Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) wordt veel gebruikt om een beter begrip van cellulaire functies in levende cellen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie 1 te krijgen. In FRET wordt energie uit een aangeslagen donorfluorofoor overgebracht naar een acceptor fluorofoor. FRET efficiëntie is sterk afhankelijk van de afstand tussen de donor en acceptor fluorofoor en de oriëntatie en derhalve gevoelig uitlezing van conformationele veranderingen die de twee fluoroforen beïnvloeden. Dit verschijnsel wordt benut om FRET-gebaseerde biosensoren voor de beeldvorming van kleine moleculen te genereren. Veranderingen in de concentratie kan worden gevolgd zoals toename / afname van de verhouding van de emissie-intensiteit van de acceptor ten opzichte van de donorfluorofoor 2. Bijvoorbeeld, FRET-gebaseerde biosensoren calcium zorgen voor een snelle en stabiele detectie van vrij calcium concentraties in levende cellen 3. Andere voordelen van FRET-gebaseerde biosensoren worden beeldvorming in enkele levende cellen, topvolger non-invasieve, hun vermogen om te worden gericht op verschillende celtypen en cellulaire compartimenten 4.
Vele aspecten van intracellulaire galzuur dynamiek steeds slecht begrepen. Bijvoorbeeld, is er weinig bekend over het mechanisme onderliggende regelgeving van geconjugeerde en niet-geconjugeerde galzuurtransport. Bestaande technieken volgen dit transport gebruik van luciferase gebaseerde reporters, radioactief gemerkte galzuren of fluorescente analogen primair galzuur maken. De laatste vereist modificatie van galzuren, mogelijk waardoor hun eigenschappen. Luciferase gebaseerde reporters hebben een slechte tijd resolutie. Bovendien zijn deze technieken leiden tot verlies van het monster en niet van toepassing voor beeldvorming in enkele cellen. Daarom zou het gunstig zijn methoden die levende cel imaging transportactiviteit toestaan via FRET biosensoren gebruiken, vooral omdat het ook de voordelen van ratiometrische detectie 5, 6. Terwijl varianten van CFP / YFP vorm meest gebruikte FRET paren nieuwe strategieën gebruiken Morange en mCherry dragen zelfassociatie-inducerende mutaties hebben geleid tot een uitbreiding van de FRET toolbox met nieuwe sensoren, waaronder een rood-verschoven galzuur sensor 7.
We eerder een genetisch gecodeerde FRET galzuur sensor (BAS), dat bestaat uit een donor fluorofoor (cerulean) en een acceptor fluorofoor (citroengeel) die zijn gefuseerd met farnesoid X receptor (FXR) ligandbindingsdomein (FXR-LBD) en een peptide dat een LXXLL-motief 8. Dit peptide associeert met de FXR-LBD in een galzuur-afhankelijke wijze. Bij FXR activering, zal de afstand tussen citrien en cerulean veranderen als gevolg van een conformationele verandering. In zoogdiercellijnen, FXR activatie resulteert in een duidelijk detecteerbare stijging van de citroengeel / cerulean verhouding, terwijl de gezuiverde sensor werkt in de tegengestelde richting leidt tot een verminderde FRET verhouding van FXR activatie. Deze sensor (CytoBAS)zorgt voor de opvolging van cytosolische galzuur dynamiek. Door carboxyluiteinde toevoeging van subcellulaire targeting motieven, kan het BAS construct gericht naar de kern (NucleoBAS) en peroxisomen (PeroxiBAS), waardoor metingen van galzuur concentraties in verschillende cellulaire compartimenten. Hoewel de toevoeging van de peroxisomale targeting motief niet responsiviteit afbreuk aan galzuren leverde celpermeabel FXR-liganden induceerde enige FRET veranderingen PeroxiBAS binnen peroxisomen 8. Aangezien de aard van deze discrepantie is niet bekend, het protocol hieronder is gericht op CytoBAS en NucleoBAS.
Het gebruik van deze genetisch gecodeerde FRET sensor werd onlangs aangetoond in cellen die de hepatische galzuur transporters Na + / taurocholaat co-transporterende polypeptide (NTCP) en organische opgeloste stof transporter alpha / beta (OSTαβ) 8. NTCP is het belangrijkste lever galzuren importeur en OSTαβ is een basolaterale intestinale galacid transporter dat zowel kan functioneren als een importeur en exporteur afhankelijk van de elektrochemische galzuurconcentratie gradiënt 9, 10. Recente gegevens toonden aan dat bij galzuur transport door NTCP en / of OSTαβ, robuuste en snelle responsen in FRET verhouding als gevolg van ligand-FXR-LBD interactie kan worden waargenomen.
Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor methoden om FRET te meten, zoals confocale microscopische analyse en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), markeert kritische stappen, aan te pakken en potentiële problemen te bespreken alternatieve methoden. Met deze genetisch gecodeerde FRET sensor, kunnen galzuur interactie met FXR-LBD gekwantificeerd en gecontroleerd direct in levende cellen en verschaft een snelle en eenvoudige wijze van galzuur transport en dynamiek visualiseren in real-time. Zoogdierlijke expressieplasmiden die coderen CytoBAS NucleoBAS en zijn commercieel verkrijgbaar. Daarom kan deze biosensor verder bijdragen aan debegrip van galzuur transporters of verbindingen die FXR activeert en een dieper inzicht in galzuur biologie en signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tijdelijke transfectie
Opmerking: CytoBAS en NucleoBAS (Zie Materialen tabel) worden met succes toegepast in verschillende celtypes, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK en HEK293T cellen). De belangrijkste vereiste voor de sensor is dat moet worden uitgedrukt, waarbij het coderende DNA aan de cel voeren.
- Oogst cellen uit een 80% confluente 25 cm2 kolf. Verdun de cellen in compleet cultuurmedium geschikt voor de specifieke cellijn (10% FBS, 1% L-glutamine, 1% pen / strep voor U2OS en Huh7 cellen).
- Plaat cellen op de gewenste dichtheid in een steriele 8 goed chambered dekking van glas (0,8 cm 2). Streven naar een sub-confluente (60-80% samenvloeiing) laag van cellen op de dag van het experiment, hoewel dit niet essentieel.
- Voeg compleet cultuurmedium tot een eindvolume van 400 pl per putje. Laat cellen hechten gedurende 24 uur.
- Bereid de transfectie mix in een steriele buis door toevoeging van 0,5 ug NucleoBASof CytoBAS DNA tot 100 ul kweekmedium (serum / antibioticum gratis). Vortex goed. Voeg een transfectiereagens en meng door vortexen. Transfectiereagentia dat een optimale efficiëntie te geven zijn celtype afhankelijk en kunnen voorafgaande testen nodig.
- Gebruik bijvoorbeeld 2,5 pl 1 mg / ml polyethyleenimine (PEI) en incubeer de DNA / PEI meng gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de transfectie mengsel in druppeltjes om de cellen en meng door voorzichtig schudden van de wells plaat met de hand. Voeg 100 ul van het mengsel naar een goed van ~ 9,6 cm 2. Gebruik 10 ul van het transfectiemengsel individuele beeldvormende detector voor tijdelijk getransfecteerde cellen.
Opmerking: Na 24-48 uur wordt de cellen galzuur sensor expressie en kan worden gebruikt voor experimenten.
2. Stabiele Transfectie
- Oogst cellen uit een 80% confluente 25 cm2 kolf. Verdun pellet in compleet cultuurmedium geschikt voor de specifieke cellijn (10% foetaal Serum, 1% L-glutamine, 1% pen / strep voor U2OS en Huh7 cellen) tot een concentratie van 150.000 cellen per ml en voeg ongeveer 300.000 cellen per putje in een 6-well kweekplaat (2 ml eindvolume).
- Laat cellen hechten gedurende 24 uur.
- Bereid de transfectie mix in een steriele buis door het toevoegen van 0,5 ug CytoBAS of NucleoBAS DNA (Zie Materialen tabel) tot 100 pi kweekmedium (serum / antibioticum gratis). Vortex goed. Voeg een transfectiereagens en meng door vortexen.
- Gebruik bijvoorbeeld 2,5 pl 1 mg / ml polyethyleenimine (PEI) en incubeer de DNA / PEI meng gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van de transfectie mengsel in druppeltjes om de cellen en meng door voorzichtig schudden van de wells plaat met de hand. Omvatten altijd ongetransfecteerde controle bij het creëren van een stabiele cellijn.
- Kweek cellen O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
- Trypsinize cellen volgens het protocol van de fabrikant (Incubeer de cellen bij 37 ° C wi 1,5 ml voorverwarmde trypsine per 25 cm 2 celkweek) en draaien ze neer op 250 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 13 ml compleet cultuurmedium. Verdeel cellen over verschillende 10 cm diameter cultuur gerechten: 0,5 ml (lage dichtheid), 1,5 ml (medium density), en 4,5 ml (hoge dichtheid). Doe hetzelfde voor de resterende 6,5 ml.
- Voeg kweekmedium tot een eindvolume van 10 ml. Voor U2OS cellen gebruiken 800 ug / ml G418 voor plasmiden met neomycineresistentiecassette zoals CytoBAS en NucleoBAS constructen te selecteren op positieve cellen. Deze concentraties celtype afhankelijk en kan worden bepaald door het selecteren van de laagste antibioticum (G418) concentratie wanneer getransfecteerde cellen stierven binnen 2 tot 10 dagen (800 ug / ml G418 voor U2OS cellen).
- Vernieuwen het kweekmedium met de juiste antibiotica (G418) om de 72 uur, tot de niet-getransfecteerde cellen zijn dood.
- Onderzoek de cultuur plaat onder de microscoop met een 20X doelstellingpositieve kolonies (fluorescentie kan worden gecontroleerd met behulp van de meeste filter sets gebruikt voor groen, cyaan of geel fluorescentie).
- Markeren de positieve kolonies die geïsoleerd liggen uit andere kolonies met een pen aan de buitenkant bodem van de cultuur schotel.
- Was de plaat tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en zuig het. Rond 15 steriel klonen cilinders en dompel ze in steriele siliconen. Solliciteer ze rond de geselecteerde kolonies door licht te drukken tegen de petrischaal en zorg ervoor dat niet meer dan een kolonie is opgenomen in het klonen ring.
- Pipetteer 20 ul voorverwarmde trypsine (1x, 0,25%) in de klonering cilinder en incubeer bij 37 ° C totdat de meeste cellen zijn afgerond (observeren met een microscoop).
- Voeg 150 ul kweekmedium met serum en het geschikte antibioticum (10% FBS en 800 ug / ml G418 voor U2OS en Huh7 cellen) in de klonering cilinder en pipet op en neer meerdere malen om de cellen te resuspenderen en overbrengen in een 96-well plaat. Vernieuwen medium na 4-24 uur en laat cellen samenvloeiing groeien in de komende dagen (37 ° C, 5% CO 2 voor U2OS en Huh7 cellen).
- Vernieuwen medium met antibiotica om de 3 of 4 dagen. Wanneer de cellen zijn gegroeid confluent, overbrengen naar een groter goed plaat. Herhaal deze stap totdat de kweek is groot genoeg voor experimenten. Cryopreserve enkele flacons voor back-up. Cryopreservatie medium bestaat uit 20% FBS en 20% DMSO in medium (DMEM) zonder supplementen.
Opmerking: Nu, de cellijn is monoklonale en beschouwd stabiel voor het uitdrukken van de Bile Acid Sensor. De helft van de concentratie van het antibioticum G418 (400 ug / ml) is nu voldoende is om expressie in de stabiele cellijn te handhaven.
3. Lentivirale Transduction
Opmerking: Sommige cellijnen zijn moeilijk geacht transfecteren met meer traditionele werkwijzen zoals polyethyleenimine (PEI) methode. Virale transductie van cellen is een efficiënt alternatief instrument fof gen-aflevering en stabiele transgenexpressie.
- Oogst cellen uit een 80% confluente 25 cm2 kolf. Verdun de cellen in compleet cultuurmedium geschikt voor de specifieke cellijn (10% FBS, 1% L-glutamine, 1% pen / strep voor U2OS en Huh7 cellen) en voeg ongeveer 200.000 cellen per putje in een 6-well kweekplaat.
- Voeg kweekmedium tot een eindvolume van 2 ml per putje. Laat cellen hechten gedurende 24 uur.
- Voeren virale transducties door incubatie cellen voor 4-6 uur met 500 pi CytoBAS lentivirus medium (op aanvraag) die gevuld tot een totaal bedrag van met volledig kweekmedium 1 ml met 10 ug / ml diethylaminoethyl (DEAE) -dextran of een andere lentivirale transductie enhancer. Vergeet niet om een goed met niet getransduceerde controle cellen bevatten.
- Verwijder medium en voeg 2 ml compleet kweekmedium dat het gewenste antibioticum (500 ug / ml hygromycine). Gebruik een lentivirale construct voor CytoBAS transductie die voorziens hygromycine resistentie aan cellen. Groeien cellen onder gewenste omstandigheden.
- Vernieuwen medium met (500 ug / ml hygromycine) antibiotica om de 3 dagen en de splitsing van de cellen bij 80% confluent, totdat alle negatieve controle cellen zijn dood (duurt ongeveer 1-2 weken voor de meeste cellijnen). De cellijn wordt nu beschouwd als stabiel voor het uitdrukken van de Bile Acid Sensor.
- Of gebruik cellen voor experimenten 1-3 dagen na virale transductie. Als levend virus aanwezig zou kunnen zijn, vereist dit FRET-uitlezing apparatuur in ruimtes met de juiste veiligheidsniveau.
- Als alternatief voor de snelle isolatie van stabiele cellijnen te voeren fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
- Oogst cellen uit confluente 160 cm2 kolf.
- Verdun de cellen in kweekmedium Leibovitz (L-15 medium) met <5% serum tot een concentratie van maximaal 5 x 10 6 cellen per ml
- Voor het verzamelen van de gesorteerde cellen, vul FACS buizen met 1 ml van de collectie medium (L-15 medium + 1,5% pen / strep, 1% L-glut en 20% serum).
- Soort cellen voor citrien (520-580 nm) of cerulean (450-520 nm), enthousiast met 405 laser.
- Na het sorteren ongeveer 500.000 cellen, spin down-cellen (5 min, 250 x g) en resuspendeer ze in 5 ml normale compleet kweekmedium (10% FBS, 250 ug / ml Hygromycine voor U2OS en Huh7 CytoBAS cellen) en de plaat ze in een T25 cultuur kolf. Kweek de cellen onder gewenste omstandigheden (37 ° C, 5% CO2 gedurende U2OS en Huh7 cellen).
4. Live-cell imaging van de Bile Acid Sensor
Opmerking: Cellen die galzuur transporters kunnen gekweekt in medium met 1-10% houtskool gefiltreerd serum dat lipofiele stoffen te verwijderen. Normaal serum bevat vaak galzuren die kunnen leiden tot intracellulaire accumulatie galzuur en verzadiging van de Bile Acid sensor.
- FRET metingen met de confocale microscoop
- Plaat de cellen stabiel of Transiently uiting van de sensor op de gewenste dichtheid in een steriele 8 goed dekglaasje bodem kamer slide (0,8 cm 2). Groeien cellen in compleet cultuurmedium (met houtskool gefilterd serum) dat op de dag van het experiment confluentie is ongeveer 60-70%.
- Was de hechtende cellen in de kamer slide een keer met 200 ul 1x PBS of Leibovitz L-15 kweekmedium.
- Aspireren en vervangen door 300 gl Leibovitz L-15 kweekmedium zodat geen CO 2 controle nodig.
Opmerking: DMEM zonder fenolrood kan ook worden gebruikt, maar vereist CO 2 gebufferde omstandigheden. Het galzuur sensor shows (sommige) pH-gevoeligheid zodanig beogen de pH constant tijdens de dataverzameling houden. - Verdun de verbindingen voor gebruik in de confocale beeldvormende experiment ook L-15 kweekmedium. Rekening mee dat tijdens beeldvorming, betrekkelijk grote hoeveelheden vloeistof in de kamers moeten worden toegevoegd om een snelle vermenging van het monster (50-100 ui) verzekeren,dus zorg 3-5x oplossingen.
- Start de imaging software van een confocale microscoop met een 37 ° C incubatiekamer en zet de violette 405 nm laser. Doe een druppel immersie olie op het doel en de plaats van de 8-kamer op de top van het. Voor enkele cel beeldvorming van FRET, gebruik maken van de 63x olie doelstelling. De sensor is met succes gebruikt bij KT, maar celgedrag zouden kunnen worden gewijzigd.
- Zet de instellingen van de confocale microscoop goed.
- Stel Acquisitie modus: XYT (time-lapse beeldvorming van enkele focal plane).
- Acquire beelden bij 20 sec intervallen om verbindingen toe te voegen tussen de overnames zonder te pauzeren het experiment.
- Stel spectrale bereik voor emissie-detectie: Cerulean: 450-520 nm; Citrien: 520-580 nm.
- Focus op de enkele cel laag met behulp van transilluminatie licht. Start beeldvorming en de z-positie nauwkeuriger regelen. Pas gain en offset voor elk kanaal om het signaal te onderscheiden van de achtergrond, terwijl blijvening ver onder verzadiging voor alle pixels in cellen van belang.
- Teken cirkels om het gebied van belang (ROI) te bepalen. Selecteer cellen die vergelijkbare fluorescentie-intensiteit vertonen. Vermijd cellen die duidelijk afwijken van de gemiddelde cel grootte en vorm. Blootstellen van de cellen aan licht van een zo kort mogelijk fotobleken van de sensor te minimaliseren. Het is raadzaam om ROI niet dichtbij de cel perimeter trekken. Dit gebied is het meest gevoelig voor veranderingen in fluorescentie-intensiteit als gevolg van focale drift (cellen bewegen in z-richting) waardoor het moeilijker om veranderingen in fluorescentie verhouding tijdens het experiment te volgen.
- Begin metingen met de confocale microscoop. Wacht totdat de cerulean en citrien fluorescentie is stabiel.
- Voeg 50-100 ul galzuren of andere verbindingen op gekozen tijdstippen tijdens de meting. De relatief grote hoeveelheden vloeistof (een vijfde tot een derde van het uiteindelijke volume) moeten de vloeistoffen goed te mengen (binnen 10 seconden) zijn zonder schudden / pipetting omhoog en omlaag. Zorg ervoor dat de rand van de 8-well kamer met de pipetpunt niet aan te raken en voeg de vloeistof langzaam, zodat de cellen niet uit de focus. Geen nieuwe verbindingen niet toe te voegen voordat het plateau fase is bereikt. Dit duurt ongeveer 200 sec.
- Eindigen elk experiment met de toevoeging van 100 ul GW4064, eind concentratie 5-10 micrometer (sensor verzadigende dosis) en wacht tot de sensor fluorescentie stabiel is.
- Sla het experiment en de gegevens exporteren als een AVI-bestand.
- Open in ImageJ beide AVI-bestanden (kanaal 00, cerulean, kanaal 01, citroengeel) door het selecteren Plugins> Stapels> Stapel interleaver. Als alternatief, import confocale bestand (bijv .lsm of .lif bestanden) direct in Afbeelding J met behulp van geschikte plug-ins (beschikbaar op http://www.openmicroscopy.org) en ga naar stap 4.1.14.
- Voor Stack 1: gebruik Channel 01 (citrien).
- Voor Stack 2: gebruik Channel 00 (cerulean).
- Klik op Bewerken> Selectie> Addtot manager, om de ROI manager te openen. Controleer de checkbox 'Show All'.
- Trek een paar regio's van belang (ROI) voor specifieke cellen met de ovale selectie tool. Ook trekt een cirkel in een gebied buiten de cellen of in een cel die de sensor niet te betuigen aan de achtergrond signaal te bepalen. Het is raadzaam om ROI niet vlakbij de cel perimeter in experimenten trekken wanneer veranderingen in fluorescentie-intensiteit als gevolg van focale drift (cellen bewegen in z-richting) of celmigratie waren duidelijk.
- Selecteer één cel. Klik op Plugins> Ratio Profiler. Dit resulteert in 3 schermen: RAW, ratio en Ratio_Profile. De RAW-venster toont de toename van de intensiteit van de citrien (blauwe lijn) en een daling van cerulean (rode lijn) als er FRET. De verhouding venster geeft informatie over de verhouding citroengeel / cerulean, die toeneemt met een toename van FRET. Het venster Ratio_Profile geeft de werkelijke aantallen van fluorescentie-intensiteit gemeten in beide kanalen. Als Microsomgaan setup-specifieke bestanden (bijvoorbeeld .lsm of .lif plaats van AVI) bestanden worden gebruikt het kanaal volgorde kunnen worden teruggedraaid.
- Kopieer de gegevens van het raam Ratio_Profile in de spreadsheet bijgevoegd als aanvullende data. Doe hetzelfde voor alle andere cellen (en achtergrond ROI).
Opmerking: In de online spreadsheet alle gegevens genormaliseerd naar de toestand waarbij BAS maximale activering wordt verwacht. Aangezien GW4064 is de meest potente activator van FXR, wordt de fluorescentieverhouding na incubatie met een overschot van GW4064 ingesteld op 1. Daarom is het belangrijk om alle experimenten eindigen met toevoeging van GW4064. Het voordeel hiervan is dat de gegevens niet langer afhankelijk laserintensiteit of detector versterking en experimenten op verschillende dagen kan gemakkelijker worden vergeleken. Bovendien, in de onderste grafiek van de spreadsheet, een lopend gemiddelde kan worden gebruikt om de curven voor experimentele noise glad. Echter, deze grafiek niet gebruiken bij het analyseren van kinetische gegevens, omdat de lopende AveraGE zal ook glad snel kinetische reacties.
- FRET metingen met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)
- Verdun alle verbindingen voor de FACS experiment in steriele FACS opname buffer (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN3 en 10 mM D-glucose).
- Oogst cellen uit een 80% confluente T-160 cm 2 celkweek kolf gebruikt 5 mM EDTA in PBS. Centrifugeer cellen bij 250 g gedurende 5 min. Was celpellet 2 x in 5 ml FACS-buffer bij kamertemperatuur opname.
- Tellen cellen met behulp van de kouter balie of een telkamer.
- Verdun pellet in FACS opnamebuffer tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Pipet op en neer om een homogene suspensie van individuele cellen te creëren. Als cellen zijn moeilijk te splitsen, zet de monsters door een cel zeef vóór sortering aan nozzle verstoppingen te minimaliseren.
- Pipet 200 pi cellen per FACS buis en hen te beschermen tegen licht.
- Voeg de gewenste concentratie van de verbinding (bv, Galzuren, synthetische FXR liganden transporter inhibitors). Vortex. Incubeer 20-30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden (in het donker).
- Ondertussen start de FACS (de lasers hebben tijd nodig om op te warmen).
- Stel de flowcytometrie gating parameters van het experiment (zie figuur 3):
- Laden rond 100,000-200,000 NucleoBAS of CytoBAS getransfecteerde cellen om de poorten te bepalen.
- Stel eerst de FSC en SSC spanningen aan de cellen plot in het midden van het perceel.
- Met behulp van de violette laser, pas de cerulean (450/40 nm) spanning en citrien (525/20 nm) spanning en ervoor zorgen dat alle NucleoBAS of CytoBAS positieve cellen worden uitgezet binnen de scatter plot.
- Stel de juiste poorten (Poort P1 tot P4 Poort), zie Figuur 4.
- Gebruik poort P1 om dode cellen, meestal weergegeven in de linker benedenhoek te sluiten door het selecteren van de belangrijkste bevolking in het midden van het SSC-A / FSC-A plot.
- Gebruik poort P2 inhet FSC-H / FSC-A venster duplets uit de analyse te verwijderen. Enkele cellen worden gepresenteerd in een diagonale lijn dan wambuizen.
- Poort P3 in de citrien (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) venster kan worden gebruikt om positieve cellen te selecteren voor NucleoBAS / CytoBAS door gating citrien en Cerulean hoge cellen, toonde een populatie diagonaal in de rechterbovenhoek van Het plot.
- Trekken poort P4 in de linkerbovenhoek van de bevolking, zo dicht mogelijk en zorg ervoor dat niet meer dan 5% van de cellen binnen deze poort vallen.
- Laden sommige ongetransfecteerde cellen (geen expressie van CytoBAS of NucleoBAS) om auto-fluorescentie te bepalen. De ongetransfecteerde bevolking kan zich niet in de poort P3. Pas poort P3 wanneer dat nodig is om auto-fluorescerende cellen uit te sluiten.
- Vortex de monsters voordat u de buizen in de FACS. Voor elk monster te meten ten minste 10.000 cellen in de poort P3.
Opmerking: De Bevolking Hiërarchie venster geeft het aantal gebeurtenissenwordt weergegeven voor elke poort en% van de ouder gate. In gate 4, het% van de ouder bepaalt cellen met verhoogde citrine / cerulean als percentage van NucleoBAS positieve cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De FRET-BAS sensor weergegeven is gebaseerd op de ligand-bindende domein van FXR (LBD-FXR) bevestigd aan twee fluoroforen citrine en cerulean) en een LXXLL-motief. Deze sensor maakt onderzoek naar galzuur transport in levende cellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie (Figuur 1 A). Mutaties in cerulean en citrien toegepast om de vorming van de intramoleculaire complex (figuur 1 B) te bevorderen. Galzuren en andere FXR liganden binden aan FXR en daardoor de afstand tussen citrien en cerulean veranderen door een conformationele verandering. In levende zoogdiercellen resulteert in een verhoogde FRET-efficiëntie (citroengeel verhogen, cerulean afname) (Figuur 1 C, 1 D). Tijdens een live-cell kwantitatieve intensiteit gebaseerde FRET experimenteren met de confocale microscoop, it waargenomen dat taurochenodeoxycholinezuur (TCDCA) behandeld (30 uM) U2OS cellen die NucleoBAS ontbreekt galzuur transporters hebben veranderingen in FRET vertonen, terwijl de gemiddelde citroengeel / cerulean verhouding aanmerkelijk verhoogd na behandeling met GW4064 (5 pM) (Fig 1 C). Daarentegen U2OS cellen co-expressie NucleoBAS, NTCP en OSTαβ had een duidelijke toename citroengeel / cerulean verhouding na toevoeging van TCDCA en een nog grotere toename in verhouding na toevoeging van GW4064 (Figuur 1 D). Dit toont aan dat TCDCA is niet door het celmembraan passeren en vereist specifieke transporteurs om de cel te voeren.
Cellulaire lokalisatie van de sensor wordt bepaald door de aanwezigheid van specifieke lokalisatiesignalen. NucleoBAS is gericht naar de kern van nucleaire lokalisatiesignaal (Figuur <strong> 2 B), terwijl CytoBAS geen lokalisatiesignaal bevat en blijft derhalve het cytosol (figuur 2 A). De biosensor kan ook worden gecombineerd met beeldvorming van andere fluorescerende eiwitten, waarmee metingen eiwitexpressie / lokalisatie en FXR activatie in dezelfde cel. Bijvoorbeeld, Figuur 2 C toont U2OS cellen gecotransfecteerd met NucleoBAS en NTCP-mKate2. Bovendien kan de sensor worden gecombineerd met andere sensoren voor subcellulaire beeldvorming van meerdere parameters tegelijkertijd. Zo werd NucleoBAS uitgedrukt met TGR5 (EST IMAGE kloon # 5221127) en een cAMP cytosolische sensor (T Epac VV) 11 tot TGR5 en FXR activatie gemeten in dezelfde cel op hetzelfde moment. Bij TGR5 bindend, cAMP niveaus toegenomen in de cytosol, die werd gedetecteerd door de cAMP sensor, terwijl FXR activatie in de kern was vistegelijkertijd ualized. figuren 2D-F tonen een tijdreeks samengesteld uit 6 confocale beelden van NucleoBAS-TGR5- T Epac vv-cellen na behandeling met GW4064 (5 uM) (figuur 2 D), met TCDCA (10 pM) (Figuur 2E) of chenodeoxycholinezuur (CDCA) (10 M) (figuur 2 F) op t = 0. De groene kleur staat voor regio's waar de emissie verhouding 525/450 nm wordt verlaagd (die cAMP elevatie) en de roze kleur betekent een stijging van de emissie ratio (FXR activering), in vergelijking met de ratio begin van het experiment.
Bovendien kan flowcytometrie worden gebruikt om een pool van cellen op enkele celniveau of high-throughput screening van de gehele populatie te screenen. U2OS cellen die NucleoBAS waren Excited met een violette laser 405 nm en de fluorescentie werd opgevangen in de 450/40 bereik voor Cerulean en 525/20 bereik voor citrien. Om de efficiëntie van FACS-gebaseerde FRET experimenten te verbeteren, moet goede gates worden ingesteld (figuur 3). De P1 poort sluit cel puin en de P2 poort verwijdert duplets uit de analyse. Vervolgens wordt de analyse beperkt tot citrien (enthousiast met 488 laser) en cerulean (enthousiast met 405 laser) positieve cellen door poort 3. Tot slot, poort P4 vertegenwoordigt het percentage cellen met een hoge citrien / cerulean emissie verhouding (met excitatie van Cerulean bij 405 nm laser). Voor elk monster werden ten minste 10.000 cellen die binnen gate 3 viel gemeten.
Vervolgens werd FACS-gebaseerde FRET doorstroomcytometrie gebruikt om een toename van FRET in levende cellen na 30 min incubatie met TCDCA en GW4064 berekenen. Niet-behandelde U2OS cellen die NucleoBAS toonde <5% cellen in de poort P4 (citrien / cerulean hoge cellen). Bij gebrek aan galzuur transporters, werd een vergelijkbaar percentage waargenomen bij 30 uM TCDCA behandelde cellen (Figuur 4 A). Daarentegen cel co-expressie NucleoBAS, NTCP en OSTαβ toonde een verhoogde hoeveelheid citroengeel / cerulean hoog cellen van ongeveer 38%. Na toevoeging van 10 uM GW4064, bijna 90% van de cellen citroengeel / cerulean hoog ongeacht expressie van OSTαβ of NTCP (Figuur 4 B). Gegevens kunnen in staafdiagrammen (% cellen in poort 4, 4 populatie) (Figuur 4 C, D) of populatie histogrammen van citroengeel-hemelsblauw verhouding (figuur 4 E, F) worden gepresenteerd.
FIGUUR 1. Ontwerp van de Bile Acid Sensor (BAS). (A) Structurele representatie van de werking van een genetisch gecodeerd Bile Acid Sensor. Het bestaat uit een donor fluorofoor (cerulean) en een acceptor fluorofoor (citroengeel) verbonden via de FXR-LBD en gefuseerd met een FXR-cofactor peptide (LXXLL-motief). (B) Schematische domein architectuur van het BAS. De Q204F / V224L fluorofoor mutaties bevorderen van de vorming van intramoleculaire interacties tussen Cerulean en citrien. De NucleoBAS construct bevat een C-terminale nucleair lokalisatiesignaal (NLS) en hoopt zich dus in de kern, terwijl de CytoBAS construct mist elke doelsequentie en daarom toont cytosolische lokalisatie. (C) Representatieve confocale gebaseerde FRET experimenteren BAS als een instrument om geconjugeerde galzuurtransport volgen. Geen verandering in citrien / cerulean ratio wordt waargenomen na 30 uM TCDCA toevoeging in cellen alleen expRessing NucleoBAS. Wanneer 5 uM GW4064 werd toegevoegd, werd een sterk verhoogde citrien / cerulean verhouding waargenomen. (D) Invoer van TCDCA (30 pM) resulteert in een aanzienlijke activering van de sensor NTCP en OSTαβ co-getransfecteerde cellen. Daaropvolgende GW4064 (5 uM) behandeling leidt tot een verdere toename van de citrien / cerulean ratio. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, n = 6 individuele cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Lokalisatie FRET-BAS construct in levende cellen. Confocale microscoop afbeeldingen U2OS cellen getransfecteerd met CytoBAS (A) of NucleoBAS (B). (C) U2OS cellen co-transfected met NucleoBAS en NTCP-mKate2. De schaal balk geeft 10 micrometer. (D - F) Tijd reeks NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV getransfecteerde cellen. (D) GW4064 activeert FXR (verhoogde 525/450 nm-verhouding), maar niet TGR5. (E) TCDCA activeert TGR5 op de plasmamembraan (verminderde 525/450 nm ratio), maar niet de cel FXR in de kern te activeren voeren. (F) CDCA activeert TGR5 op het plasmamembraan evenals FXR in de kern (verhoogd 525/450 nm verhouding in de kern, daalde in het cytoplasma). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Flowcytometrie gating parameters. (A) De P 1 poort in de SSC-A / FSC-A venster wordt gebruikt om dode cellen uit te sluiten. (B) In het FSC-H / FSC-A-venster, wordt de P2 poort getrokken doublet gebeurtenissen uit de analyse te verwijderen. (C) In de citrien (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) venster, NucleoBAS (en CytoBAS) positieve cellen worden geselecteerd (Gate P3). (D) Tot slot, in de citrien (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) venster, de P4 poort bevat citrien / cerulean hoge cellen van de FACS experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Figuur 4. Vertegenwoordiger FACS experiment galzuurtransport behulp NucleoBAS meten. (A >, B) FACS-percelen waaruit het bedrag van citrien / cerulean-hoge levensstandaard NucleoBAS expressie U2OS cellen (A) en U2OS cellen co-uitdrukken NucleoBAS, OSTαβ en NTCP (B) na behandeling met controle buffer (links), 30 uM TCDCA (midden) of 10 pM GW4064 (rechts). (C, D) staafdiagram percentage citroengeel / cerulean hoog cellen na 30 min incubatie met TCDCA of GW4064 in U2OS cellen die NucleoBAS en gecotransfecteerd met (D) of zonder (C) OSTαβ en NTCP. (E, F) Histogram toont de verdeling van citrien / cerulean verhouding in een populatie van cellen die NucleoBAS U2OS met of zonder OSTαβ en NTCP na 30 min incubatie met TCDCA (geel), GW4064 (rood) of controle buffer (blauw). Alle voorwaarden werden drie keer gemeten. Staven stellen gemiddelde waarden + standaarddeviatie (SD) (n = 3).TTP's: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende File 1:. Template BAS algemene Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende File 2:. Template BAS Zeiss Leica geïmporteerde data Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een nieuwe genetisch gecodeerde galzuur sensor voor de controle van de spatiotemporele dynamiek van galzuur transport in levende cellen. Deze biosensor bestaat uit hemelsblauw en citroengeel fluorescente eiwitten die zijn gefuseerd aan FXR-LBD, waardoor een FRET-gebaseerde galzuur sensor (BAS) vormen.
Het galzuur sensor is relatief eenvoudig en gemakkelijk in gebruik wanneer dat algemene ervaring met celkweek en FACS of (confocale) microscopie. Echter, kunnen sommige aspecten wat problemen shooting vereisen. Bij gebruik van galzuur sensor in combinatie met galzuurbindende transporters, wordt aanbevolen om cellen te kweken in medium met houtskool gefiltreerd serum. Kool vermindert verder galzuren niveau door adsorptie uit het serum. Vooral bij aanwezigheid importeurs als NTCP, is cruciaal voor verzadiging van de sensor tijdens het kweken te voorkomen, aangezien dit de meest voorkomende oorzaak van een ongevoelige sensorbij experimenten. Daarom is een andere sensor is gemaakt (NucleoBAS N354K / I372V) met mutaties wijziging van de gevoeligheid voor galzuren, het creëren van een groter dynamisch bereik 8. Om te bepalen of de sensor reeds verzadigd is, kan het citroengeel / cerulean verhouding vergeleken met de verhouding in controle cellen niet beperkt geen galzuur transporters, aangezien deze cellen worden verondersteld lage intracellulaire galzuur niveaus. Als alternatief kan fluorescentie-lifetime imaging microscopie (FLIM) metingen worden uitgevoerd om FRET onderzoeken in een intensiteit-onafhankelijke wijze 12. Deze techniek is buiten de reikwijdte van dit document, en vereist meer gespecialiseerde apparatuur. Andere redenen voor een ongevoelige sensor omvatten het gebruik van cellen die auto-fluorescentie en / of expressie verloren NucleoBAS. Opmerkelijk kunnen fluctuaties in de intensiteit van hemelsblauw en citroengeel (bijvoorbeeld door focale verschuivingen) gedurende het experiment verduisteren directe visualisatie van FRET veranderingen tijdens beeldvorming, terwijlratiometrische de aard van de sensor laat immers bewaking van galzuur dynamiek. Vaak absolute intensiteit veranderingen bescheiden individuele fluoroforen na toevoeging van FXR liganden, terwijl de toename in verhouding evident.
Voor FRET analyse in cellen die met de BAS-sensor, moeten passende laserlicht en filters worden geselecteerd. De toename van citrien intensiteit tijdens FRET moet worden gemeten met de violet diode (405 nm) laser met emissie gevolgd gedurende 450-520 (cerulean) en 520-580 (citrien). Een belangrijk aspect rekening te houden met de gevoeligheid van de sensor fotobleken. Wanneer de intensiteit van één of beide fluoroforen langzaam af in de tijd zonder toevoeging van liganden, vaak aangeeft fotobleken. Dit verschijnsel treedt vooral op wanneer het laservermogen te hoog. Om dit ongewenste effect te vermijden, dient de lasers vermogen maximaal 5% van de volledige kracht en de cellen zo veel mogelijk donker bewaard. Beperk hettijd om te zoeken naar de juiste cellen. Fluctuaties in fluorescentie-intensiteit kan ook worden veroorzaakt door focale drift in de z-as. Om dit tegen te gaan, kan de pinhole grootte worden verhoogd en is het raadzaam om ROI niet dichtbij de cel perimeter trekken.
De FRET sensor voor galzuren getest in verschillende celtypen (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK en HEK293T-cellen) die kunnen worden getransfecteerd en een stabiel fenotype. Echter, primaire en gedifferentieerde cellen zoals hepatocyten moeilijk te transfecteren en gebaseerd op hun eigenschappen stabiel te handhaven. Virale transductie kan helpen met moeilijk te transfecteren cellen (construct beschikbaar op aanvraag). We genereren momenteel een muis lijn gebruik van de sensor in vers geïsoleerde primaire cellen die snel dedifferentiate wanneer de cellen mogelijk maken.
Om de confocale beschreven experiment uit te voeren, is het noodzakelijk dat de geselecteerde cellijn is aanhanger van een cultuur schotel en groeit in een single cellaag. Cellen die groeien in suspensie of hechtende cellen die vrij gemakkelijk kunnen worden getrypsiniseerd, kan ook worden gemeten met de FACS. Tot slot, is het aangeraden om een cellijn zonder endogene galzuurtransport of synthese bij de analyse van een specifiek transport route te kiezen. Dat wil zeggen, bij het meten van de activiteit van bepaalde getransfecteerd (mutant) transporter eiwitten.
De gepresenteerde genetisch gecodeerd fluorescerende biosensor BAS is een waardevol instrument voor de bewaking van enkele levende cellen galzuurtransport. De BAS bevat een FXR-LBD dat geactiveerd wordt door een grote verscheidenheid van galzuren, waardoor beeldvorming van subcellulaire dynamiek van galzuren 8. Dit biedt een groot voordeel ten opzichte van het gebruik van andere technieken. Bijvoorbeeld, in-promoter aangedreven luciferase reporter assays, het luciferase-signaal is afhankelijk van de stabiliteit van de reporter in cellen, ondersteunt subcellulaire informatie, en de vernietiging van het monster
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
