Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

Published: January 4, 2016 doi: 10.3791/53659
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

Introduction

העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא בשימוש נרחב כדי להשיג הבנה טובה יותר של תפקודים תאיים בתאים חיים עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה 1. בסריג, אנרגיה מfluorophore תורם נרגש מועברת לfluorophore acceptor. סריג יעילות הוא תלוי מאוד על המרחק בין התורם fluorophore acceptor והאוריינטציה שלהם, ולכן קריאת נתונים רגישות של שינויי קונפורמציה המשפיעים על שני fluorophores. תופעה זו מנוצלת ליצירת חיישנים מבוססי סריג להדמיה של מולקולות קטנות. שינויים בריכוזם יכולים להיות במעקב עם עלייה / ירידה בשיעור של עוצמת פליטה של acceptor לעומת fluorophore התורם 2. לדוגמא, חיישני סידן מבוססי סריג מאפשרים זיהוי מהיר ויציב של ריכוזי סידן חופשיים בתאים חיים 3. יתרונות אחרים של חיישנים מבוססי סריג הם הדמיה בתאי חיים יחידים, לאיורש אינה הפולשנות, היכולת שלהם להיות ממוקד לסוגי תאים שונים ותאים סלולריים 4.

היבטים של דינמיקה של חומצות מרה תאיים רבים עדיין הם הבינו היטב. לדוגמא, מעט מאוד ידוע על בסיס תקנת המנגנון של תחבורת חומצות מרה מצומדות וunconjugated. קיימים טכניקות כדי לפקח על תחבורה זה בעיקר לעשות שימוש בכתבים מבוסס לוציפראז, חומצות מרה רדיואקטיבי, או אנלוגים של חומצות מרה ניאון. האחרון דורש שינוי של חומצות מרה, אולי משפיע על תכונותיהם. יש עיתונאים המבוסס על לוציפראז רזולוציה זמן עני. חוץ מזה, בטכניקות אלה לגרום לאובדן של המדגם ואינם ישימים להדמיה בתאים בודדים. לכן, זה יהיה מועיל להשתמש בשיטות המאפשרות הדמיה תא בודדת חי של פעילות תחבורה באמצעות חיישני סריג, במיוחד משום שהיא כוללת את היתרון של זיהוי 5 ratiometric, 6. בעוד גרסאות של CFP / טופס YFP הנפוץ ביותר בשימוש זוגות סריג, אסטרטגיות חדשות באמצעות Morange וmCherry נושא מוטציות עמותה עצמית-התרמה הובילה להרחבת ארגז הכלים סריג עם חיישני רומן, כוללים חיישן חומצות מרה אדום העביר 7.

יצרנו חיישן גנטי מקודד סריג מרה חומצה (BAS), שמורכב מfluorophore תורם (תכלת) וfluorophore acceptor (סיטרין) שהתמזגו עם תחום קולט X farnesoid (FXR) יגנד מחייב בעבר (FXR-LBD) ופפטיד המכיל מוטיב LXXLL 8. מקורבים זה פפטיד עם FXR-LBD באופן חומצה תלויה מרה. עם הפעלת FXR, המרחק בין סיטרין והתכלת ישנה עקב שינוי קונפורמציה. בשורות תאי יונקים, תוצאות FXR הפעלה בעלייה להבחין בבירור בסיטרין / היחס תכלת, בעוד החיישן המטוהר עובד בכיוון ההפוך וגורם ליחס סריג ירד על הפעלת FXR. חיישן זה (CytoBAS)מאפשר ניטור של דינמיקה של חומצות מרה cytosolic. על ידי תוספת carboxyl הטרמינל של מוטיבים מיקוד subcellular, מבנה BAS יכול להיות ממוקד לגרעין (NucleoBAS) וperoxisomes (PeroxiBAS), המאפשר מדידות של ריכוזי חומצות מרה בתאים סלולריים שונים. למרות התוספת של מוטיב מיקוד peroxisomal אינה פוגעת היענותה לחומצות מרה, FXR-ligands החדיר תאים לא לגרום לכל סריג שינויים של PeroxiBAS בתוך peroxisomes 8. כטבעו של פער זה אינו ידוע, הפרוטוקול להלן מתמקד בCytoBAS וNucleoBAS.

השימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה הודגם לאחרונה בתאים המכילים את מובילי כבד חומצות מרה Na פוליפפטיד שיתוף הובלה / taurocholate + (NTCP) ואלפא טרנספורטר המומס אורגני / בטא (OSTαβ) 8. NTCP היא היבואנית של חומצת מרה בכבד הקרן וOSTαβ הוא מרה מעיים basolateralטרנספורטר חומצה שיכול לתפקד גם כיבואן ויצואן תלוי בשיפוע של החומצות מרה אלקטרוכימיים הריכוז 9, 10. נתונים אחרונים הראו כי על תחבורת חומצות מרה על ידי NTCP ו / או OSTαβ, ניתן לצפות תגובות חזקות ומהירה ביחס סריג כתוצאה מאינטראקצית יגנד-FXR-LBD.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשיטות למדידת סריג כגון ניתוח confocal מיקרוסקופי ותא מופעל הקרינה מיון (FACS), לסמן את השלבים קריטיים, לטפל בבעיות פוטנציאליות ולדון שיטות חלופיות. שימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה, אינטראקציה עם חומצות מרה FXR-LBD ניתן לכמת ופיקוח ישיר בתאים חיים ומספקת שיטה מהירה ופשוטה של ​​הדמיה תחבורת חומצות מרה ודינמיקה בזמן אמת. פלסמידים ביטוי יונקים קידוד CytoBAS וNucleoBAS זמינים מסחרי. לכן, biosensor זה יכול עוד לתרום להבנה של מובילי חומצות מרה או תרכובות המפעילות FXR ולספק הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של חומצות מרה ואיתות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חלוף Transfection

הערה: CytoBAS וNucleoBAS (אנא ראה לוח חומרים) משמשים בהצלחה בכמה סוגי תאים, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ותאי HEK293T). הדרישה העיקרית לשימוש בחיישן היא שזה צריך לבוא לידי ביטוי, המחייב את ה- DNA הקידוד להיכנס לתא.

  1. קציר תאים וממחוברות 80% 25 סנטימטר 2 בקבוק. לדלל תאים במדיום התרבות השלם מתאימים לשורת התאים הספציפית (10% FBS, 1% L- גלוטמין, עט% 1 / סטרפטוקוקוס לתאי U2OS וHuh7).
  2. תאי פלייט בצפיפות הרצויה לתוך כוס סטרילית 8 לתאים גם כיסוי (0.8 סנטימטר 2). לשאוף תת-מחוברות (60-80% confluency) שכבה של תאים ביום של הניסוי, אם כי זה לא הכרחי.
  3. הוסף בינוני תרבות השלמה לנפח סופי של 400 μl בכל טוב. לאפשר לתאים לצרף למשך 24 שעות.
  4. מכין את תערובת transfection בצינור סטרילי על ידי הוספת 0.5 מיקרוגרם של NucleoBASאו DNA CytoBAS לשל מדיום תרבות 100 μl (אנטיביוטיקה סרום / חופשי). מערבולת היטב. הוסף מגיב transfection ומערבבים על ידי vortexing. ריאגנטים transfection שנותנים יעילות אופטימלית הם סוג תא תלויים ועשויים לדרוש בדיקה קודמת.
    1. לדוגמא, השתמש 2.5 μl של polyethylenimine 1 מ"ג / מיליליטר (PEI) והדגירה DNA / PEI לערבב במשך 15 דקות ב RT.
  5. מוסיף את תערובת transfection בטיפות לתאים ומערבבים בעדינות על ידי טלטול הצלחת גם ביד. להוסיף לתערובת 100 μl לטוב של ~ 9.6 סנטימטר 2. השתמש 10 μl של תערובת transfection לתאי הדמיה פרט לתאי transfected זמני.
    הערה: לאחר 24-48 שעות, תאים יבטאו את החיישן של החומצות מרה ויכולים לשמש לניסויים.

2. Transfection יציב

  1. קציר תאים וממחוברות 80% 25 סנטימטר 2 בקבוק. לדלל גלולה במדיום התרבות השלם מתאים לשורת התאים הספציפית (10% שור S העובריerum, 1% L- גלוטמין, עט% 1 / סטרפטוקוקוס לתאי U2OS וHuh7) לריכוז של 150,000 תאים לכל מיליליטר ולהוסיף סביב 300,000 תאים לכל גם בצלחת 6-גם תרבות (2 מיליליטר סוף נפח).
  2. לאפשר לתאים לצרף למשך 24 שעות.
  3. מכין את תערובת transfection בצינור סטרילי על ידי הוספת 0.5 מיקרוגרם של CytoBAS או NucleoBAS DNA (אנא ראה לוח חומרים) לשל מדיום תרבות 100 μl (סרום / אנטיביוטיקה ללא). מערבולת היטב. הוסף מגיב transfection ומערבבים על ידי vortexing.
    1. לדוגמא, השתמש 2.5 μl של polyethylenimine 1 מ"ג / מיליליטר (PEI) והדגירה DNA / PEI לערבב במשך 15 דקות ב RT.
  4. להוסיף לתערובת transfection בטיפות לתאים 100 μl ומערבבים בעדינות על ידי טלטול הצלחת גם ביד. תמיד כולל שליטת untransfected בעת יצירת שורת תאים יציבה.
  5. לגדל תאי O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  6. Trypsinize תאים על פי הפרוטוקול של היצרן (דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס wה- i מיליליטר 1.5 prewarmed טריפסין לכל 25 תרבית תאים 2 סנטימטר) ולסובב אותם ב 250 XG ב RT במשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend ב -13 מיליליטר של מדיום תרבות השלם. לחלק תאים על פני תרבות מנות קוטר 10 סנטימטרים שונות: 0.5 מיליליטר (צפיפות נמוכה), 1.5 מיליליטר (צפיפות בינונית), ו -4.5 מיליליטר (צפיפות גבוהה). לעשות את אותו הדבר עבור נותר 6.5 מיליליטר.
  7. הוסף בינוני תרבות לנפח סופי של 10 מיליליטר. לU2OS תאים, השתמש 800 מיקרוגרם G418 / מיליליטר לפלסמידים עם קלטת התנגדות neomycin כגון CytoBAS וNucleoBAS בונה כדי לבחור עבור תאים חיוביים. ריכוזים זה סוג תא תלוי ויכולים להיקבע על ידי בחירת האנטיביוטיקה הנמוכה ביותר (G418) ריכוז שבו תאי untransfected מתו בתוך 2 עד 10 ימים (G418 800 מיקרוגרם / מיליליטר לתאי U2OS).
  8. רענן מדיום התרבות עם האנטיביוטיקה המתאים (G418) כל שעה 72 עד תאי untransfected מתים.
  9. לבחון את צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ עם מטרת 20X למושבות חיוביות (הקרינה ניתן לנטר באמצעות רוב מערכות סינון המשמשות לירוק, ציאן או הקרינה צהובה).
  10. סמן את המושבות החיוביות שתשקרנה מבודדים ממושבות אחרות עם עט בתחתית החיצונית של צלחת התרבות.
  11. לשטוף את הצלחת פעמיים עם בופר פוספט (PBS) ולשאוב אותו. קח כ -15 צילינדרי שיבוט סטרילי ולטבול אותם לסיליקון סטרילי. ליישם אותם סביב המושבות שנבחרו על ידי לחיצה קלה על צלחת פטרי, ולוודא שמושבה יותר מאחד לא כלולה בטבעת השיבוט.
  12. Pipet 20 μl של טריפסין מראש חימם (1x, 0.25%) בגליל השיבוט ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שרוב התאים המעוגלים כלפי מעלה (להתבונן במיקרוסקופ).
  13. להוסיף 150 μl של מדיום התרבות עם סרום והאנטיביוטיקה המתאימה (10% FBS וG418 / מיליליטר 800 מיקרוגרם לתאי U2OS וHuh7) בגליל השיבוט וpipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי resuspend התאים ולהעביר ל96גם צלחת. רענן בינוני לאחר 4-24 שעות ולאפשר לתאים לגדול ומחוברות בימים הקרובים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לתאי U2OS וHuh7).
  14. רענן בינוני עם אנטיביוטיקה כל 3 או 4 ימים. כאשר התאים גדלו ומחוברות, להעביר אותם לצלחת גם גדולה יותר. חזור על פעולה זו עד לתרבות היא גדולה מספיק לניסויים. Cryopreserve כמה בקבוקונים לגיבוי. מדיום הקפאה מורכב של 20% FBS וDMSO 20% בתקשורת (DMEM) ללא תוספים.
    הערה: עכשיו, שורת התאים היא חד שבטי ונחשבים יציב לביטוי חומצות מרה החיישן. מחצית ריכוז G418 האנטיביוטי (400 מיקרוגרם / מיליליטר) הוא החברה מספיק כדי לשמור על ביטוי בשורת התאים היציב.

3. lentiviral התמרה

הערה: שורות תאים מסוימות נחשבות קשה transfect על ידי שיטות מסורתיות יותר כגון polyethylenimine שיטה (PEI). התמרה ויראלית של תאים היא F כלי חלופי יעילאו גן-אספקה ​​וביטוי transgene יציב.

  1. קציר תאים וממחוברות 80% 25 סנטימטר 2 בקבוק. לדלל תאים במדיום התרבות השלם המתאימים לשורת התאים הספציפית (10% FBS, 1% L- גלוטמין, עט 1% / סטרפטוקוקוס לתאי U2OS וHuh7) ולהוסיף סביב 200,000 תאים לכל גם בצלחת תרבות 6 היטב.
  2. הוסף בינוני תרבות לנפח סופי של 2 מיליליטר לכל טוב. לאפשר לתאים לצרף למשך 24 שעות.
  3. בצע transductions הנגיפי על ידי תאים דוגרים במשך שעות 4-6 עם 500 CytoBAS μl lentivirus מכיל בינוני (זמין לפי בקשה) המלא עד לסכום כולל של 1 מיליליטר עם מדיום תרבות שלם המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר diethylaminoethyl (DEAE) -dextran או lentiviral אחר משפר התמרה. אל תשכח לכלול גם עם תאי שליטת untransduced.
  4. הסר בינוני ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום תרבות השלם המכיל אנטיביוטיקה הרצויה (500 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin). השתמש במבנה lentiviral עבור התמרה CytoBAS המספקותשל hygromycin התנגדות לתאים. לגדל תאים בתנאים רצויים.
  5. רענן בינוני עם (hygromycin / מיליליטר 500 מיקרוגרם) אנטיביוטיקה כל 3 ימים ולפצל את התאים כאשר 80% ומחוברות, עד שכל תאי הבקרה השליליים מתים (לוקחת בערך 1-2 שבועות עבור רוב שורות תאים). שורת התאים נחשבת כיום יציבה לביטוי חומצות מרה החיישן.
    1. לחלופין, להשתמש בתאים לניסויים 1-3 ימים לאחר התמרה ויראלית. כנגיף חי עשוי להיות נוכח, זה דורש ציוד סריג-קריאת נתונים בחדרים עם רמת הבטיחות המתאימה.
  6. לחלופין, לבידוד מהיר של שורות תאי יציבות, לבצע תא הקרינה מיון מופעל (FACS).
    1. קציר תאים וממחוברות 160 סנטימטר 2 בקבוק.
    2. לדלל תאים במדיום תרבות ליבוביץ (L-15 בינוני) עם <סרום 5% לריכוז של 5 x 10 6 תאים מרביים לכל מיליליטר
    3. לאוסף של תאים ממוינים, למלא צינורות FACS עם 1 מיליליטר של מדיום אוסף (L-15 בינוני + 1.5% עט / סטרפטוקוקוס, 1% L-שפע וסרום 20%).
    4. תאי מיין לסיטרין (520-580 ננומטר) או תכלת (450-520 ננומטר), נרגשים עם 405 לייזר.
    5. לאחר המיון כ -500,000 תאים, ספין למטה תאים (5 דקות, 250 XG) וresuspend אותם 5 מיליליטר מדיום תרבות השלמה רגיל (10% FBS, 250 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin לתאי U2OS וHuh7 CytoBAS) וצלחת אותם בתרבות T25 בַּקבּוּק. לגדל תאים בתנאים רצויים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לתאי U2OS וHuh7).

4. הדמיה של תא חי חומצות מרה החיישן

הערה: תאים המכילים מובילי חומצות מרה יכולים להיות מתורבתים במדיום עם סרום-מסונן פחם 1-10% שמסיר תרכובות lipophilic. סרום נורמלי לעתים קרובות מכיל חומצות מרה שעלולות להוביל להצטברות תאית חומצות מרה ורוויה של חומצות מרה החיישן.

  1. מדידות סריג באמצעות מיקרוסקופ confocal
    1. צלחת התאים ביציבות או transiently מבטא את החיישן בצפיפות הרצויה לתא שקופיות coverslip תחתית 8 גם סטרילי (0.8 סנטימטר 2). לגדל תאים במדיום התרבות שלם (תוך שימוש בסרום-מסונן פחם), כך שביום של הניסוי, confluency הוא סביב 60-70%.
    2. לשטוף את התאים חסיד בתא שקופית אחת עם 200 μl 1x של PBS או ליבוביץ L-15 בינוני תרבות.
    3. לשאוב ולהחליף עם 300 μl L-15 בינוני התרבות של ליבוביץ, כך שאף CO 2 שליטה היא צורך.
      הערה: DMEM ללא פנול אדום יכול לשמש גם אבל דורש CO 2 תנאים שנאגרו. מופעי חיישן חומצות מרה (חלק) pH-רגישות כל כך שואפים לשמור קבוע pH במהלך איסוף הנתונים.
    4. לדלל את התרכובות לשימוש בניסוי ההדמיה confocal גם בL-15 בינוני תרבות. קח בחשבון כי במהלך הדמיה, כמויות גדולות יחסית של נוזל בתאים שתתווספנה להבטחת ערבוב מהיר של המדגם (50-100 μl),כך להפוך את פתרונות 3-5x.
    5. הפעל את תוכנת ההדמיה של מיקרוסקופ confocal עם תא דגירה 37 ° C ולהפעיל את לייזר ננומטר הסגול 405. לשים טיפה של שמן טבילה על המטרה ומקום 8-קאמרי על גבי זה. עבור הדמיה תא בודדת של סריג, השתמש במטרת שמן 63X. החיישן שמש בהצלחה ב RT, אבל התנהגות תא עשויה להשתנות.
    6. הגדר את ההגדרות של מיקרוסקופ confocal כראוי.
      1. מצב להגדיר רכישה: xyt (זמן לשגות הדמיה של מטוס מוקד יחיד).
      2. לרכוש תמונות במרווחי זמן של 20 שניות כדי לאפשר תרכובות שיתווספו בין רכישות ללא הפסקת הניסוי.
      3. מגוון להגדיר רפאים לגילוי פליטה: Cerulean: 450-520 ננומטר; סיטרין: 520-580 ננומטר.
    7. להתמקד בשכבת התא בודדת באמצעות שקוף אור. התחל הדמיה ולהתאים את Z-העמדה מדויקת יותר. התאם רווח וקוזז לכל ערוץ להבחין אות מהרקע בזמן שיישארing הרבה מתחת רוויה לכל הפיקסלים בתאים של עניין.
    8. לצייר עיגולים להגדיר את האזור של העניין (ROI). בחר תאים המראים את עוצמת הקרינה דומה. הימנע תאים שכמובן שונה מהתא הממוצע בגודל ובצורה. לחשוף את התאים לאור במשך זמן קצר ככל האפשר כדי למזער photobleaching של החיישן. מומלץ לצייר ROIs לא קרובה מאוד למתחם התא. אזור זה הוא הרגיש ביותר לשינויים בעוצמת הקרינה עקב סחיפת מוקד (תאים הנעים בZ-כיוון) ולכן קשה יותר לעקוב אחר שינויים ביחס הקרינה במהלך הניסוי.
    9. התחל מדידות עם מיקרוסקופ confocal. חכה עד שהקרינה התכלת וסיטרין היא יציבה.
    10. להוסיף 50-100 חומצות μl מרה או תרכובות אחרות בנקודות זמן שנבחרו במהלך מדידה. הכמויות גבוהות היחסי של נוזל (חמישית לשליש מהנפח הסופי) נחוצות כדי לערבב את הנוזלים היטב (תוך 10 שניות) בלי ללחוץ / pipetting למעלה ולמטה. ודא שלא לגעת בקצה של חדר 8-גם עם קצה פיפטה ולהוסיף את הנוזל לאט כדי שהתאים לא מקבלים מחוץ לפוקוס. אל תוסיף תרכובות חדשות לפני שמגיע שלב הרמה. זה לוקח בערך 200 שניות.
    11. בסופו של כל ניסוי עם התוספת של 100 μl GW4064, ריכוז סוף 5-10 מיקרומטר (מינון להרוות חיישן) ולחכות עד שקרינת חיישן היא יציבה.
    12. שמור את הניסוי ולייצא את הנתונים כקובץ .AVI.
    13. פתוח בImageJ שני קבצי AVI (ערוץ 00, תכלת; ערוץ 01, סיטרין) על ידי בחירת interleaver התוספים> סטאקס> סטאק. לחלופין, קובץ confocal יבוא (למשל, .lsm או קבצי .lif) ישירות בתמונה J באמצעות תוספים מתאימים (זמינים בhttp://www.openmicroscopy.org) ולעבור לשלב 4.1.14.
      1. ל1 מחסנית: להשתמש בערוץ 01 (סיטרין).
      2. לסטאק 2: להשתמש בערוץ 00 (תכלת).
    14. לחץ על Edit> בחירה> הוסףלמנהל, כדי לפתוח את חלון מנהל החזר על השקעה. סמן את התיבה 'הצג הכל'.
    15. לצייר כמה אזורים של עניין (ROIs) מכסים תאים ספציפיים עם כלי בחירה הסגלגלים. גם לצייר מעגל אחד באזור שמחוץ לתאים או בתוך תא שאינו מבטא את החיישן כדי לקבוע את אות הרקע. מומלץ לצייר ROIs לא קרובה מאוד למתחם התא בניסויים כאשר שינויים בעוצמת הקרינה עקב סחיפת מוקד (תאים הנעים בZ-כיוון) או נדידת תאים היו ברורים.
    16. בחר תא אחד. לחץ על התוספים> Profiler יחס. זה יגרום 3 מסכי: RAW, יחס וRatio_Profile. חלון RAW מציג את העלייה בעוצמת סיטרין (קו כחול) וירידה בתכלת (קו אדום) אם יש סריג. חלון היחס נותן מידע על סיטרין היחס / התכלת, שיגדל עם עלייה בסריג. חלון Ratio_Profile נותן מספרים האמיתיים של עוצמת הקרינה שנמדדה בשני הערוצים. אם מיקרולהתמודד קבצי התקנה ספציפית (למשל, .lsm או .lif במקום .אבי) קבצים נמצאים בשימוש על מנת הערוץ עשוי להיות הפוכים.
    17. להעתיק את הנתונים מחלון Ratio_Profile בגיליון האלקטרוני המצורפים כנתונים משלימים. לעשות את אותו הדבר לכל תאים אחרים (והחזר על ההשקעה ברקע).
      הערה: בגיליון האלקטרוני המקוון, כל הנתונים הוא מנורמלים למצב שבו הפעלת BAS המרבי צפויה. בהתחשב בכך שGW4064 הוא activator החזק ביותר של FXR, יחס הקרינה לאחר דגירה עם עודף של GW4064 מוגדר 1. לכן חשוב לסיים את כל הניסויים עם תוספת של GW4064. היתרון של זה הוא שהנתונים הוא כבר לא תלויים בעוצמת לייזר או רווח גלאי וניסויים בימים שונים ניתן להשוות בקלות רבה יותר. יתר על כן, בגרף התחתון של הגיליון האלקטרוני, ממוצע פועל ניתן להשתמש כדי להחליק את הקימורים לרעש ניסיוני. עם זאת, אין להשתמש בגרף הזה בעת ניתוח הנתונים הקינטית, מאז avera פועלגם GE יהיה תגובות הקינטית מהירות חלקות.
  2. מדידות סריג באמצעות Cell הקרינה המופעל מיון (FACS)
    1. לדלל את כל התרכובות לניסוי FACS חיץ FACS סטרילי ספיגה (0.3 מ"מ EDTA, BSA 0.5%, 0.01% NaN 3 ו -10 מ"מ D-גלוקוז).
    2. קציר תאים מסנטימטר 2 בקבוק תרבות תא 80% ומחוברות T-160 באמצעות 5 מ"מ EDTA ב PBS. תאי צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות. 2x תא גלולה לשטוף במאגר ספיגת 5 מיליליטר FACS ב RT.
    3. ספירת תאים באמצעות דלפק קולטר או חדר ספירה.
    4. לדלל גלולה במאגר ספיגת FACS לריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. פיפטה מעלה ומטה כדי ליצור השעיה הומוגנית של תאים בודדים. אם תאים קשים משורש, לשים את הדגימות דרך מסננת תא לפני המיון כדי למזער קבקבי זרבובית.
    5. Pipet 200 תאי μl לכל צינור FACS ולהגן עליהם מפני אור.
    6. הוסף את הריכוז הרצוי של המתחם (למשל, חומצות מרה, ligands FXR הסינתטי, מעכבי טרנספורטר). מְעַרבּוֹלֶת. דגירה של 20-30 דקות ב RT בזמן הטלטול (בחושך).
    7. בינתיים, להתחיל FACS (הלייזרים זקוקים לזמן כדי להתחמם).
    8. הגדר את הזרימה cytometry הפרמטרים gating לניסוי (ראה איור 3):
      1. לטעון סביב 100,000-200,000 NucleoBAS או CytoBAS transfected תאים כדי לקבוע את השערים.
      2. להתאים את מתחי FSC וSSC ראשון לתכנן את התאים במרכז העלילה.
      3. השימוש בליזר הסגול, להתאים את התכלת (450/40 ננומטר) ערך מתח וסיטרין (525/20 ננומטר) מתח ולהבטיח שהתאים חיוביים כל NucleoBAS או CytoBAS הם זממו בתוך עלילת הפיזור.
      4. הגדר את השערים הנכונים (שער P1 עד השער P4), ראה איור 4.
        1. השתמש P1 שער שלא לכלול תאים מתים, בדרך כלל מוצגים בפינה השמאלית התחתונה על ידי בחירת האוכלוסייה העיקרית באמצע SSC-/ FSC-העלילה.
        2. להשתמש P2 שער בFSC-H / FSC-חלון כדי להסיר duplets מניתוח. תאים בודדים מוצגים בקו אלכסוני יותר מ כפילויות.
        3. שער P3 בסיטרין (525/20 ננומטר) / תכלת (450/40 ננומטר) חלון יכול לשמש כדי לבחור לNucleoBAS / CytoBAS תאים חיוביים, על ידי gating סיטרין ותאים גבוהים תכלת, אוכלוסייה מוצג באלכסון בפינה הימנית העליונה של העלילה.
        4. לצייר P4 שער בפינה השמאלית העליונה של האוכלוסייה, הקרובה ככל האפשר ולוודא שלא יותר מ 5% מהתאים ליפול בתוך השער הזה.
      5. לטעון כמה תאי untransfected (אין ביטוי לCytoBAS או NucleoBAS) כדי לקבוע אוטומטי הקרינה. אוכלוסיית untransfected לא יכולה להיות ממוקמת בP3 שער. התאם P3 שער בעת צורך להוציא תאים אוטומטיים ניאון.
    9. מערבולת הדגימות לפני הנחת הצינורות בFACS. עבור כל דגימה, למדוד לפחות 10,000 תאים בP3 שער.
      הערה: אוכלוסיית היררכית החלון נותן את המספר של אירועיםמוצג עבור כל שער ו% מהשער ההורה. בשער 4,% של ההורה קובע תאים עם סיטרין / יחס תכלת גדל כאחוז מכל NucleoBAS תאים חיוביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חיישן סריג-BAS מוצג מבוסס על יגנד המחייב תחום של FXR (LBD-FXR) מחובר לשני fluorophores סיטרין ותכלת) ומוטיב LXXLL. חיישן זה מאפשר חקירות תחבורת חומצות מרה בתאים חיים עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה (איור 1). מוטציות בתכלת וסיטרין יושמו כדי לקדם את הקמתו של מתחם intramolecular (איור 1 B). חומצות מרה וligands FXR האחר להיקשר לFXR ובכך לשנות את המרחק בין סיטרין ותכלת על ידי שינוי קונפורמציה. בחיים תאי יונקים, זה תוצאות ביעילות סריג מוגברת (עליית סיטרין, ירידה תכלת) (איור 1 ג, 1 ד '). במהלך ניסוי תא חי כמותיים המבוסס על עוצמת סריג עם מיקרוסקופ confocal, אנילא נצפה שחומצת taurochenodeoxycholic (TCDCA) -treated תאי U2OS (30 מיקרומטר) להביע NucleoBAS חסר מובילי חומצות מרה לא מראה שום שינויים בסריג, בעוד סיטרין / יחס התכלת הממוצע עלה פלאים לאחר הטיפול בGW4064 (5 מיקרומטר) (איור 1 C). לעומת זאת, תאי U2OS NucleoBAS להביע שיתוף, NTCP וOSTαβ לא להראות עלייה ברורה בסיטרין / יחס תכלת על תוספת של TCDCA, ועלייה גדולה עוד יותר ביחס לאחר תוספת של GW4064 (איור 1 ד '). זה מוכיח כי TCDCA אינו מסוגל לעבור דרך קרום התא ודורש מובילים ספציפיים להיכנס לתא.

לוקליזציה סלולרית של החיישן נקבעה על ידי הנוכחות של אותות לוקליזציה ספציפיים. NucleoBAS מיועד לגרעין על ידי אות הלוקליזציה הגרעינית (איור <strong> 2 ב '), ואילו CytoBAS אינו מכיל כל אות לוקליזציה ולכן נשאר בcytosol (איור 2). Biosensor יכול גם להיות משולב עם הדמיה של חלבוני ניאון אחרים, המאפשר מדידות של חלבון ביטוי / לוקליזציה והפעלת FXR באותו התא. לדוגמא, איור 2 C תערוכות התאים U2OS שיתוף transfected עם NucleoBAS וNTCP-mKate2. בנוסף, החיישן יכול גם להיות משולב עם חיישנים אחרים הדמיה subcellular של פרמטר אחד או יותר בו זמנית. לדוגמא, NucleoBAS בא לידי ביטוי יחד עם (IMAGE # שיבוט EST 5,221,127) TGR5 וחיישן cytosolic cAMP (T Epac VV) 11 למדוד TGR5 והפעלת FXR באותו התא באותו הזמן. על TGR5 מחייב, רמות cAMP עלו בcytosol שזוהתה על ידי חיישן המחנה, תוך הפעלת FXR בגרעין הייתה מולualized בו זמנית. דמויות 2D-F   להראות סדרת זמן מורכבת מ6 תמונות confocal של תאי NucleoBAS-TGR5- T VV Epac לאחר הטיפול בGW4064 (5 מיקרומטר) (איור 2 D), עם TCDCA (10 מיקרומטר) (איור 2 E) או בחומצת chenodeoxycholic (CDCA) (איור 2 F) בזמן t = 0. הצבע הירוק מייצג אזורים שבם יחס פליטת 525/450 ננומטר הוא ירד (המייצגים העלאת cAMP) והצבע הוורוד (10 מיקרומטר) מייצג עלייה בשיעור פליטה (הפעלת FXR), בהשוואה ל היחסים בתחילת הניסוי.

בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש מסך בריכה של תאים ברמת תא בודדת או כהקרנת תפוקה גבוהה באוכלוסייה כולה. תאי U2OS להביע NucleoBAS היו Excitאד עם לייזר ננומטר סגול 405 והקרינה נאסף בטווח 450/40 לטווח תכלת ולסיטרין 525/20. על מנת לשפר את היעילות של ניסויי סריג מבוסס FACS, יש להגדיר שערים נאה (איור 3). שער P1 כולל פסולת תא ושער P2 מסיר duplets מניתוח. בשלב הבא, הניתוח מוגבל לסיטרין (נרגש עם 488 לייזר) ותכלת (נרגשת עם 405 לייזר) תאים חיוביים בשער 3. לבסוף, P4 השער מייצג את אחוז התאים עם סיטרין הגבוה / יחס פליטת תכלת (באמצעות עירור של תכלת עם 405 ננומטר לייזר). עבור כל דגימה, לפחות 10,000 תאים שנפלו בתוך שער 3 נמדדו.

בהמשך לכך, cytometry זרימת סריג מבוסס FACS שימש לחישוב גידול בסריג בתאים חיים לאחר דגירה 30 דקות עם TCDCA וGW4064. תאי U2OS טופלו ללא להביע NucleoBAS הראו <5 תאי% בשער P4 (סיטרין / גתאי erulean-גבוה). בהעדר כל מובילי חומצות מרה, אחוז דומה נצפה ב -30 מיקרומטר תאי TCDCA טופל (איור 4). לעומת זאת, תא שיתוף להביע NucleoBAS, NTCP וOSTαβ עשו להראות כמות מוגברת של סיטרין / תאים תכלת-גבוהים של כ -38%. לאחר תוספת של 10 מיקרומטר GW4064, כמעט 90% מהתאים היו סיטרין / בלי קשר תכלת-גבוה של ביטוי של OSTαβ או NTCP (איור ב '4). ניתן להציג נתונים בגרפים בר (תאי% בשער 4, אוכלוסיית 4) (איור 4 ג ', ד) או כהיסטוגרמות אוכלוסייה של יחס סיטרין-תכלת (E איור 4, F).

איור 1

Figure 1. עיצוב של חומצות מרה החיישן (BAS). (א) ייצוג מבני של אופן פעולה של חומצות מרה חיישן מקודד גנטי. הוא מורכב מfluorophore תורם (תכלת) וacceptor fluorophore (סיטרין) צמוד באמצעות FXR-LBD והתמזג לפפטיד FXR-הקו-הפקטורים (מוטיב LXXLL). אדריכלות תחום סכמטי של BAS (B). מוטציות fluorophore Q204F / V224L לקדם את הקמתה של אינטראקציות בין intramolecular התכלת וסיטרין. מבנה NucleoBAS מכיל אות ג-מסוף לוקליזציה גרעינית (NLS) ולכן מצטבר בגרעין, ואילו מבנה CytoBAS חסר כל רצף מיקוד ולכן מציג לוקליזציה cytosolic. (ג) ניסוי סריג נציג מבוסס confocal עם BAS ככלי לניטור תעבורת חומצות מרה מצומדות. אין שינוי בסיטרין / יחס תכלת הוא ציין לאחר בנוסף TCDCA 30 מיקרומטר בתאים רק Expressing NucleoBAS. כאשר 5 מיקרומטר GW4064 נוסף, סיטרין / יחס תכלת מאוד מוגבר נצפה. (ד) יבוא של TCDCA (30 מיקרומטר) תוצאות בהפעלה ניכרת של החיישן בתאים-שיתוף transfected NTCP וOSTαβ. טיפול לאחר GW4064 (5 מיקרומטר) מוביל לעלייה נוספת בסיטרין / יחס תכלת. תוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן, n = 6 תאים בודדים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2

איור 2. סריג-BAS לוקליזציה לבנות בתאים חיים. תמונות מיקרוסקופ Confocal של תאי U2OS transfected עם CytoBAS () או NucleoBAS (B). שיתוף טראן תאים (C) U2OSsfected עם NucleoBAS וNTCP-mKate2. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. (D - F) סדרת זמן של תאי transfected NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV. (ד) GW4064 מפעיל FXR (יחס ננומטר עלה 525/450), אך לא TGR5. (ה) TCDCA מפעיל TGR5 על קרום הפלזמה (ירד 525/450 יחס ננומטר), אבל הוא לא הצליח להיכנס לתא כדי להפעיל FXR בגרעין. (F) CDCA מפעיל TGR5 על קרום הפלזמה, כמו גם FXR בגרעין (עלה 525/450 יחס ננומטר בגרעין, ירד בציטופלסמה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3

איור 3. Cytometry הזרימה paramete gatingRS. שער P 1 בSSC-/ FSC-החלון () משמש כדי לא לכלול את התאים המתים. (ב) בFSC-H / FSC-חלון, שער P2 נמשך לחסל אירועי כפיל מניתוח. (ג) בסיטרין (525/20 ננומטר) / תכלת (450/40 ננומטר) חלון, NucleoBAS (וCytoBAS) תאים חיוביים נבחרים (שער P3). (ד) לבסוף, בסיטרין (525/20 ננומטר) / תכלת (450/40 ננומטר) חלון, שער P4 מכיל סיטרין / תאים תכלת-גבוהים של ניסוי FACS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

איור 4

איור 4. ניסוי נציג FACS מדידת תחבורת חומצות מרה באמצעות NucleoBAS. ( >, B) FACS-חלקות המציגות את כמות סיטרין / תאי U2OS () ותאי U2OS להביע NucleoBAS-חיים תכלת-גבוה, OSTαβ וNTCP (ב ') לאחר NucleoBAS להביע שיתוף טיפול עם חיץ שליטה (משמאל), 30 מיקרומטר TCDCA (באמצע) או 10 מיקרומטר GW4064 (מימין). (C, D) אחוז מראה גרף בר של סיטרין / תאים תכלת-גבוהים לאחר דגירה 30 דקות עם TCDCA או GW4064 בתאי U2OS להביע NucleoBAS ושיתוף transfected עם (ד) או בלי OSTαβ (C) וNTCP. (E, F) היסטוגרמה המציגה את ההתפלגות של סיטרין / יחס תכלת באוכלוסייה של תאי U2OS להביע NucleoBAS עם או בלי OSTαβ וNTCP לאחר 30 דקות עם דגירה TCDCA (צהוב), GW4064 (אדום) או חיץ שליטה (כחול). כל התנאים נמדדו שלוש פעמים. ברים מייצגים + סטייה ממוצעת ערכים סטנדרטיים (SD) (n = 3).דף ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קובץ נוסף 1:. כללי BAS תבנית אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ נוסף 2:. תבנית BAS Zeiss יקה מיובא נתונים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש בחיישן של חומצות מרה רומן מקודדים גנטי מסוגל ניטור דינמיקת spatiotemporal תחבורת חומצות מרה בתאים חיים. biosensor זה מורכב מחלבוני ניאון תכלת וסיטרין שהם התמזגו לFXR-LBD, וכך יוצרים חיישן מבוסס סריג חומצות מרה (BAS).

חומצות מרה החיישן הוא יחסית פשוט ונוח בשימוש בעת צורך ניסיון בסיסי עם תרבות תא וFACS או במיקרוסקופ (confocal). עם זאת, כמה היבטים עשויים לדרוש קצת ירי צרות. בעת שימוש בחיישן של החומצות מרה בשילוב עם מובילי חומצות מרה, מומלץ לתאי תרבות במדיום עם סרום-מסונן פחם. פחם נוסף מפחית את רמות חומצות מרה על ידי ספיחה מהסרום. במיוחד בנוכחות יבואנים כגון NTCP, זה הוא חיוני כדי למנוע הרוויה של החיישן במהלך culturing, שכן זה הוא הגורם השכיח ביותר של חיישן רגישבמהלך ניסויים. לכן, חיישן אחר נוצר (NucleoBAS N354K / I372V) המכיל מוטציות לשנות את הרגישות לחומצות מרה, יצירת טווח דינמי גדול יותר 8. כדי להגדיר אם החיישן כבר רווי, סיטרין / יחס התכלת ניתן להשוות את היחס בתאי שליטה לא להביע כל מובילי חומצות מרה, שכן תאים אלה הם הניחו לי רמות חומצות מרה תאיות נמוכות. לחלופין, מיקרוסקופיה הדמיה הקרינה-חיים (FLIM) מדידות יכולה להתבצע לחקור סריג באופן עצמאי עוצמת-12. טכניקה זו היא מעבר להיקף של מאמר זה, ודורשת ציוד מיוחד יותר. סיבות נוספות לחיישן רגיש כוללות את השימוש בתאים שהם אוטומטיים ניאון ו / או NucleoBAS איבדו ביטוי. ראוי לציין, תנודות בעוצמת התכלת וסיטרין (למשל בשל משמרות מוקד) במהלך הניסוי יכולות לטשטש הדמיה ישירה של סריג שינויים במהלך הדמיה, ואילוטבע ratiometric של החיישן עדיין מאפשר לניטור של דינמיקה של חומצות מרה. לעתים קרובות שינויים בעוצמה מוחלטים צנועים לfluorophores הפרט על תוספת של ligands FXR, תוך העלייה בשיעור ניכרת.

לניתוח סריג בתאי transfected עם חיישן BAS, אור הלייזר מתאים ומסננים יש לבחור. הגידול של עוצמת סיטרין בסריג יש למדוד עם לייזר דיודה סגולה (405 ננומטר) עם פליטת פיקוח על 450-520 (תכלת) ו520-580 (סיטרין). היבט חשוב לקחת בחשבון הוא את הרגישות של החיישן לphotobleaching. כאשר עוצמת fluorophores אחד או שניהם יורדת לאט בזמן ללא תוספת של ligands, זה לעתים קרובות מציין photobleaching. תופעה זו מתרחשת בעיקר כאשר כוח הלייזר הוא גבוה מדי. כדי למנוע השפעה לא רצויה זו, כוח הלייזרים לא יעלה על 5% מהכוח המלא והתאים צריכים להיות כל הזמן בחושך ככל האפשר. הגבלזמן לחפש את התאים תקין. תנודות בעוצמת הקרינה יכולות להיגרם גם על ידי סחיפת מוקדי בציר z. כדי לנטרל את זה, את גודל חריר ניתן להגדיל ורצוי לצייר ROIs לא קרובה מאוד למתחם התא.

חיישן סריג לחומצות מרה נבדק בסוגי תאים מרובים (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ותאי HEK293T) שניתן transfected ויש לי הפנוטיפ יציב. עם זאת, תאים ראשוניים ומובחנים כגון hepatocytes קשים transfect ולשמור על יציבות במונחים של מאפיינים. התמרה ויראלי יכולה לעזור עם תאים קשה-transfect (לבנות זמין על פי בקשה). כרגע אנחנו מייצרים קו עכבר כדי לאפשר שימוש בחיישן בתאים ראשוניים מבודדים טרי שמהירות dedifferentiate על בידוד.

כדי לבצע את ניסוי confocal תאר, קיים הכרח כי שורת התאים שנבחרו היא חסיד למנת תרבות וגדל בsiשכבת תאי ngle. עם זאת, תאים שגדלים בהשעיה, או תאים חסיד שניתן trypsinized די בקלות, ניתן גם למדוד באמצעות FACS. לבסוף, מומלץ לבחור שורת תאים ללא תחבורת חומצות מרה אנדוגני או סינתזה בעת ניתוח מסלול תחבורה ספציפית. כלומר, כאשר מודד את הפעילות של חלבונים מסוימים transfected (מוטציה) טרנספורטר.

מוצג BAS biosensor ניאון המקודדים גנטי הוא כלי רב ערך לניטור תעבורת חומצה בודדת חי מרה תא. BAS מכיל FXR-LBD אשר מופעל על ידי מגוון גדול של חומצות מרה, המאפשר הדמיה של דינמיקת subcellular של חומצות מרה 8. זה נותן יתרון גדול ביחס לשימוש בטכניקות אחרות. לדוגמא, במבחני כתב בלוציפראז מונע אמרגן, אות בלוציפראז תלויה ביציבותו של הכתב בתוך תאים, אינו תומכת במידע subcellular, ודורשת את ההרס של המדגם

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CytoBAS  Addgene 62860
NucleoBAS  Addgene 62861
Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) Lonza BE12-614F High glucose without L-glutamine
Penicillin-Streptomycin (pen/strep) Lonza 17-602E
L-glutamine (200mM) Lonza 17-605E
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 102-70
Trypsin-EDTA (10x) Lonza CC-5012
T-25 cell culture flask VWR international 392-0253 Laminin coated
T-175 cell culture flask VWR international 392-0238 Laminin coated
6-well plate VWR international 734-0229 Poly-L-lysine and Laminin coated
10 cm dish VWR international 392-0243 Laminin coated
Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran Sigma-Aldrich D9885
Polyethylenimine (PEI)  Brunschwig 23966-2
G418 (geneticin) 50 mg/ml Invitrogen 10131-027
Hygromycin B, 50 mg/ml Invitrogen 10687-010
Cloning cylinder (6 x 8 mm) Bellco 2090-00608
L-15 Leibovitz culture medium Invitrogen 21083-027 No phenol red
Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube Falcon BD 352008 No cap, non-sterile
Falcon 2,063 tubes (5 ml) Falcon BD 352063 Snap cap, sterile
Nunc Lab-Tek 8 well coverglass Thermo scientific 155409 Sterile
Charcoal-filtered FBS Life technologies 12676011
GW4064 Sigma-Aldrich G5172
TCDCA Sigma-Aldrich T6260
CDCA Sigma-Aldrich C9377
Other chemicals Sigma-Aldrich n.v.t.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 107 חומצות מרה מרה חומצת חיישן הדמיה של תא חי העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) Confocal מיקרוסקופית FACS FXR Spatiotemporal הומאוסטזיס מטבוליזם הסלולרי Dynamics
ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van de Wiel, S., Merkx, M., Van de… More

Van de Wiel, S., Merkx, M., Van de Graaf, S. Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor. J. Vis. Exp. (107), e53659, doi:10.3791/53659 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter