure-Analoga. Letztere erfordert eine Modifikation der Gallensäuren, gegebenenfalls deren Eigenschaften zu beeinflussen. Luciferase-basierte Reporter haben schlechte Zeitauflösung. Außerdem führen diese Techniken zu einem Verlust der Probe und nicht anwendbar für die Bildgebung in einzelnen Zellen. Daher wäre es von Vorteil, um Methoden, die Live-Single-Cell-Imaging von Speditionstätigkeit ermöglichen mit FRET Biosensoren nutzen, zumal es beinhaltet den Vorteil, ratiometrische Detektion 5, 6. Während Varianten von CFP / YFP Form am häufigsten verwendeten FRET-Paare, neue Strategien durch MORANGE und mCherry tragenden Selbstassoziation induzierenden Mutationen zu einer Ausdehnung des FRET-Toolbox mit neuartigen Sensoren, einschließlich eines rotverschoben Gallensäuresensor 7 geführt.
Wir eine genetisch kodierte FRET Gallensäuresensor (BAS), das aus einem Donor-Fluorophor (himmel) und einem Akzeptor-Fluorophor (Citrine), die mit dem Farnesoid X-Rezeptor (FXR) Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind, besteht eine zuvor (FXR-LBD) und ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv 8. Dieses Peptid assoziiert mit dem FXR-LBD in einem Gallensäure-abhängige Weise. Nach FXR-Aktivierung wird die Distanz zwischen Citrin und cerulean ändern aufgrund einer Konformationsänderung. In Säugetierzelllinien, FXR-Aktivierung führt zu einer deutlich spürbaren Erhöhung der Citrine / cerulean Verhältnis, während das gereinigte Sensor arbeitet in entgegengesetzter Richtung und führt zu einer verringerten FRET Verhältnis auf FXR-Aktivierung. Dieser Sensor (CytoBAS)ermöglicht die Überwachung von zytosolischen Gallensäure-Dynamik. Durch Carboxy-terminale Addition von subzellulären Targeting-Motive kann der BAS-Konstrukts in den Zellkern (NucleoBAS) und Peroxisomen (PeroxiBAS) ausgerichtet werden, so dass Messungen der Gallensäure-Konzentrationen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Obwohl die Zugabe des peroxisomalen Targeting-Motiv nicht seiner Anpassungsfähigkeit an Gallensäuren zu beeinträchtigen, hat zellpermeablen FXR-Liganden induziert jedem Bund Änderungen PeroxiBAS Inneren Peroxisomen 8. Wie die Natur dieser Diskrepanz nicht bekannt ist, das Protokoll unten auf CytoBAS und NucleoBAS konzentriert.
Die Verwendung dieser genetisch kodierte FRET Sensor wurde kürzlich in den Zellen der Leber-Gallensäure-Transporter Na + / Taurocholat co-transportierenden Polypeptids (NTCP) und gelöstem organischen Stoff transporter alpha / beta (OSTαβ) 8, enthaltend gezeigt. NTCP ist der Hauptlebergallensäure Importeur und OSTαβ ist eine basolaterale Darm-Galle-Transporter, die sowohl als Importeur und Exporteur von der elektrochemischen Gallensäure Konzentrationsgradienten 9, 10 funktionieren kann. Neuere Daten zeigen, dass bei der Gallensäure-Transport durch NTCP und / oder OSTαβ, robusten und schnellen Reaktionen in FRET-Verhältnis infolge der Ligand-FXR-LBD Wechselwirkung beobachtet werden.
Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für Methoden zur FRET zu messen, wie die konfokale mikroskopische Analyse und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), markieren wichtige Schritte, potenzielle Probleme anzugehen und alternative Methoden zu diskutieren. Mit dieser genetisch kodierte FRET-Sensor, können Gallensäure Interaktion mit FXR-LBD quantifiziert und direkt in lebenden Zellen überwacht werden und bietet eine schnelle und einfache Methode zur Visualisierung Gallensäuretransport und Dynamik in Echtzeit. Säuger-Expressionsplasmiden CytoBAS und NucleoBAS kodieren, sind im Handel erhältlich. Daher kann diese Biosensor weiter auf die beitragenVerständnis der Gallensäure-Transporter oder Verbindungen, die FXR aktivieren und einen tieferen Einblick in Gallensäure Biologie und Signalisierung.
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Protocol
1. Transiente Transfektion
Hinweis: CytoBAS und NucleoBAS (Bitte siehe Materialien Table) werden erfolgreich in mehreren Zelltypen, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK und HEK293T-Zellen) verwendet. Die Hauptanforderung, um den Sensor zu verwenden, die es braucht, die exprimiert werden, erfordert die Codierung DNA in die Zelle eindringen.
- Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten 25 cm 2 -Kolben. Verdünnte Zellen in komplettem Kulturmedium geeignet ist für die spezifische Zelllinie (10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Pen / Strep für U2OS und Huh7 Zellen).
- Platte Zellen an der gewünschten Dichte in eine sterile 8 auch Kammerdeckglas (0,8 cm 2). Ziel für eine subkonfluente (60-80% Konfluenz) Schicht von Zellen am Tag des Experiments, obwohl dies nicht wesentlich ist.
- Hinzufügen komplettem Kulturmedium auf ein Endvolumen von 400 ul pro Vertiefung. Sodass die Zellen für 24 h zu befestigen.
- Bereiten Sie das Transfektionsgemisch in einem sterilen Röhrchen durch Zugabe von 0,5 ug NucleoBASoder CytoBAS DNA zu 100 ul Kulturmedium (Serum / Antibiotika-frei). Vortex gut. Fügen Sie ein Transfektionsreagenz und mischen durch Vortexen. Transfektionsreagenzien, die eine optimale Effizienz zu geben sind Zelltyp abhängig und können vor Test erforderlich.
- Zum Beispiel verwenden 2,5 ul 1 mg / ml Polyethylenimin (PEI) und Inkubation der DNA / PEI-Mix für 15 min bei RT.
- Fügen Sie das Transfektionsgemisch in Tröpfchen zu den Zellen und mischen durch vorsichtiges Schütteln der Well-Platte mit der Hand. 100 ul des Gemisches für eine gut von ~ 9,6 cm 2. Verwenden 10 ul der Transfektionsmischung für einzelne Abbildungskammern transient transfizierten Zellen.
Hinweis: Nach 24 bis 48 Stunden werden die Zellen des Gallensäuresensor zum Ausdruck und kann für Experimente verwendet werden.
2. Stabile Transfektion
- Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten 25 cm 2 -Kolben. Verdünnter Pellet in komplettem Kulturmedium geeignet ist für die spezifische Zelllinie (10% fötales Rinder SErum, 1% L-Glutamin, 1% Pen / Strep für U2OS und Huh7-Zellen) zu einer Konzentration von 150.000 Zellen pro ml und fügen etwa 300.000 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Kulturplatte (2 ml Endvolumen).
- Sodass die Zellen für 24 h zu befestigen.
- Bereiten Sie das Transfektionsgemisch in einem sterilen Röhrchen durch Zugabe von 0,5 ug CytoBAS oder NucleoBAS DNA (Bitte siehe Materialien Table) zu 100 ul Kulturmedium (Serum / Antibiotika-frei). Vortex gut. Fügen Sie ein Transfektionsreagenz und mischen durch Vortexen.
- Zum Beispiel verwenden 2,5 ul 1 mg / ml Polyethylenimin (PEI) und Inkubation der DNA / PEI-Mix für 15 min bei RT.
- 100 l des Transfektionsgemisch in Tröpfchen zu den Zellen und mischen durch vorsichtiges Schütteln der Well-Platte mit der Hand. Wir sind stets bemüht untransfizierten Kontrolle bei der Erstellung einer stabilen Zelllinie.
- Wachsen Zellen O / N bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Trypsinize Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Inkubiere Zellen bei 37 ° C mitith 1,5 ml vorgewärmter Trypsin pro 25 cm 2 Zellkultur) und Spin sie unten bei 250 · g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen in 13 ml vollständigem Kulturmedium. Teilen Sie Zellen über verschiedene Durchmesser von 10 cm Kulturschalen: 0,5 ml (low density), 1,5 ml (Mitteldichte) und 4,5 ml (hohe Dichte). Machen Sie dasselbe für die verbleibenden 6,5 ml.
- Hinzufügen Kulturmedium auf ein Endvolumen von 10 ml. Für U2OS-Zellen, verwenden Sie 800 ug / ml G418 für Plasmide mit dem Neomycin-Resistenz-Kassette, wie die CytoBAS und NucleoBAS konstruiert, um für positive Zellen auszuwählen. Diese Konzentrationen Zelltyp abhängig und kann durch Auswahl der niedrigsten Antibiotikum (G418) Konzentration, bei der nicht transfizierten Zellen starben innerhalb von 2 bis 10 Tage (800 & mgr; g / ml G418 für U2OS-Zellen) bestimmt werden.
- Aktualisieren Sie das Kulturmedium mit dem entsprechenden Antibiotikum (G418) jede 72 Stunden, bis die nicht transfizierten Zellen tot sind.
- Untersuchen Sie die Kulturplatte unter dem Mikroskop mit einem 20x-Objektiv fürpositive Kolonien (Fluoreszenz kann mit den meisten für Grün, Cyan oder gelbe Fluoreszenz verwendet Filtersätze überwacht werden).
- Markieren Sie die positiven Kolonien, die isoliert mit einem Stift auf der Außenseite Boden der Kulturschale zu liegen aus anderen Kolonien.
- Zweimal waschen Sie die Platte mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und saugen Sie es. Nehmen Sie etwa 15 sterile Klonen Zylinder und tauchen sie in sterile Silikon. Übernehmen Sie auf den ausgewählten Kolonien durch leichtes Drücken gegen die Petrischale und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als eine Kolonie, in der das Klonen Ring enthalten.
- Pipette 20 ul vorgewärmtem Trypsin (1x, 0,25%) bei der Klonierung Zylinder und bei 37 ° C, bis die meisten Zellen aufgerundet (Beobachtung mit einem Mikroskop).
- Fügen Sie 150 ul Kulturmedium mit Serum und dem entsprechenden Antibiotikum (10% FBS und 800 ug / ml G418 für U2OS und Huh7 Zellen) bei der Klonierung Zylinder und pipettieren nach oben und unten mehrere Male, um die Zellen zu resuspendieren und in ein 96-Well-Platte. Aktualisieren Mediums nach 4-24 h und ermöglichen Zellen konfluent in den nächsten Tagen (37 ° C, 5% CO 2 für U2OS und Huh7 Zellen) wachsen.
- Aktualisieren Medium mit Antibiotikum alle 3 oder 4 Tage. Wenn die Zellen konfluent gewachsen, Übertragung auf einen größeren Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Kultur groß genug für Experimente ist. Kryokonservierung einige Fläschchen für das Backup. Kryokonservierung Medium besteht aus 20% FBS und 20% DMSO in Medium (DMEM) ohne Zulagen.
Anmerkung: Nun ist die Zellinie monoklonale und als zur Expression des Gallensäuresensor stabil. Die Hälfte der Konzentration des Antibiotikums G418 (400 ug / ml) reicht nun aus, um die Expression in der stabilen Zelllinie erhalten.
3. Lentivirale Transduction
Anmerkung: Bei einigen Zelllinien werden als schwierig durch traditionellere Verfahren wie Polyethylenimin (PEI) Methode zu transfizieren. Virale Transduktion von Zellen ist ein effizientes alternatives Werkzeug foder Gen-Lieferung und stabile Transgenexpression.
- Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten 25 cm 2 -Kolben. Verdünnte Zellen in komplettem Kulturmedium für die spezifische Zelllinie (10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Pen / Strep für U2OS und Huh7-Zellen) geeignet und fügen etwa 200.000 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Kulturplatte.
- Hinzufügen Kulturmedium auf ein Endvolumen von 2 ml pro Vertiefung. Sodass die Zellen für 24 h zu befestigen.
- Auszuführen virales Transduktionen durch Inkubieren der Zellen für 4-6 h mit 500 ul CytoBAS Lentivirus enthaltenden Medium (auf Anfrage erhältlich) gefüllt bis zu einer Gesamtmenge von 1 ml mit kompletten Kulturmedium, das 10 ug / ml Diethylaminoethyl (DEAE) -Dextran oder ein anderes Lentivirus Transduktion Enhancer. Vergessen Sie nicht, ein gut mit untransduzierten Kontrollzellen enthalten.
- Entfernen Sie Medium und 2 ml komplettem Kulturmedium, das das gewünschte Antibiotikum (500 ug / ml Hygromycin). Verwenden Sie einen lentiviralen Konstrukt für CytoBAS Transduktion, die lieferns Hygromycinresistenz zu den Zellen. Wachsen Zellen unter gewünschten Bedingungen.
- Aktualisieren Medium mit (500 ug / ml Hygromycin) Antibiotikum alle 3 Tage und teilen Sie die Zellen, wenn sie 80% konfluent, bis alle Zellen der Negativkontrolle sind tot (dauert etwa 1-2 Wochen für die meisten Zelllinien). Die Zelllinie wird nun als zur Expression des Gallensäuresensor stabil.
- Alternativ können Zellen für die Experimente 1-3 Tage nach der Virusübertragung. Als Lebendvirus könnte vorhanden sein, benötigt dieses FRET-Auslesegeräte in Räumen mit den entsprechenden Sicherheitsniveau.
- Alternativ zur schnellen Isolierung von stabilen Zelllinien, führen Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS).
- Ernte-Zellen, die aus einer konfluenten 160 cm 2-Kolben.
- Verdünnte Zellen in Leibovitz-Kulturmedium (L-15-Medium) mit <5% Serum bis zu einer Konzentration von maximal 5 x 10 6 Zellen pro ml
- Zum Sammeln der sortierten Zellen, füllen FACS-Röhrchen mit 1 ml Sammelmedium (L-15 Medium + 1,5% Pen / Strep, 1% L-Überangebot und 20% Serum).
- Sortieren Zellen für Citrin (520-580 nm) oder cerulean (450-520 nm), aufgeregt mit 405 Laser.
- Nach dem Sortieren rund 500.000 Zellen, Spin-down-Zellen (5 min, 250 xg) und resuspendieren sie in 5 ml normaler komplettem Kulturmedium (10% FBS, 250 ug / ml Hygromycin für U2OS und Huh7 CytoBAS Zellen) und plattieren sie in eine T25-Kultur Flasche. Wachsen Zellen, die unter den gewünschten Bedingungen (37 ° C, 5% CO 2 für U2OS und Huh7 Zellen).
4. Live Cell Imaging der Gallensäure-Sensor
Hinweis: Zellen, die Gallensäure-Transporter können in Medium mit 1-10% Holzkohle gefiltert Serum, das lipophile Verbindungen entfernt kultiviert werden. Normalserum enthält häufig Gallensäuren, die intrazelluläre Akkumulation Gallensäure und die Sättigung des Gallensäuresensor führen könnte.
- FRET-Messungen mit dem Konfokalmikroskop
- Platte die Zellen, die stabil oder transiently exprimieren den Sensor auf die gewünschte Dichte in eine sterile 8 auch Deckboden Kammer Schieber (0,8 cm 2). Wachsen Zellen in komplettem Kulturmedium (unter Verwendung von Holzkohle gefiltert Serum), so dass auf dem Tag des Experiments ist Konfluenz 60-70%.
- Mit 200 ul 1x PBS oder Leibovitz L-15 Kulturmedium Waschen Sie die anhaftenden Zellen in Kammerobjektträger einmal.
- Absaugen und ersetzen mit 300 ul Leibovitz L-15-Kulturmedium, so dass kein CO 2 Steuerung notwendig ist.
Anmerkung: DMEM ohne Phenolrot, können ebenfalls verwendet werden, aber CO 2 gepufferten Bedingungen erfordert. Die Gallensäuresensor zeigt (etwas) pH-Empfindlichkeit, so zielen darauf ab, den pH-Wert konstant bei der Datenerhebung zu halten. - Verdünnen Sie die in der konfokalen Abbildung Experiment auch in der L-15 Kulturmedium verwendet werden Verbindungen. Bitte berücksichtigen, dass während der Bilderzeugung, relativ große Mengen an Flüssigkeit in den Kammern hinzugefügt werden, um eine schnelle Durchmischung der Probe (50-100 ul) zu sichern,so stellen 3-5x Lösungen.
- Starten Sie die Imaging-Software eines konfokalen Mikroskops mit einem 37 ° C Inkubationskammer und schalten Sie den violetten 405 nm Laser. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die objektive und legen Sie die 8-Kammer oben drauf. Für einzelne Zelle Bildgebung von FRET, verwenden Sie das 63X Öl-Objektiv. Der Sensor wurde erfolgreich bei RT verwendet, aber das Verhalten der Zelle könnte verändert werden.
- Setzen Sie die Einstellungen des konfokalen Mikroskops richtig.
- Stellen Erfassungsmodus: xyt (Zeitraffer-Bildgebung von einzelnen Fokusebene).
- Erwerben Sie Bilder in 20 Sekunden-Intervallen, damit Verbindungen zwischen Akquisitionen hinzugefügt werden, ohne Pause das Experiment.
- Stellen Spektralbereich zur Emission Erkennung: Cerulean: 450 bis 520 nm; Citrine: 520-580 nm.
- Konzentrieren Sie sich auf der Einzelzellschicht mit Durchleuchtung Licht. Starten Bildgebung und genauer Einstellung der z-Position. Stellen Sie Gain und Offset für jeden Kanal, um Signal vom Hintergrund zu unterscheiden, während bleibening gut unterhalb der Sättigung für alle Pixel in interessierenden Zellen.
- Zeichnen Sie Kreise um die Region of Interest (ROI) zu definieren. Markieren Sie die Zellen, die ähnliche Fluoreszenzintensität zeigen. Vermeiden Zellen, die offensichtlich von der durchschnittlichen Zell in Größe und Form variieren. Setzen die Zellen, um Licht für eine Zeitdauer so kurz wie möglich zu Photobleichen des Sensors zu minimieren. Es ist ratsam, ROIs nicht sehr nahe am Umfang der Zelle zu ziehen. Dieser Bereich ist sehr empfindlich auf Veränderungen in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Fokusdrift (Zellen Bewegung in z-Richtung) wodurch es schwieriger wird, um Änderungen in der Fluoreszenzverhältnis während des Versuchs zu überwachen.
- Starten von Messungen mit dem konfokalen Mikroskop. Warten, bis die himmelblaue und Citrin-Fluoreszenz ist stabil.
- In 50 bis 100 & mgr; l Gallensäuren oder andere Verbindungen zu ausgewählten Zeitpunkten während der Messung. Die relativ hohen Mengen an Flüssigkeit (ein Fünftel bis ein Drittel des Endvolumens) notwendig sind, um die Flüssigkeiten (innerhalb von 10 sec) gut mischen ohne Schütteln / pipetting nach oben und unten. Achten Sie darauf, den Rand der 8-Well-Kammer mit der Pipettenspitze nicht berühren und fügen Sie die Flüssigkeit langsam, so dass die Zellen nicht aus dem Fokus zu erhalten. Neue Verbindungen Fügen Sie nicht, bevor der Plateauphase erreicht ist. Dieser Vorgang dauert ca. 200 Sekunden.
- Werden am Ende jedes Experiments mit der Zugabe von 100 & mgr; GW4064, Endkonzentration 5-10 uM (Sensor Sättigungsdosis) und warten, bis der Sensor Fluoreszenz ist stabil.
- Speichern Sie das Experiment und die Daten zu exportieren als .avi-Datei.
- Open in ImageJ beide AVI-Dateien (Kanal 00, cerulean, Kanal 01, Citrin), indem Sie Plugins> Stapel> Stapel-Interleaver. Alternativ Import konfokalen Datei (zB .lsm oder .lif Dateien) direkt in Bild J mit entsprechenden Plugins (verfügbar unter http://www.openmicroscopy.org) und gehe zu Schritt 4.1.14.
- Für Stack 1: Verwenden Sie Kanal 01 (Citrin).
- Für Stack 2: Verwenden Sie Kanal 00 (cerulean).
- Klicken Sie auf Bearbeiten> Auswahl> hinzufügenzum Manager, um den ROI-Manager-Fenster zu öffnen. Markieren Sie die Checkbox "Alle anzeigen".
- Zeichnen Sie ein paar Bereiche von Interesse (ROIs) in Bezug auf bestimmte Zellen, die mit dem ovalen Auswahlwerkzeug. Auch zeichnen einen Kreis in einem Bereich außerhalb Zellen oder in einer Zelle, die nicht den Sensor nicht ausdrücken, um das Hintergrundsignal zu bestimmen. Es ist ratsam, ROIs nicht sehr nahe am Umfang der Zelle in Experimenten zu ziehen, wenn Veränderungen in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Fokusdrift (Zellen Bewegung in z-Richtung) oder die Zellmigration waren offensichtlich.
- Wählen Sie eine Zelle. Klicken Sie auf Plugins> Verhältnis Profiler. RAW, Verhältnis und Ratio_Profile: Dies wird in 3 Bildschirme führen. Die RAW-Fenster zeigt die Zunahme der Intensität der Citrin (blaue Linie) und eine Abnahme der cerulean (rote Linie), wenn es FRET. Der Ratio-Fenster gibt Auskunft über das Verhältnis Citrin / cerulean, die mit einer Zunahme der FRET erhöht. Das Fenster Ratio_Profile gibt die tatsächliche Zahl der Fluoreszenzintensität in beiden Kanälen gemessen. Wenn microsbewältigen Setup-spezifische Dateien (zB .lsm oder .lif anstelle von .avi-Dateien) werden verwendet, die Kanalreihenfolge könnte umgekehrt werden.
- Kopieren der Daten aus dem Ratio_Profile Fenster in der Tabelle als Ergänzungsdaten beigefügt. Machen Sie dasselbe für alle anderen Zellen (und Hintergrund ROI).
Anmerkung: In der Online-Tabelle wird normalisiert, um den Zustand bei der eine maximale BAS Aktivierungs voraussichtlich alle Daten. Da GW4064 ist der stärkste Aktivator von FXR, das Fluoreszenzverhältnis nach der Inkubation mit einem Überschuss von GW4064 auf 1 gesetzt ist Es ist daher wichtig, um alle Experimente mit Zugabe von GW4064 beenden. Der Vorteil davon ist, dass die Daten nicht mehr abhängig von der Laserintensität oder Detektorverstärkung und Versuche an verschiedenen Tagen leichter verglichen werden. Ferner ist in dem unteren Diagramm der Tabellenkalkulation kann ein laufender Mittelwert verwendet, um die Kurven für experimentelle Rauschen zu glätten. Jedoch nicht verwenden diese Grafik bei der Analyse von kinetischen Daten, da die Lauf AveraGE wird auch glatt schnelle kinetische Reaktionen.
- FRET-Messungen mit Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
- Verdünnter alle Verbindungen für die FACS-Experiment in sterile FACS-Aufnahme-Puffer (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN 3 und 10 mM D-Glucose).
- Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten T-160 cm 2 Zellkulturflasche mit 5 mM EDTA in PBS. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 5 min. Wash Zellpellet 2 x in 5 ml FACS Aufnahmepuffer bei Raumtemperatur.
- Graf Zellen unter Verwendung des Coulter-Zähler oder ein Zählkammer.
- Verdünnter Pellet in FACS Aufnahmepuffer auf eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. Pipette nach oben und unten um eine homogene Suspension von Einzelzellen zu schaffen. Wenn Zellen sind schwierig zu zerlegen, legen Sie die Proben durch eine Zellsieb vor dem Sortieren zu Düse verstopft zu minimieren.
- Jeweils 200 ul Zellen pro FACS-Röhrchen und sie vor Licht zu schützen.
- Fügen Sie die gewünschte Konzentration der Verbindung (zB, Gallensäuren, synthetischen FXR-Liganden-Transporter-Inhibitoren). Wirbel. Inkubieren Sie für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln (im Dunkeln).
- Unterdessen beginnen die FACS (die Laser brauchen Zeit, um sich aufzuwärmen).
- Stellen Sie die Durchflusszytometrie Gating-Parameter für das Experiment (siehe Abbildung 3):
- Laden Sie rund 100.000-200.000 NucleoBAS oder CytoBAS transfizierten Zellen, die Tore zu bestimmen.
- Zuerst stellen Sie die FSC und SSC-Spannungen, um die Zellen in der Mitte des Grundstücks zu zeichnen.
- Unter Verwendung der violetten Laser, passen Sie die cerulean (450/40 nm) Spannungswert und Citrin (525/20 nm) Spannung und sicherzustellen, dass alle NucleoBAS oder CytoBAS positive Zellen werden im Streudiagramm dargestellt.
- Stellen Sie die richtige Gates (Tor P1 bis P4-Tor), siehe Abbildung 4.
- Verwenden Gate P1, um tote Zellen, in der Regel in der linken unteren Ecke angezeigt wird, indem Sie den Hauptpopulation in der Mitte des SSC-A / FSC-einem Grundstück auszuschließen.
- Verwenden Gate P2 inDie FSC-H / FSC-A Fenster Duolen von der Analyse zu entfernen. Einzelzellen in einer Diagonallinie als Dubletts dargestellt.
- Tor P3 in der Citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) Fenster kann verwendet werden, um für NucleoBAS / CytoBAS positiven Zellen auszuwählen, durch Gating Citrin und cerulean hohen Zellen, in der rechten oberen Ecke des diagonal angezeigt eine Bevölkerung die Handlung.
- Zeichnen Gate P4 in der oberen linken der Bevölkerung, so nah wie möglich und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 5% der Zellen innerhalb dieses Tor fällt.
- Legen Sie ein paar nicht transfizierten Zellen (kein Ausdruck CytoBAS oder NucleoBAS), um Autofluoreszenz zu bestimmen. Die transfizierten Population kann nicht im Gate P3 befinden. Passen Gate P3, wenn notwendig, um auto-fluoreszierenden Zellen auszuschließen.
- Mischen Sie den Proben vor der Platzierung der Röhrchen im FACS. Für jede Probe zu messen, zumindest 10.000 Zellen in Gate-P3.
Hinweis: Die Bevölkerung Hierarchiefenster gibt die Anzahl der Veranstaltungenwobei für jedes Gate und% der Mutter Gatter angezeigt. Im Gatter 4 die% der Mutter heißt Zellen, die mit einem erhöhten Citrine / cerulean Verhältnis als Prozentsatz aller NucleoBAS positiven Zellen.
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Representative Results
Die FRET-BAS Sensor enthalten, wird für die Ligandenbindungsdomäne von FXR (LBD-FXR) zwei Fluorophore Citrine und himmel) und ein LXXLL-Motiv angebracht basiert. Dieser Sensor ermöglicht Untersuchungen Gallensäuretransport in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (Abbildung 1 A). Mutationen in cerulean und Citrin wurden angewendet, um die Bildung der intramolekularen Komplexes (Abbildung 1 B) zu fördern. Gallensäuren und anderen FXR-Liganden binden an FXR und damit den Abstand zwischen Citrin und cerulean verändern durch eine Konformationsänderung. In lebenden Säugetierzellen, führt dies zu einer erhöhten FRET-Effizienz (Citrine Erhöhung Coelinblau Abnahme) (Abbildung 1 C, 1 D). Während einer Live Cell quantitative intensitätsbasierten FRET Experiment mit dem konfokalen Mikroskop, it wurde beobachtet, dass Taurochenodesoxycholsäure (TCDCA) behandelten (30 uM) U2OS-Zellen, die NucleoBAS fehlt Gallensäure-Transporter keine Änderungen im FRET nicht zeigen, während die durchschnittliche Citrin / cerulean Quote deutlich erhöht nach der Behandlung mit GW4064 (5 uM) (Abbildung 1 C). Im Gegensatz dazu U2OS-Zellen co-exprimierenden NucleoBAS, NTCP und OSTαβ habe zeigen eine deutliche Zunahme der Citrin / cerulean Verhältnis bei Zugabe von TCDCA und einen noch größeren Anstieg des Verhältnisses nach Zugabe von GW4064 (Abbildung 1 D). Dies zeigt, dass TCDCA kann nicht durch die Zellmembran passieren und erfordert spezifische Transporter in die Zelle eindringen.
Zelluläre Lokalisierung des Sensors wird durch das Vorhandensein von spezifischen Lokalisierungssignale bestimmt. NucleoBAS ist mit dem Kern durch die Kernlokalisierungssignal gezielt (Abbildung <strong> 2 B), während CytoBAS keine Lokalisierungssignal enthalten, und bleibt daher im Cytosol (Abbildung 2 A). Der Biosensor kann auch mit Abbildung anderer fluoreszierenden Proteinen kombiniert werden, so dass Messungen der Proteinexpression / Lokalisierung und FXR-Aktivierung in der gleichen Zelle. Zum Beispiel Abbildung 2 C zeigt mit NucleoBAS und NTCP-mKate2 U2OS-Zellen cotransfiziert. Zusätzlich kann der Sensor auch mit anderen Sensoren zur subzellulären Bildgebung von mehr als einen Parameter gleichzeitig kombiniert werden. So wurde zum Beispiel NucleoBAS zusammen mit TGR5 (EST-Klon Bild # 5.221.127) und eine cAMP cytosolischen Sensor (T Epac VV) 11 bis TGR5 und FXR-Aktivierung in einer Zelle gleichzeitig zu messen ausgedrückt. Auf TGR5 Bindung erhöhte cAMP-Spiegel im Cytosol, die durch die cAMP-Sensor erkannt wurde, FXR-Aktivierung im Kern war visgleichzeitig ualized. den 2D-F zeigen eine Zeitreihe von 6 konfokalen Bildern von NucleoBAS-TGR5- T Epac vv Zellen besteht nach der Behandlung mit GW4064 (5 uM) (Abbildung 2 d), mit TCDCA (10 uM) (Figur 2 E) oder mit Chenodesoxycholsäure (CDCA) (10 & mgr; M) (Abbildung 2 F) bei t = 0. Die grüne Farbe steht für Regionen, in denen 525/450 nm Emissionsverhältnis verringert (die cAMP Elevation) und die rosa Farbe entspricht einer Steigerung im Emissionsverhältnis (FXR-Aktivierung), im Vergleich zu die Verhältnisse zu Beginn des Experiments.
Zusätzlich Durchflusszytometrie verwendet, um einen Pool von Zellen auf Einzelzellebene oder als Screening mit hohem Durchsatz auf die gesamte Population zu screenen. U2OS-Zellen, die NucleoBAS waren excited mit einem violetten 405 nm-Laser und die Fluoreszenz wurde in der 450/40 Bereich für cerulean und 525/20 Bereich für Citrin gesammelt. Um die Effizienz der FACS-basierten FRET-Experimente zu verbessern, muss die richtige Gates eingestellt werden (Abbildung 3). Die P1-Gate schließt Zelltrümmer und die P2-Gate entfernt Duolen von der Analyse. Als nächstes wird die Analyse auf Citrine (Anregung mit 488-Laser) und himmel (Anregung mit 405-Laser) positive Zellen durch das Gatter 3. Schließlich beschränkt Gatters P4 stellt den Prozentsatz der Zellen mit einer hohen Citrine / cerulean Emissionsgrad (unter Verwendung von Anregung Coelinblau mit 405-nm-Laser). Für jede Probe wurden mindestens 10.000 Zellen, die in Gatter 3 fiel gemessen.
Anschließend wurde FACS-basierte FRET Durchflusszytometrie verwendet, um eine Zunahme der FRET in lebenden Zellen nach 30 min Inkubation mit TCDCA und GW4064 berechnen. Nicht behandelten U2OS-Zellen, die NucleoBAS zeigten <5% Zellen in Gate P4 (Citrin / cerulean hohe Zellen). In Abwesenheit von Gallensäure-Transporter wurde ein ähnlicher Prozentsatz in 30 uM TCDCA behandelten Zellen (Figur 4 A) beobachtet. Im Gegensatz dazu Zelle co-exprimierenden NucleoBAS, NTCP und OSTαβ hat eine erhöhte Menge von Citrin / cerulean-Hochzellen von rund 38%. Nach Zugabe von 10 & mgr; M GW4064, fast 90% der Zellen waren Citrin / cerulean-Hoch unabhängig davon, Ausdruck OSTαβ oder NTCP (Abbildung 4 B). Die Daten können in Balkendiagrammen (% Zellen in Gate 4, Bevölkerungs 4) (Abbildung 4 C, D) oder als Bevölkerung Histogramme der Citrin-cerulean Verhältnis (Abbildung 4 E, F) vorgelegt werden.
Fild 1. Design des Gallensäuresensor (BAS). (A) Strukturdarstellung der Wirkungsweise einer genetisch codierten Gallensäure-Sensor. Es besteht aus einem Donorfluorophor (himmel) und einem Akzeptor-Fluorophor (Citrine) über die FXR-LBD in Beziehung und in FXR-Kofaktor-Peptid (LXXLL-Motiv) fusioniert. (B) Schematische Domänenarchitektur der BAS. Die Q204F / V224L Fluorophor Mutationen fördern die Bildung von intramolekularen Wechselwirkungen zwischen cerulean und Citrin. Die NucleoBAS Konstrukt enthält eine C-terminale nukleäre Lokalisationssignal (NLS) und reichert sich deshalb in den Kern, während die CytoBAS Konstrukt fehlt jede Zielsequenz und damit zeigt cytosolische Lokalisierung. (C) Repräsentative konfokalen basierten FRET Experiment mit BAS als Instrument zur konjugierten Gallensäuretransport zu überwachen. Keine Änderung der Citrin / cerulean Verhältnis wird nach 30 uM TCDCA hinaus in den Zellen nur exp beobachtetRessing NucleoBAS. Bei 5 uM GW4064 zugegeben wurde, wurde eine stark erhöhte Citrine / cerulean Verhältnis beobachtet. (D) Import von TCDCA (30 uM) zu einer beträchtlichen Aktivierung des Sensors in NTCP und OSTαβ co-transfizierten Zellen. Anschließenden GW4064 (5 uM) Behandlung führt zu einer weiteren Erhöhung der Citrine / cerulean Verhältnis. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6 Einzelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Lokalisierung FRET-BAS konstruieren in lebenden Zellen. Die konfokale Mikroskopbilder von U2OS-Zellen mit CytoBAS (A) oder NucleoBAS (B) transfiziert. (C) U2OS-Zellen co-Tranmit NucleoBAS und NTCP-mKate2 sfected. Der Maßstab entspricht 10 & mgr; m. (D - F) Zeitreihe der NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV transfizierten Zellen. (D) GW4064 aktiviert FXR (erhöhte 525/450 nm-Verhältnis), jedoch nicht TGR5. (E) TCDCA aktiviert TGR5 auf der Plasmamembran (verminderte 525/450 nm-Verhältnis), ist aber nicht in der Lage, die Zelle an FXR im Kern zu aktivieren. (F) CDCA aktiviert TGR5 auf der Plasmamembran als auch FXR im Zellkern (erhöhte 525/450 nm-Verhältnis in den Zellkern, sank im Zytoplasma). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Durchflusszytometrie Gating parameters. (A) Die P 1 Tor in der SSC-A / FSC-A-Fenster wird verwendet, um die toten Zellen auszuschließen. (B) in der FSC-H / FSC-A-Fenster wird der P2-Gate gezeichnet Wams Veranstaltungen von der Analyse zu beseitigen. (C) In der Citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) Fenster NucleoBAS (und CytoBAS) positive Zellen markiert sind (Tor P3). (D) Schließlich wird in der Citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) Fenster enthält die P4-Gate Citrin / cerulean-Hoch Zellen der FACS-Experiment. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Figur 4. Repräsentative FACS-Experiment Messgallensäuretransport mit NucleoBAS. (A >, B) FACS-Plots, die die Menge des Citrin / cerulean-hohen Lebens NucleoBAS-exprimierenden U2OS-Zellen (A) und U2OS-Zellen co-exprimierenden NucleoBAS, OSTαβ und NTCP (B) nach der Behandlung mit Kontrollpuffer (links), 30 & mgr; M TCDCA (Mitte) oder 10 uM GW4064 (rechts). (C, D) Balkendiagramm Prozentsatz der Citrin / cerulean-high-Zellen nach 30 min Inkubation mit TCDCA oder GW4064 in U2OS-Zellen, die NucleoBAS und (D) oder ohne (C) OSTαβ und NTCP cotransfiziert. (E, F) Histogramm, das die Verteilung der Citrin / cerulean-Verhältnis in einer Population von U2OS-Zellen, die NucleoBAS mit oder ohne OSTαβ und NTCP nach 30 min Inkubation mit TCDCA (gelb), GW4064 (rot) oder Kontrollpuffer (blau). Alle Bedingungen wurden dreimal gemessen. Balken stellen Mittelwerte + Standardabweichung (SD) (n = 3).TGP: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines neuen genetisch codierten Gallensäuresensor zur Überwachung des raumzeitlichen Dynamik der Gallensäure-Transport in lebenden Zellen. Dieser Biosensor besteht aus cerulean und Citrin fluoreszierende Proteine, die FXR-LBD verschmolzen werden, wodurch ein FRET-Gallensäuresensor (BAS) bilden.
Die Gallensäure-Sensor ist relativ einfach und bequem im Einsatz, wenn mit grundlegenden Erfahrungen mit Zellkultur und FACS oder (konfokalen) Mikroskopie. Allerdings könnten einige Aspekte eine Fehlersuche benötigen. Bei Verwendung der Gallensäure-Sensor in Kombination mit Gallensäure-Transporter, es um Kulturzellen mit Holzkohle-gefiltert Serum wird empfohlen im Medium. Kohle weiter reduziert Gallensäuren Ebenen durch Adsorption aus dem Serum. Insbesondere in Gegenwart von Importeuren wie NTCP, ist dies von entscheidender Bedeutung, um eine Sättigung des Sensors während der Kultur zu verhindern, da dies die häufigste Ursache für eine unempfindliche Sensorwährend der Experimente. Daher wurde ein weiterer Sensor (NucleoBAS N354K / I372V) erstellt, die Mutationen verändern die Empfindlichkeit für Gallensäuren, die Schaffung eines größeren Dynamikbereich 8. Um festzulegen, ob der Sensor bereits gesättigt ist, kann der Citrin / cerulean Verhältnis zu dem Verhältnis in Kontrollzellen keine Gallensäure-Transporter nicht zum Ausdruck verglichen werden, da diese Zellen werden als niedrige intrazelluläre Gallensäure Ebenen. Alternativ können Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) Messungen durchgeführt werden, um FRET in einer Intensität unabhängig 12 zu untersuchen. Dieses Verfahren würde den Rahmen dieser Arbeit und erfordert mehrere spezialisierte Ausrüstung. Andere Gründe für eine unempfindliche Sensor umfassen die Verwendung von Zellen, die Autofluoreszenz sind und / oder haben NucleoBAS Expression verloren. Zu beachten ist, können Schwankungen in der Intensität des cerulean und Citrin (zum Beispiel aufgrund von Fokusverschiebungen) während des Experiments direkte Visualisierung der FRET-Veränderungen während der Bildgebung zu verschleiern, währendratiometrischen Art des Sensors kann noch zur Überwachung von Gallensäure-Dynamik. Oft absolute Intensitätsänderungen sind bescheiden der einzelnen Fluorophore bei Zugabe von FXR-Liganden, während die Erhöhung des Verhältnisses ist offensichtlich.
Für FRET-Analyse in Zellen mit dem BAS-Sensor transfiziert, sollten geeignete Laserlicht und Filter ausgewählt werden. Die Erhöhung der Citrin Intensität während FRET hat mit der violetten Diode (405 nm) Laser mit Emissionen über 450 bis 520 (cerulean) und 520-580 (Citrin) überwacht, gemessen werden. Ein wichtiger Gesichtspunkt zu berücksichtigen, ist die Empfindlichkeit des Sensors gegenüber Photobleichung. Wenn die Intensität von einem oder beiden Fluorophore sinkt mit der Zeit langsam ohne Zugabe von Liganden, deutet dies oft Photobleichen. Dieses Phänomen tritt vor allem wenn die Laserleistung zu hoch ist. Um diesen unerwünschten Effekt zu vermeiden, sollte der Laser Leistung 5% der vollen Leistung nicht überschreiten, und die Zellen müssen im Dunkeln, so viel wie möglich gehalten werden. Begrenzen Sie dieZeit, um für die richtigen Zellen zu suchen. Fluktuationen der Fluoreszenzintensität kann durch Schwer Drift in der Z-Achse verursacht werden. Um dem entgegenzuwirken, kann die Lochgröße erhöht werden, und empfiehlt sich ROIs nicht ganz in der Nähe der Zelle Umfang zu zeichnen ist.
Die FRET-Sensor für Gallensäuren wurde in mehreren Zelltypen (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK und HEK293T-Zellen), die transfiziert und haben einen stabilen Phänotyp werden können getestet. Allerdings primären und differenzierten Zellen wie Leberzellen sind schwer zu transfizieren, und in Bezug auf die Eigenschaften stabil zu halten. Virale Transduktion mit schwer zu transfizieren Zellen (Konstrukt auf Anfrage) zu helfen. Wir sind derzeit Erzeugen einer Mauslinie zur Verwendung des Sensors in frisch isolierten primären Zellen, die sich schnell nach der Isolierung dedifferenzieren ermöglichen.
Um die beschriebene konfokale Experiment durchzuführen, ist es unerlässlich, dass die ausgewählte Zellinie adhärent an eine Kulturschale und wächst in einer single Zellschicht. Jedoch Zellen, die in Suspension oder anhaftenden Zellen, die relativ leicht mit Trypsin behandelt werden können, wachsen, können auch unter Verwendung der FACS gemessen werden. Schließlich ist es ratsam, eine Zelllinie ohne endogenen Gallensäuretransport oder die Synthese bei der Analyse eines bestimmten Transportweges auszuwählen. Also bei der Messung der Aktivität von bestimmten transfiziert (Mutante) Transportproteinen.
Das vorgestellte genetisch kodierte Fluoreszenz Biosensor BAS ist ein wertvolles Werkzeug für die Überwachung einzelner lebender Zellen Gallensäuretransport. Das BAS enthält einen FXR-LBD, die durch eine große Vielfalt von Gallensäuren aktiviert wird, so dass Abbildungs subzellulärer Dynamik der Gallensäuren 8. Dies ergibt einen großen Vorteil in Bezug auf die Verwendung von anderen Techniken. Zum Beispiel im Promotor getriebene Luciferase-Reporter-Assays wird die Luciferase-Signal in Abhängigkeit von der Stabilität der Reporter innerhalb der Zelle nicht unterstützt subzellulären Information und erfordert die Zerstörung der Probe
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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