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Bioengineering

एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट आधारित पित्त अम्ल सेंसर का उपयोग Intracellular पित्त अम्ल गतिशीलता की वास्तविक समय की निगरानी

Published: January 4, 2016 doi: 10.3791/53659
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

Introduction

Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) व्यापक रूप से उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प 1 के साथ जीवित कोशिकाओं में सेलुलर कार्यों की बेहतर समझ हासिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। झल्लाहट में, एक उत्साहित दाता fluorophore से ऊर्जा एक स्वीकर्ता fluorophore को सौंप दिया है। झल्लाहट दक्षता दाता और स्वीकर्ता fluorophore और उनके अभिविन्यास के बीच की दूरी पर निर्भर है और इसलिए दो fluorophores को प्रभावित करने वाले गठनात्मक परिवर्तन का एक संवेदनशील readout है। इस घटना छोटे अणुओं की इमेजिंग के लिए झल्लाहट आधारित biosensors उत्पन्न करने के लिए शोषण किया जाता है। बढ़ जाती है / दाता fluorophore 2 बनाम स्वीकर्ता की उत्सर्जन तीव्रता के अनुपात में कम हो जाती है के रूप में उनकी एकाग्रता में परिवर्तन पर नजर रखी जा सकती है। उदाहरण के लिए, झल्लाहट आधारित कैल्शियम biosensors 3 कोशिकाओं में रहने वाले मुक्त कैल्शियम की सांद्रता के तेज और स्थिर पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। झल्लाहट आधारित biosensors के अन्य लाभ भी जीवित कोशिकाओं में इमेजिंग, टीवारिस गैर invasiveness, उनकी क्षमता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और सेलुलर डिब्बों 4 को लक्षित किया जाना है।

इंट्रासेल्युलर पित्त अम्ल गतिशीलता के कई पहलुओं को अभी भी खराब समझ रहे हैं। उदाहरण के लिए, थोड़ा संयुग्मित और विसंयुग्मित पित्त अम्ल परिवहन की व्यवस्था के अंतर्निहित नियमन के बारे में जाना जाता है। तकनीक मौजूदा इस परिवहन मुख्यतः luciferase आधारित पत्रकारों, radiolabeled पित्त अम्ल, या फ्लोरोसेंट पित्त अम्ल एनालॉगों का इस्तेमाल करते नजर रखने के लिए। उत्तरार्द्ध संभवतः उनके गुणों को प्रभावित पित्त अम्ल के संशोधन की आवश्यकता है। Luciferase आधारित संवाददाताओं से गरीब समय संकल्प है। इसके अलावा, इन तकनीकों का नमूना के नुकसान में परिणाम और एकल कक्षों में इमेजिंग के लिए लागू नहीं कर रहे हैं। इसलिए, यह यह ratiometric का पता लगाने के 5, 6 का लाभ शामिल है, खासकर जब से झल्लाहट biosensors का उपयोग करते हुए परिवहन गतिविधि का जीना एकल कोशिका इमेजिंग की अनुमति है कि तरीकों का उपयोग करने के लिए फायदेमंद होगा। जबकि सीएफ के वेरिएंटपी / YFP फार्म का सबसे अक्सर झल्लाहट जोड़े, एक लाल स्थानांतरित पित्त अम्ल सेंसर 7 सहित उपन्यास सेंसर के साथ झल्लाहट उपकरण बॉक्स का एक विस्तार करने के लिए नेतृत्व किया है स्वयं संघ उत्प्रेरण म्यूटेशन ले जाने Morange और mCherry का उपयोग करते हुए नई रणनीति का इस्तेमाल किया।

हम पहले farnesoid एक्स रिसेप्टर (FXR) ligand बाध्यकारी डोमेन के साथ जुड़े हुए हैं कि एक दाता fluorophore (आसमानी) और एक स्वीकर्ता fluorophore (सिट्रीन) के होते हैं कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट पित्त अम्ल सेंसर (बास), निर्माण (FXR-LBD) और एक पेप्टाइड एक LXXLL मूल भाव 8 युक्त। एक पित्त अम्ल निर्भर तरीके में FXR-LBD साथ इस पेप्टाइड एसोसिएट्स। FXR सक्रियण पर, सिट्रीन और आसमानी के बीच की दूरी एक गठनात्मक परिवर्तन के कारण बदल जाएगा। स्तनधारी सेल लाइनों में, सिट्रीन / आसमानी अनुपात में एक स्पष्ट रूप से पहचाने जाने वृद्धि में FXR सक्रियण परिणाम, शुद्ध सेंसर विपरीत दिशा में काम करता है और FXR सक्रियण पर एक कम झल्लाहट अनुपात की ओर जाता है। यह सेंसर (CytoBAS)साइटोसोलिक पित्त अम्ल गतिशीलता की निगरानी की अनुमति देता है। Subcellular को निशाना रूपांकनों के carboxyl टर्मिनल अलावा करके, बास का निर्माण विभिन्न सेलुलर डिब्बों में पित्त अम्ल की सांद्रता की माप की अनुमति, नाभिक (NucleoBAS) और peroxisomes (PeroxiBAS) को निशाना बनाया जा सकता है। Peroxisomal लक्ष्य-निर्धारण मूल भाव के अलावा पित्त अम्लों को अपनी जवाबदेही ख़राब नहीं करता है, सेल पारगम्य FXR-ligands के किसी भी peroxisomes 8 अंदर PeroxiBAS के परिवर्तन झल्लाहट के लिए प्रेरित नहीं किया। इस विसंगति की प्रकृति अज्ञात है, प्रोटोकॉल नीचे CytoBAS और NucleoBAS पर ध्यान केंद्रित किया है।

इस आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट सेंसर का उपयोग हाल ही में यकृत पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों / + taurocholate सह परिवहन पॉलीपेप्टाइड (NTCP) ना और जैविक घुला हुआ ट्रांसपोर्टर अल्फा / बीटा (OSTαβ) 8 युक्त कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया। NTCP प्रिंसिपल यकृत पित्त अम्ल आयातक है और OSTαβ एक basolateral आंतों पित्त हैविद्युत पित्त अम्ल एकाग्रता ढाल 9, 10 पर निर्भर है एक आयातक और निर्यातक के रूप में दोनों कार्य कर सकते हैं कि एसिड ट्रांसपोर्टर। हाल के आंकड़ों से NTCP और / या OSTαβ द्वारा पित्त अम्ल परिवहन पर, ligand-FXR-LBD बातचीत का एक परिणाम के रूप में झल्लाहट अनुपात में मजबूत और तेजी से प्रतिक्रिया मनाया जा सकता है कि पता चला है।

यहाँ, हम इस तरह के कोंफोकल सूक्ष्म विश्लेषण और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के रूप में झल्लाहट को मापने के लिए तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला, संभावित समस्याओं को संबोधित करने और वैकल्पिक तरीकों पर चर्चा की। इस आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट सेंसर का उपयोग करना, FXR-LBD साथ पित्त अम्ल बातचीत मात्रा निर्धारित और जीवित कोशिकाओं में सीधे नजर रखी और वास्तविक समय में पित्त अम्ल परिवहन और गतिशीलता visualizing की एक तेजी से और सरल तरीका प्रदान करता जा सकता है। CytoBAS और NucleoBAS एन्कोडिंग स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लास्मिडों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इसलिए, इस biosensor आगे करने के लिए योगदान कर सकते हैंपित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों या FXR को सक्रिय करने और पित्त अम्ल जीव विज्ञान और संकेतन में एक गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं कि यौगिकों की समझ।

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Protocol

1. क्षणिक अभिकर्मक

नोट: CytoBAS और NucleoBAS (सामग्री तालिका देखें) सफलतापूर्वक कई प्रकार की कोशिकाओं (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK और HEK293T कोशिकाओं) में किया जाता है। सेंसर का उपयोग करने के लिए मुख्य आवश्यकता यह कोशिका में प्रवेश करने के लिए एन्कोडिंग डीएनए की आवश्यकता होती है, व्यक्त किए जाने की जरूरत है।

  1. एक 80% मिला हुआ 25 सेमी 2 कुप्पी से हार्वेस्ट कोशिकाओं। विशेष सेल लाइन (10% FBS, 1% एल glutamine, 1% कलम / U2OS और Huh7 कोशिकाओं के लिए स्ट्रेप) के लिए उपयुक्त पूरा मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं पतला।
  2. एक बाँझ 8 अच्छी तरह से संभाग कांच कवर (0.8 सेमी 2) में वांछित घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं। यह आवश्यक नहीं है, हालांकि, एक उप मिला हुआ (60-80% confluency) प्रयोग के दिन पर कोशिकाओं की परत के लिए निशाना लगाओ।
  3. अच्छी तरह से प्रति 400 μl के अंतिम मात्रा को पूरा संस्कृति के माध्यम से जोड़ें। कोशिकाओं 24 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें।
  4. NucleoBAS की 0.5 ग्राम जोड़कर एक बाँझ ट्यूब में अभिकर्मक मिश्रण तैयार करेंया संस्कृति के माध्यम से 100 μl को CytoBAS डीएनए (सीरम / एंटीबायोटिक मुक्त)। अच्छी तरह से भंवर। एक अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें और vortexing द्वारा मिश्रण। इष्टतम दक्षता दे अभिकर्मक अभिकर्मकों सेल प्रकार निर्भर कर रहे हैं और पहले परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है।
    1. उदाहरण के लिए, 1 मिलीग्राम / एमएल पॉलीएथिलएमीन (पी) के 2.5 μl का उपयोग करें और डीएनए / पी आरटी पर 15 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  5. कोशिकाओं को बूंदों में अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें और धीरे हाथ से अच्छी तरह से थाली झटकों से मिश्रण। 9.6 सेमी 2 ~ की एक अच्छी तरह से करने के लिए मिश्रण के 100 μl जोड़ें। क्षणिक कोशिकाओं के लिए व्यक्तिगत इमेजिंग कक्षों के लिए अभिकर्मक मिश्रण के 10 μl का प्रयोग करें।
    नोट: 24-48 घंटे के बाद, कोशिकाओं पित्त अम्ल सेंसर व्यक्त करेंगे और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

2. स्थिर अभिकर्मक

  1. एक 80% मिला हुआ 25 सेमी 2 कुप्पी से हार्वेस्ट कोशिकाओं। विशेष सेल लाइन (10% भ्रूण गोजातीय S के लिए उपयुक्त पूरी संस्कृति के माध्यम में गोली पतलाerum, 1% मिलीलीटर प्रति 150,000 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए एल glutamine, 1% कलम / U2OS और Huh7 कोशिकाओं के लिए स्ट्रेप) और 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (2 मिलीलीटर अंत मात्रा) में अच्छी तरह से आसपास प्रति 300,000 कोशिकाओं जोड़ें।
  2. कोशिकाओं 24 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें।
  3. CytoBAS या NucleoBAS डीएनए के 0.5 ग्राम जोड़कर एक बाँझ ट्यूब में अभिकर्मक मिश्रण तैयार संस्कृति के माध्यम से 100 μl (सीरम / एंटीबायोटिक मुक्त) से (सामग्री तालिका देखें)। अच्छी तरह से भंवर। एक अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें और vortexing द्वारा मिश्रण।
    1. उदाहरण के लिए, 1 मिलीग्राम / एमएल पॉलीएथिलएमीन (पी) के 2.5 μl का उपयोग करें और डीएनए / पी आरटी पर 15 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  4. कोशिकाओं को बूंदों में अभिकर्मक मिश्रण के 100 μl जोड़ें और धीरे हाथ से अच्छी तरह से थाली झटकों से मिश्रण। एक स्थिर सेल लाइन बनाते समय हमेशा एक untransfected नियंत्रण शामिल हैं।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन बढ़ो, 5% सीओ 2।
  6. कोशिकाओं Trypsinize निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार (37 डिग्री सेल्सियस डब्ल्यू पर कोशिकाओं को सेतेith 1.5 मिलीलीटर 25 सेमी 2 सेल संस्कृति प्रति ट्रिप्सिन prewarmed) और 5 मिनट के लिए आरटी पर 250 XG पर उन्हें नीचे स्पिन। पूरी संस्कृति के माध्यम से 13 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें। विभिन्न 10 सेमी व्यास संस्कृति व्यंजन से अधिक कोशिकाओं के विभाजन: 0.5 मिलीलीटर (कम घनत्व), 1.5 मिलीग्राम (मध्यम घनत्व), और 4.5 मिलीग्राम (उच्च घनत्व)। 6.5 मिलीलीटर शेष के लिए एक ही मत करो।
  7. 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए संस्कृति के माध्यम से जोड़ें। U2OS कोशिकाओं के लिए, ऐसे CytoBAS रूप neomycin प्रतिरोध कैसेट के साथ plasmids के लिए 800 माइक्रोग्राम / एमएल G418 उपयोग करें और NucleoBAS सकारात्मक कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए निर्माण करती है। इस सांद्रता सेल प्रकार निर्भर है और untransfected कोशिकाओं 2 से 10 दिनों (U2OS कोशिकाओं के लिए 800 माइक्रोग्राम / एमएल G418) के भीतर मर गया, जहां सबसे कम एंटीबायोटिक (G418) एकाग्रता का चयन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
  8. Untransfected कोशिकाओं मर चुके हैं, जब तक उचित एंटीबायोटिक (G418) के साथ संस्कृति के माध्यम से हर 72 घंटा ताज़ा करें।
  9. एक 20x उद्देश्य के लिए साथ खुर्दबीन के नीचे संस्कृति प्लेट की जांच करनासकारात्मक कालोनियों (प्रतिदीप्ति हरे, सियान या पीले प्रतिदीप्ति के लिए इस्तेमाल सबसे फिल्टर सेट का उपयोग कर नजर रखी जा सकता है)।
  10. संस्कृति डिश के बाहरी तल पर एक कलम के साथ अन्य कालोनियों से पृथक झूठ है कि सकारात्मक कालोनियों को चिह्नित करें।
  11. फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) के साथ दो बार थाली धोने और यह महाप्राण। लगभग 15 बाँझ क्लोनिंग सिलेंडर ले लो और बाँझ सिलिकॉन में उन्हें डुबकी। पेट्री डिश के खिलाफ हल्के से दबाकर चयनित कालोनियों के आसपास उन्हें लागू करते हैं और नहीं एक से अधिक कॉलोनी क्लोनिंग अंगूठी में शामिल किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें।
  12. Pipet 20 क्लोनिंग सिलेंडर में पूर्व गर्म trypsin (1x, 0.25%) की μl और गोल है कोशिकाओं के सबसे अधिक (एक खुर्दबीन के साथ निरीक्षण) जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  13. क्लोनिंग सिलेंडर में (U2OS और Huh7 कोशिकाओं के लिए 10% FBS और 800 माइक्रोग्राम / एमएल G418) सीरम और उचित एंटीबायोटिक के साथ संस्कृति के माध्यम से 150 μl जोड़ें और नीचे कोशिकाओं resuspend और एक 96 के लिए स्थानांतरण करने के लिए कई बार pipet औरअच्छी तरह से थाली। 4-24 घंटे के बाद मध्यम रिफ्रेश करें और कोशिकाओं को अगले कुछ दिनों (37 डिग्री सेल्सियस, U2OS और Huh7 कोशिकाओं के लिए 5% सीओ 2) में मिला हुआ विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  14. हर 3 या 4 दिन एंटीबायोटिक के साथ मध्यम ताज़ा करें। कोशिकाओं को मिला हुआ हो गए हैं, एक बड़ी अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण। संस्कृति प्रयोगों के लिए काफी बड़ी है, जब तक इस चरण को दोहराएँ। बैकअप के लिए कुछ शीशियों cryopreserve। Cryopreservation मध्यम खुराक के बिना मीडिया (DMEM) में 20% FBS और 20% DMSO के होते हैं।
    नोट: अब, सेल लाइन मोनोक्लोनल और पित्त अम्ल सेंसर व्यक्त करने के लिए स्थिर माना जाता है। एंटीबायोटिक G418 (400 माइक्रोग्राम / एमएल) के आधे से एकाग्रता स्थिर सेल लाइन में अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए अब पर्याप्त है।

3. Lentiviral पारगमन

नोट: कुछ सेल लाइनों ऐसे पॉलीएथिलएमीन (पी) पद्धति के रूप में अधिक परंपरागत तरीकों से transfect करने के लिए मुश्किल माना जाता है। कोशिकाओं के वायरल पारगमन एक कुशल वैकल्पिक उपकरण है चया जीन-वितरण और स्थिर transgene अभिव्यक्ति।

  1. एक 80% मिला हुआ 25 सेमी 2 कुप्पी से हार्वेस्ट कोशिकाओं। विशेष सेल लाइन (10% FBS, 1% एल glutamine, 1% कलम / U2OS और Huh7 कोशिकाओं के लिए स्ट्रेप) के लिए पूरा मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं उपयुक्त पतला और 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से प्रति लगभग 200,000 कोशिकाओं जोड़ें।
  2. अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर के अंतिम मात्रा करने के लिए संस्कृति के माध्यम से जोड़ें। कोशिकाओं 24 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें।
  3. 500 μl CytoBAS lentivirus (अनुरोध पर उपलब्ध है) युक्त मध्यम के साथ 4-6 घंटे के लिए incubating कोशिकाओं द्वारा वायरल transductions प्रदर्शन करना 10 माइक्रोग्राम / एमएल diethylaminoethyl (DEAE) -dextran या अन्य lentiviral युक्त पूरी संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर की कुल राशि के लिए भरा पारगमन बढ़ाने। Untransduced नियंत्रण कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से शामिल करने के लिए मत भूलना।
  4. मध्यम निकालें और वांछित एंटीबायोटिक (500 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin) युक्त पूरी संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें। प्रदान करते हैं कि CytoBAS पारगमन के लिए एक lentiviral निर्माण का उपयोग करेंकोशिकाओं के लिए प्रतिरोध hygromycin। वांछित शर्तों के तहत कोशिकाओं को विकसित।
  5. हर 3 दिन एंटीबायोटिक (500 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin) के साथ मध्यम रिफ्रेश करें और 80% मिला हुआ, सभी नकारात्मक नियंत्रण कक्षों मर चुके हैं, जब तक (सबसे सेल लाइनों के लिए के बारे में 1-2 सप्ताह लग जाते हैं) जब कोशिकाओं को विभाजित। सेल लाइन अब पित्त अम्ल सेंसर व्यक्त करने के लिए स्थिर माना जाता है।
    1. वैकल्पिक रूप से, 1-3 दिनों वायरल पारगमन के बाद प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें। जीवित वायरस मौजूद हो सकते हैं, यह उचित सुरक्षा स्तर के साथ कमरे में झल्लाहट readout के उपकरणों की आवश्यकता है।
  6. वैकल्पिक रूप से, स्थिर सेल लाइनों के तेजी से अलगाव के लिए, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) प्रदर्शन करते हैं।
    1. एक मिला हुआ 160 सेमी 2 फ्लास्क से हार्वेस्ट कोशिकाओं।
    2. मिलीलीटर प्रति अधिकतम 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए <5% सीरम के साथ लेबोविट्ज़ मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं (एल -15 मध्यम) पतला
    3. हल कोशिकाओं के संग्रह के लिए, संग्रह के माध्यम से 1 एमएल (एल -1 के साथ FACS ट्यूबों को भरने5 मध्यम + 1.5% कलम / स्ट्रेप, 1% एल भरमार और 20% सीरम)।
    4. 405 लेजर के साथ उत्साहित सिट्रीन (520-580 एनएम) या आसमानी (450-520 एनएम) के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं।
    5. लगभग 500,000 कोशिकाओं छंटाई के बाद, कोशिकाओं (5 मिनट, 250 XG) नीचे स्पिन और 5 मिलीलीटर में resuspend सामान्य पूरा संस्कृति के माध्यम से (10% FBS, 250 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin U2OS और Huh7 CytoBAS कोशिकाओं के लिए) और एक T25 संस्कृति में उन्हें थाली फ्लास्क। वांछित शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस U2OS और Huh7 कोशिकाओं के लिए, 5% सीओ 2) के तहत कोशिकाओं को विकसित।

पित्त अम्ल सेंसर 4. लाइव सेल इमेजिंग

नोट: पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों युक्त कोशिकाओं lipophilic यौगिकों निकालता है कि 1-10% लकड़ी का कोयला फ़िल्टर सीरम के साथ मध्यम में संवर्धित किया जा सकता है। सामान्य सीरम अक्सर पित्त अम्ल सेंसर के intracellular पित्त अम्ल संचय और संतृप्ति के लिए ले जा सकता है कि पित्त एसिड होता है।

  1. Confocal खुर्दबीन का उपयोग झल्लाहट माप
    1. स्थिरतापूर्वक या transie कोशिकाओं थालीntly एक बाँझ 8 अच्छी तरह से coverslip तली चैम्बर स्लाइड में वांछित घनत्व पर सेंसर व्यक्त (0.8 सेमी 2)। पूरी संस्कृति के माध्यम में कोशिकाओं को विकसित (लकड़ी का कोयला फ़िल्टर सीरम का उपयोग करते हुए) इतना है कि प्रयोग के दिन पर, confluency लगभग 60-70% है।
    2. पीबीएस या लेबोविट्ज़ एल -15 संस्कृति के माध्यम 1x 200 μl के साथ एक बार चैम्बर स्लाइड में पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें।
    3. कोई सीओ 2 नियंत्रण आवश्यक है कि इतनी महाप्राण और 300 μl लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम संस्कृति के साथ बदलें।
      नोट: फिनोल लाल बिना DMEM के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया, लेकिन सीओ 2 बफर की स्थिति की आवश्यकता हो सकती है। पित्त अम्ल सेंसर से पता चलता है (कुछ) पीएच संवेदनशीलता इसलिए डेटा संग्रह के दौरान पीएच निरंतर रखने के उद्देश्य।
    4. एल -15 संस्कृति के माध्यम में भी confocal इमेजिंग प्रयोग में इस्तेमाल किया जा यौगिकों पतला। इमेजिंग के दौरान, कक्षों में तरल की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा नमूना (50-100 μl) के तेजी से मिश्रण को सुरक्षित करने के लिए कहा जा सकता है कि खाते में ले लोइसलिए 3-5x समाधान कर सकते हैं।
    5. एक 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन चैम्बर के साथ एक confocal खुर्दबीन के इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करने और बैंगनी 405 एनएम लेजर मोड़ पर है। उद्देश्य पर विसर्जन के तेल की एक बूंद रखो और यह की चोटी पर 8-कक्ष जगह है। झल्लाहट के एकल कक्ष इमेजिंग के लिए, 63X तेल उद्देश्य का उपयोग करें। सेंसर सफलतापूर्वक आरटी पर इस्तेमाल किया गया है, लेकिन सेल व्यवहार बदला जा सकता है।
    6. ठीक से confocal खुर्दबीन की सेटिंग सेट करें।
      1. सेट अधिग्रहण मोड: XYT (एकल फोकल हवाई जहाज़ के समय चूक इमेजिंग)।
      2. प्रयोग रोक के बिना यौगिकों अधिग्रहण के बीच जोड़े जाने की अनुमति देने के लिए 20 सेकंड के अंतराल पर छवियों मोल।
      3. आसमानी: उत्सर्जन का पता लगाने के लिए सेट वर्णक्रमीय रेंज 450-520 एनएम; सिट्रीन: 520-580 एनएम।
    7. Transillumination प्रकाश का उपयोग कर एकल कोशिका परत पर ध्यान दें। इमेजिंग शुरू और अधिक ठीक Z-स्थिति को समायोजित। लाभ को समायोजित और रहते हैं, जबकि पृष्ठभूमि से संकेत भेद करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए ऑफसेटब्याज की कोशिकाओं में सभी पिक्सल के लिए अच्छी तरह से संतृप्ति नीचे हैैं।
    8. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए हलकों ड्रा। समान प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाने के कक्षों का चयन करें। जाहिर है कि आकार और आकार में औसत सेल से अलग है कि कोशिकाओं से बचें। सेंसर की photobleaching कम करने के लिए जितना संभव हो कम एक समय के लिए प्रकाश में कोशिकाओं को बेनकाब। यह सेल परिधि के बहुत करीब नहीं ROIs आकर्षित करने के लिए सलाह दी जाती है। इस क्षेत्र में होने के कारण फोकल बहाव (जेड-दिशा में आगे बढ़ कोशिकाओं) इसे और अधिक कठिन प्रयोग के दौरान प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए बनाने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन करने के लिए सबसे ज्यादा संवेदनशील है।
    9. Confocal खुर्दबीन के साथ माप की शुरुआत करें। आसमानी और सिट्रीन प्रतिदीप्ति स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें।
    10. मापने के दौरान चुना समय बिंदुओं पर 50-100 μl पित्त अम्ल या अन्य यौगिकों जोड़ें। तरल (अंतिम मात्रा का एक तिहाई के लिए एक पांचवें) के अपेक्षाकृत उच्च मात्रा / p मिलाते हुए बिना (10 सेकंड के भीतर) अच्छी तरह से तरल पदार्थ मिश्रण करने के लिए आवश्यक हैंऊपर और नीचे ipetting। विंदुक टिप के साथ 8 अच्छी तरह चैम्बर के किनारे छूने और कोशिकाओं ध्यान से बाहर नहीं मिलता है तो धीरे धीरे तरल जोड़ने के लिए नहीं सुनिश्चित करें। पठार चरण पर पहुंच गया है, पहले नए यौगिकों न जोड़ें। इस बारे में 200 सेकंड लेता है।
    11. 100 μl GW4064, अंत एकाग्रता 5-10 माइक्रोन (सेंसर saturating खुराक) के अलावा के साथ एक प्रयोग के अंत और सेंसर प्रतिदीप्ति स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें।
    12. प्रयोग बचाने के लिए और एक AVI फ़ाइल के रूप में डेटा निर्यात।
    13. ImageJ में ओपन दोनों AVI फ़ाइलों (चैनल 00, आसमानी, 01 चैनल, सिट्रीन) प्लगइन्स> ढेर> ढेर interleaver का चयन करके। वैकल्पिक रूप से सीधे छवि जम्मू में, आयात कोंफोकल फ़ाइल (जैसे, .lsm या .lif फ़ाइलें) (http://www.openmicroscopy.org पर उपलब्ध है) उचित plugins का उपयोग और 4.1.14 कदम के लिए कदम।
      1. ढेर 1: चैनल 01 (सिट्रीन) का उपयोग करें।
      2. ढेर 2: चैनल 00 (आसमानी) का उपयोग करें।
    14. संपादित करें पर क्लिक करें> चयन> जोड़ेंप्रबंधक के लिए, रॉय प्रबंधक विंडो खोलने के लिए। चेकबॉक्स चेक 'सभी दिखाएँ'।
    15. अंडाकार चयन उपकरण के साथ विशिष्ट कोशिकाओं को कवर करने के लिए ब्याज की कुछ क्षेत्रों (ROIs) के ड्रा। इसके अलावा कोशिकाओं के बाहर या पृष्ठभूमि संकेत निर्धारित करने के लिए सेंसर व्यक्त नहीं करता है कि एक सेल के अंदर एक क्षेत्र में एक वृत्त खींचना। यह कारण फोकल बहाव (जेड-दिशा में आगे बढ़ कोशिकाओं) या सेल प्रवास के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन स्पष्ट थे जब प्रयोगों में सेल परिधि के बहुत करीब नहीं ROIs आकर्षित करने के लिए सलाह दी जाती है।
    16. एक कक्ष का चयन करें। प्लगइन्स> अनुपात प्रोफाइलर पर क्लिक करें। रॉ, अनुपात और Ratio_Profile: इस 3 स्क्रीन में परिणाम होगा। रॉ खिड़की झल्लाहट अगर वहाँ सिट्रीन (नीली रेखा) की तीव्रता में वृद्धि हुई है और आसमानी (लाल रेखा) में कमी को दर्शाता है। अनुपात खिड़की झल्लाहट में वृद्धि के साथ वृद्धि होगी जो आसमानी अनुपात सिट्रीन /, के बारे में जानकारी देता है। Ratio_Profile खिड़की दोनों चैनलों में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता की वास्तविक संख्या देता है। माइक्रो हैंफाइलों चैनल आदेश उलट हो सकता है इस्तेमाल कर रहे सेटअप-विशिष्ट फ़ाइलें (जैसे, .lsm या .lif बजाय .avi) सामना।
    17. अनुपूरक डेटा के रूप में संलग्न स्प्रेडशीट में Ratio_Profile खिड़की से डेटा कॉपी करें। अन्य सभी कोशिकाओं (और पृष्ठभूमि आरओआई) के लिए एक ही मत करो।
      नोट: ऑनलाइन स्प्रेडशीट, सभी डेटा अधिकतम बास सक्रियण की उम्मीद है, जिस पर हालत सामान्यीकृत है। GW4064 FXR के सबसे शक्तिशाली उत्प्रेरक है कि यह देखते हुए, GW4064 की एक अधिशेष के साथ ऊष्मायन के बाद प्रतिदीप्ति अनुपात यह GW4064 के अलावा के साथ प्रयोगों के सभी समाप्त करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है 1 पर सेट है। इस का लाभ डेटा नहीं रह गया है और अधिक आसानी से तुलना की जा सकती अलग अलग दिनों पर लेजर तीव्रता या डिटेक्टर लाभ और प्रयोगों पर निर्भर है। इसके अलावा, स्प्रेडशीट के नीचे ग्राफ में एक चल औसत प्रयोगात्मक शोर के लिए घटता सुचारू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चल Avera के बाद, काइनेटिक डेटा का विश्लेषण करते समय हालांकि, इस ग्राफ का उपयोग नहीं करतेजीई चिकनी तेज गतिज प्रतिक्रियाएं भी होगा।
  2. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर झल्लाहट माप (FACS)
    1. बाँझ FACS तेज बफर (0.3 मिमी EDTA, 0.5% बीएसए, 0.01% नेन 3 और 10 मिमी डी ग्लूकोज) में FACS के प्रयोग के लिए सभी यौगिकों पतला।
    2. पीबीएस में 5 मिमी EDTA का उपयोग कर एक 80% मिला हुआ टी-160 सेमी 2 सेल संस्कृति कुप्पी से हार्वेस्ट कोशिकाओं। 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। आरटी पर 5 मिलीलीटर FACS तेज बफर में धो सेल गोली 2x।
    3. कल्टर काउंटर या एक गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
    4. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए FACS तेज बफर में गोली पतला। एकल कक्षों का एक सजातीय निलंबन पैदा करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और। कोशिकाओं disaggregate करने के लिए मुश्किल हो जाता है, तो नोक मोज़री कम करने के लिए छँटाई करने से पहले एक सेल झरनी के माध्यम से नमूने डाल दिया।
    5. Pipet 200 μl FACS ट्यूब प्रति कोशिकाओं और प्रकाश से उन्हें बचाने के लिए।
    6. परिसर के वांछित एकाग्रता जोड़ें (जैसे, पित्त अम्ल, सिंथेटिक FXR ligands, ट्रांसपोर्टर अवरोधकों)। भंवर। (अंधेरे में) मिलाते हुए आरटी पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. इस बीच, FACS (पराबैंगनीकिरण गर्म करने के लिए समय की जरूरत है) शुरू करते हैं।
    8. प्रयोग (देखें चित्र 3) के लिए gating के मापदंडों के प्रवाह cytometry सेट करें:
      1. फाटकों का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट 100,000-200,000 NucleoBAS या CytoBAS के आसपास लोड करें।
      2. सबसे पहले साजिश के केंद्र में कोशिकाओं की साजिश के लिए FSC और एसएससी voltages समायोजित।
      3. बैंगनी लेज़र का उपयोग करना, आसमानी (450/40) एनएम वोल्टेज मूल्य और सिट्रीन (525/20) एनएम वोल्टेज को समायोजित करने और सभी NucleoBAS या CytoBAS सकारात्मक कोशिकाओं तितर बितर साजिश के भीतर प्लॉट किए जाते हैं कि यह सुनिश्चित करें।
      4. चित्रा 4 देखते हैं, सही फाटकों (गेट पी 4 अप करने के लिए गेट P1) के सेट करें।
        1. एसएससी-ए / एफएससी-एक भूखंड के बीच में मुख्य आबादी का चयन करके आमतौर पर निचले बाएँ कोने में दिखाया मृत कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए गेट पी 1 का प्रयोग करें।
        2. में गेट के p2 का प्रयोग करेंएफएससी-एच / एफएससी-एक विंडो विश्लेषण से duplets हटाने के लिए। एकल कक्षों दोहरी तुलना में एक अधिक विकर्ण लाइन में प्रस्तुत कर रहे हैं।
        3. सिट्रीन में गेट पी 3 (525/20 एनएम) / आसमानी (450/40) एनएम खिड़की सिट्रीन और आसमानी उच्च कोशिकाओं gating द्वारा, NucleoBAS / CytoBAS के लिए सकारात्मक कक्षों का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आबादी के ऊपरी दाहिने कोने में तिरछे प्रदर्शित किया प्लॉट।
        4. संभव के रूप में करीब आबादी के ऊपर छोड़ दिया, पर गेट पी 4 ड्रा और कोशिकाओं की अधिक से अधिक 5% इस गेट के भीतर गिर सुनिश्चित करें।
      5. ऑटो प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए कुछ untransfected कोशिकाओं (CytoBAS या NucleoBAS का कोई अभिव्यक्ति) कर लेता है। untransfected आबादी फाटक पी 3 में स्थित नहीं किया जा सकता है। ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को बाहर करने के लिए जब आवश्यक गेट पी 3 को समायोजित करें।
    9. FACS में ट्यूब रखने से पहले नमूने भंवर। प्रत्येक नमूने के लिए, गेट पी 3 में कम से कम 10,000 कोशिकाओं को मापने।
      नोट: जनसंख्या पदानुक्रम खिड़की की घटनाओं की संख्या देता हैमाता पिता के गेट के प्रत्येक गेट और% के लिए प्रदर्शित किया जा रहा है। गेट 4 में, माता-पिता की% सभी NucleoBAS सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में एक वृद्धि सिट्रीन / आसमानी अनुपात के साथ कोशिकाओं को बताता है।

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Representative Results

प्रस्तुत झल्लाहट बास सेंसर दो fluorophores सिट्रीन और आसमानी) और एक LXXLL मूल भाव से जुड़ी FXR (LBD-FXR) का डोमेन बाध्यकारी ligand पर आधारित है। यह सेंसर उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प (चित्रा 1 ए) के साथ जीवित कोशिकाओं में पित्त अम्ल परिवहन की जांच की अनुमति देता है। आसमानी और सिट्रीन में उत्परिवर्तन इंट्रामोलीक्युलर जटिल (चित्रा 1 बी) के गठन को बढ़ावा देने के लिए लागू किया गया। पित्त अम्ल और अन्य FXR ligands FXR करने के लिए बाध्य है और इस तरह एक गठनात्मक परिवर्तन द्वारा सिट्रीन और आसमानी के बीच की दूरी को बदल। स्तनधारी कोशिकाओं में रहने वाले, यह एक वृद्धि की झल्लाहट दक्षता (सिट्रीन वृद्धि हुई है, आसमानी कमी) (चित्रा 1 सी, 1 डी) में यह परिणाम है। Confocal खुर्दबीन के साथ एक जीवित कोशिका मात्रात्मक तीव्रता के आधार पर झल्लाहट प्रयोग के दौरान, मैंटी औसत सिट्रीन / आसमानी अनुपात GW4064 (5 माइक्रोन) (चित्रा के साथ उपचार के बाद उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जबकि taurochenodeoxycholic एसिड (TCDCA), झल्लाहट में कोई परिवर्तन नहीं दिखाते पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों की कमी NucleoBAS व्यक्त (30 माइक्रोन) U2OS कोशिकाओं -treated कि मनाया गया 1 सी)। इसके विपरीत, सह व्यक्त NucleoBAS, NTCP और OSTαβ TCDCA के अलावा पर ​​सिट्रीन / आसमानी अनुपात में एक स्पष्ट वृद्धि हुई है, और GW4064 के अलावा चित्रा (1 डी) के बाद अनुपात में एक भी बड़ा वृद्धि दिखा था कोशिकाओं U2OS। इस TCDCA कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित करने में असमर्थ है और कोशिका में प्रवेश करने के लिए विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों की आवश्यकता है कि यह दर्शाता है।

सेंसर की सेलुलर स्थानीयकरण विशिष्ट स्थानीयकरण संकेतों की उपस्थिति से निर्धारित होता है। NucleoBAS चित्रा (परमाणु स्थानीयकरण संकेत द्वारा नाभिक के लिए लक्षित है <मजबूत> 2 बी), CytoBAS किसी स्थानीयकरण संकेत होते हैं और इसलिए साइटोसॉल (चित्रा 2 ए) में रहता है नहीं करता है। biosensor भी एक ही सेल में प्रोटीन अभिव्यक्ति / स्थानीयकरण और FXR सक्रियण की माप सक्षम, अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 सी U2OS कोशिकाओं NucleoBAS और NTCP-mKate2 साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट से पता चलता है। इसके अतिरिक्त, सेंसर भी एक साथ एक से अधिक पैरामीटर की subcellular इमेजिंग के लिए अन्य सेंसरों के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, NucleoBAS TGR5 (ईएसटी क्लोन छवि # 5,221,127) और एक ही समय में एक ही सेल में TGR5 और FXR सक्रियण को मापने के लिए एक शिविर साइटोसोलिक सेंसर (टी Epac वी.वी.) 11 के साथ व्यक्त की गई थी। नाभिक में FXR सक्रियण की तुलना में था, जबकि TGR5 बाध्यकारी पर, शिविर स्तर, शिविर संवेदक द्वारा पता लगाया गया था, जो cytosol में वृद्धि हुईएक साथ ualized। आंकड़े 2 डी एफ   GW4064 (5 माइक्रोन) (चित्रा 2 डी) के साथ उपचार के बाद NucleoBAS-TGR5- टी Epac वी.वी. कोशिकाओं के 6 confocal छवियों से बना एक समय श्रृंखला दिखाने के लिए, TCDCA (10 माइक्रोन) (चित्रा 2 ई) के साथ या chenodeoxycholic एसिड के साथ (CDCA) (10 माइक्रोन) टी = 0 हरे रंग (शिविर ऊंचाई का प्रतिनिधित्व) 525/450 एनएम उत्सर्जन अनुपात में कमी आई है, जहां क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करता है और गुलाबी रंग में (चित्रा 2 एफ) की तुलना में, उत्सर्जन अनुपात (FXR सक्रियण) में वृद्धि का प्रतिनिधित्व प्रयोग के शुरू में अनुपात।

इसके अलावा, प्रवाह cytometry एकल कोशिका के स्तर या पूरी आबादी पर के रूप में उच्च throughput स्क्रीनिंग पर कोशिकाओं का एक पूल स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। NucleoBAS व्यक्त U2OS कोशिकाओं Excit थेएक बैंगनी 405 एनएम लेजर और प्रतिदीप्ति के साथ एड सिट्रीन के लिए आसमानी और 525/20 श्रृंखला के लिए 450/40 रेंज में एकत्र किया गया था। FACS आधारित झल्लाहट प्रयोगों की दक्षता में सुधार करने के लिए, उचित फाटकों (चित्रा 3) स्थापित किया जाना चाहिए। P1 के गेट सेल मलबे शामिल नहीं है और p2 गेट विश्लेषण से duplets हटा। इसके बाद, विश्लेषण (488 लेजर के साथ उत्साहित) और आसमानी (405 लेजर के साथ उत्साहित) अंत में गेट 3. द्वारा सकारात्मक कोशिकाओं सिट्रीन तक ही सीमित है, गेट पी 4 एक उच्च सिट्रीन / आसमानी उत्सर्जन अनुपात के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है (आसमानी की उत्तेजना का उपयोग ) 405 एनएम लेजर के साथ। प्रत्येक नमूने के लिए, गेट 3 के भीतर गिर गया है कि कम से कम 10,000 कोशिकाओं मापा गया।

बाद में, FACS आधारित झल्लाहट फ्लो TCDCA और GW4064 के साथ 30 मिनट ऊष्मायन के बाद जीवित कोशिकाओं में झल्लाहट में वृद्धि की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। NucleoBAS व्यक्त गैर इलाज U2OS कोशिकाओं से पता चला है <गेट पी 4 में 5% की कोशिकाओं (सिट्रीन / सीerulean उच्च कोशिकाओं)। किसी भी पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों के अभाव में, एक समान प्रतिशत 30 माइक्रोन TCDCA इलाज किया कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) में मनाया गया। इसके विपरीत, सेल NucleoBAS सह व्यक्त, NTCP और OSTαβ लगभग 38% की सिट्रीन / आसमानी उच्च कोशिकाओं की वृद्धि हुई राशि दिखा था। 10 माइक्रोन GW4064 के अलावा के बाद, कोशिकाओं के लगभग 90% OSTαβ या NTCP (चित्रा 4 बी) की अभिव्यक्ति की सिट्रीन / आसमानी उच्च परवाह किए बगैर थे। डेटा सिट्रीन-आसमानी अनुपात (चित्रा 4 ई, एफ) की जनसंख्या histograms के रूप में या (चित्रा 4 सी, डी) (गेट 4, जनसंख्या 4% कोशिकाओं) बार रेखांकन में प्रस्तुत किया जा सकता है।

आकृति 1

एफपित्त अम्ल सेंसर (बास) के igure 1. डिजाइन। (ए) एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पित्त अम्ल सेंसर की कार्रवाई की विधा का स्ट्रक्चरल प्रतिनिधित्व। यह एक दाता fluorophore (आसमानी) और एक स्वीकर्ता fluorophore (सिट्रीन) FXR-LBD के माध्यम से जुड़ा हुआ है और एक FXR-सहघटक पेप्टाइड (LXXLL मूल भाव) से जुड़े हुए होते हैं। (बी) के बास के योजनाबद्ध डोमेन वास्तुकला। Q204F / V224L fluorophore म्यूटेशन आसमानी और सिट्रीन के बीच इंट्रामोलीक्युलर बातचीत के गठन को बढ़ावा देने। NucleoBAS निर्माण एक सी टर्मिनल परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) शामिल है और CytoBAS निर्माण साइटोसोलिक स्थानीयकरण पता चलता है इसलिए किसी को निशाना अनुक्रम का अभाव है और जबकि इसलिए, नाभिक में जम जाता है। (सी) संयुग्मित पित्त अम्ल परिवहन की निगरानी के लिए एक उपकरण के रूप में बस के साथ प्रतिनिधि confocal आधारित झल्लाहट प्रयोग। सिट्रीन / आसमानी अनुपात में कोई परिवर्तन नहीं कोशिकाओं में 30 माइक्रोन TCDCA अलावा केवल ऍक्स्प के बाद मनाया जाता हैressing NucleoBAS। 5 माइक्रोन GW4064 जोड़ा गया है, जब एक जोरदार वृद्धि हुई सिट्रीन / आसमानी अनुपात मनाया गया। TCDCA (डी) आयात (30 माइक्रोन) NTCP और OSTαβ सह ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में सेंसर की काफी सक्रियण में परिणाम है। इसके बाद GW4064 (5 माइक्रोन) के उपचार सिट्रीन / आसमानी अनुपात में एक और वृद्धि की ओर जाता है। मतलब ± एसडी, एन = 6 व्यक्ति कोशिकाओं। के रूप में परिणाम व्यक्त कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

चित्रा 2। स्थानीयकरण झल्लाहट बास जीवित कोशिकाओं में निर्माण। CytoBAS (ए) या ​​NucleoBAS (बी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट U2OS कोशिकाओं की confocal खुर्दबीन छवियों। (सी) U2OS कोशिकाओं सह TranNucleoBAS और NTCP-mKate2 साथ sfected। पैमाने बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (डी - एफ) NucleoBAS-TGR5- टी EPAC वी.वी. कोशिकाओं के समय श्रृंखला। (डी) GW4064 FXR (बढ़ा 525/450 एनएम अनुपात), लेकिन नहीं TGR5 को सक्रिय करता है। (ई) TCDCA TGR5 प्लाज्मा झिल्ली पर सक्रिय हो जाता है (525/450 एनएम अनुपात में कमी आई है), लेकिन नाभिक में FXR सक्रिय करने के लिए सेल प्रवेश करने में सक्षम नहीं है। (एफ) CDCA नाभिक में प्लाज्मा झिल्ली पर TGR5 के साथ ही FXR को सक्रिय करता है (कोशिका द्रव्य में कमी आई है, नाभिक में 525/450 एनएम अनुपात में वृद्धि हुई है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन

चित्रा 3। Gating paramete प्रवाह cytometryरु। (ए) एसएससी-ए / एफएससी-एक खिड़की में पी 1 गेट मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एफएससी-एच / एफएससी-एक खिड़की में (बी), P2 गेट विश्लेषण से नक़ल की घटनाओं को खत्म करने के लिए तैयार है। (525/20 एनएम) / आसमानी (450/40 एनएम) खिड़की, NucleoBAS (और CytoBAS) सकारात्मक कोशिकाओं का चयन कर रहे सिट्रीन (गेट पी 3) (सी)। (डी) अंत में, सिट्रीन में (525/20 एनएम) / आसमानी (450/40 एनएम) खिड़की, पी 4 गेट FACS के प्रयोग के सिट्रीन / आसमानी उच्च सेल शामिल हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4

चित्रा 4। NucleoBAS का उपयोग कर पित्त अम्ल परिवहन मापने प्रतिनिधि FACS प्रयोग। (ए >, बी) की राशि दिखा FACS भूखंडों सिट्रीन / आसमानी-उच्च जीवन NucleoBAS व्यक्त U2OS कोशिकाओं (ए) और U2OS कोशिकाओं सह व्यक्त NucleoBAS, OSTαβ और NTCP (बी) के बाईं नियंत्रण बफर (), 30 माइक्रोन के साथ उपचार के बाद TCDCA (मध्य) या 10 माइक्रोन GW4064 (दाएं)। (सी, डी) NucleoBAS और व्यक्त U2OS कोशिकाओं में TCDCA या GW4064 के साथ 30 मिनट ऊष्मायन के बाद सिट्रीन / आसमानी उच्च कोशिकाओं के बार ग्राफ दिखा प्रतिशत (डी) के साथ या (सी) OSTαβ और NTCP बिना सह ट्रांसफ़ेक्ट। (ई, एफ) TCDCA (पीला) के साथ 30 मिनट ऊष्मायन के बाद OSTαβ और NTCP के साथ या बिना NucleoBAS व्यक्त U2OS कोशिकाओं, GW4064 (लाल) या नियंत्रण बफर (नीला) की आबादी में सिट्रीन / आसमानी अनुपात का वितरण दिखा हिस्टोग्राम। सभी की स्थिति में तीन बार मापा गया। बार्स मतलब मूल्यों + मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व (एन = 3)।टीटीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1:। खाका बास जनरल इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2:। खाका बास जीस लीका डेटा आयातित इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम जीवित कोशिकाओं में पित्त अम्ल परिवहन के spatiotemporal गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम एक उपन्यास आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पित्त अम्ल सेंसर के इस्तेमाल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस biosensor जिससे एक झल्लाहट आधारित पित्त अम्ल सेंसर (बास) के गठन, FXR-LBD करने के लिए जुड़े हुए हैं कि आसमानी और सिट्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं।

सेल संस्कृति और FACS या (कोंफोकल) माइक्रोस्कोपी के साथ बुनियादी अनुभव हो रही है जब पित्त अम्ल सेंसर का उपयोग में अपेक्षाकृत सरल और सुविधाजनक है। हालांकि, कुछ पहलुओं को कुछ परेशानी शूटिंग की आवश्यकता हो सकती है। पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों के साथ संयोजन में पित्त अम्ल सेंसर का उपयोग करते हैं, यह लकड़ी का कोयला फ़िल्टर सीरम के साथ मध्यम में संस्कृति कोशिकाओं की सिफारिश की है। लकड़ी का कोयला आगे सीरम से सोखना द्वारा पित्त अम्ल का स्तर कम कर देता है। यह एक असंवेदनशील सेंसर का सबसे आम कारण है के बाद से विशेष रूप से इस तरह के NTCP के रूप में आयातकों की उपस्थिति में, यह संवर्धन के दौरान सेंसर की संतृप्ति को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रयोगों के दौरान। इसलिए, एक और सेंसर एक बड़ा गतिशील रेंज 8 बनाने, पित्त अम्ल के लिए संवेदनशीलता फेरबदल म्यूटेशन युक्त (NucleoBAS N354K / I372V) बनाया गया था। उन कोशिकाओं को कम इंट्रासेल्युलर पित्त अम्ल का स्तर है ग्रहण कर रहे हैं, क्योंकि सेंसर पहले से ही संतृप्त है कि क्या परिभाषित करने के लिए, सिट्रीन / आसमानी अनुपात, और न कोई पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों व्यक्त नियंत्रण कक्षों में अनुपात की तुलना में हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिदीप्ति जीवन भर इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (flim) माप एक तीव्रता स्वतंत्र ढंग से 12 में झल्लाहट जांच करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक को इस पत्र के दायरे से परे है, और अधिक विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। एक असंवेदनशील संवेदक के लिए अन्य कारणों से ऑटो फ्लोरोसेंट रहे हैं और / या NucleoBAS अभिव्यक्ति खो दिया है कि कोशिकाओं का उपयोग शामिल है। ध्यान से, प्रयोग के दौरान (उदाहरण के लिए कारण फोकल बदलाव करने के लिए) आसमानी और सिट्रीन की तीव्रता में उतार-चढ़ाव, जबकि इमेजिंग के दौरान झल्लाहट परिवर्तन के प्रत्यक्ष दृश्य अस्पष्ट कर सकते हैंसेंसर के ratiometric प्रकृति अभी भी पित्त अम्ल गतिशीलता की निगरानी के लिए अनुमति देता है। अनुपात में वृद्धि से स्पष्ट है, जबकि अक्सर निरपेक्ष तीव्रता में परिवर्तन, FXR ligands के अलावा पर व्यक्तिगत fluorophores के लिए मामूली हैं।

बास संवेदक के साथ कोशिकाओं में झल्लाहट विश्लेषण के लिए, उचित लेजर प्रकाश और फिल्टर का चयन किया जाना चाहिए। झल्लाहट के दौरान सिट्रीन तीव्रता में वृद्धि 450-520 (आसमानी) और 520-580 (सिट्रीन) पर नजर रखी उत्सर्जन के साथ बैंगनी डायोड (405 एनएम) लेजर के साथ मापा जाना है। खाते में लेने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू photobleaching के लिए सेंसर की संवेदनशीलता है। एक या दोनों fluorophores की तीव्रता धीरे-धीरे ligands के अलावा बिना समय में गिरावट आती है, यह अक्सर photobleaching इंगित करता है। लेजर शक्ति बहुत अधिक है जब इस घटना में मुख्य रूप से होता है। इस अवांछित प्रभाव से बचने के लिए, लेज़रों बिजली पूरी शक्ति के 5% से अधिक नहीं होनी चाहिए और कोशिकाओं के रूप में बहुत संभव के रूप में अंधेरे में रखा जाना है। सीमित करेंसही समय कोशिकाओं के लिए खोज करने के लिए। प्रतिदीप्ति तीव्रता में उतार चढ़ाव भी जेड अक्ष में फोकल बहाव की वजह से हो सकता है। यह प्रतिक्रिया है, पिनहोल आकार बढ़ाया जा सकता है और यह सेल परिधि के बहुत करीब नहीं ROIs आकर्षित करने के लिए सलाह दी जाती है।

पित्त अम्लों के लिए झल्लाहट सेंसर ट्रांसफ़ेक्ट और एक स्थिर phenotype है हो सकता है कि कई प्रकार की कोशिकाओं (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK और HEK293T कोशिकाओं) में परीक्षण किया गया है। हालांकि, इस तरह हेपाटोसाइट्स के रूप में प्राथमिक और विभेदित कोशिकाओं transfect करने के लिए और विशेषताओं के रूप में स्थिर बनाए रखने के लिए मुश्किल हो जाता है। वायरल पारगमन मुश्किल-transfect कोशिकाओं (अनुरोध पर उपलब्ध निर्माण) के साथ कर सकते हैं। वर्तमान में हम तेजी से अलगाव पर dedifferentiate कि हौसले से पृथक प्राथमिक कोशिकाओं में सेंसर का उपयोग करने की अनुमति के लिए एक माउस लाइन पैदा कर रहे हैं।

वर्णित कोंफोकल प्रयोग करने के लिए, यह चयनित सेल लाइन एक संस्कृति डिश के अनुयायी है कि जरूरी है और एक सी में बढ़ता हैngle सेल परत। हालांकि, निलंबन, या बल्कि आसानी से trypsinized जा सकता है कि पक्षपाती कोशिकाओं में उगने वाले कोशिकाओं को भी FACS का उपयोग मापा जा सकता है। अंत में, यह एक विशिष्ट परिवहन मार्ग का विश्लेषण करते समय अंतर्जात पित्त अम्ल परिवहन या संश्लेषण के बिना एक सेल लाइन का चयन करने की सलाह दी है। यानी, कुछ ट्रांसफ़ेक्ट (उत्परिवर्ती) ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की गतिविधि को मापने है।

प्रस्तुत आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट biosensor बास एकल जीवित कोशिका पित्त अम्ल परिवहन की निगरानी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। बास पित्त अम्ल 8 की subcellular गतिशीलता की इमेजिंग अनुमति देता है, पित्त अम्ल की एक बड़ी विविधता से सक्रिय है जो एक FXR-LBD शामिल हैं। यह अन्य तकनीकों के उपयोग के संबंध में एक महान लाभ देता है। उदाहरण के लिए, प्रमोटर संचालित luciferase संवाददाता assays में, luciferase संकेत subcellular जानकारी का समर्थन नहीं करता, कोशिकाओं के भीतर रिपोर्टर की स्थिरता पर निर्भर है, और नमूने के विनाश की आवश्यकता है

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CytoBAS  Addgene 62860
NucleoBAS  Addgene 62861
Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) Lonza BE12-614F High glucose without L-glutamine
Penicillin-Streptomycin (pen/strep) Lonza 17-602E
L-glutamine (200mM) Lonza 17-605E
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 102-70
Trypsin-EDTA (10x) Lonza CC-5012
T-25 cell culture flask VWR international 392-0253 Laminin coated
T-175 cell culture flask VWR international 392-0238 Laminin coated
6-well plate VWR international 734-0229 Poly-L-lysine and Laminin coated
10 cm dish VWR international 392-0243 Laminin coated
Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran Sigma-Aldrich D9885
Polyethylenimine (PEI)  Brunschwig 23966-2
G418 (geneticin) 50 mg/ml Invitrogen 10131-027
Hygromycin B, 50 mg/ml Invitrogen 10687-010
Cloning cylinder (6 x 8 mm) Bellco 2090-00608
L-15 Leibovitz culture medium Invitrogen 21083-027 No phenol red
Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube Falcon BD 352008 No cap, non-sterile
Falcon 2,063 tubes (5 ml) Falcon BD 352063 Snap cap, sterile
Nunc Lab-Tek 8 well coverglass Thermo scientific 155409 Sterile
Charcoal-filtered FBS Life technologies 12676011
GW4064 Sigma-Aldrich G5172
TCDCA Sigma-Aldrich T6260
CDCA Sigma-Aldrich C9377
Other chemicals Sigma-Aldrich n.v.t.

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 107 पित्त अम्ल पित्त अम्ल सेंसर लाइव सेल इमेजिंग Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) confocal माइक्रोस्कोपी FACS FXR spatiotemporal homeostasis चयापचय सेलुलर गतिशीलता
एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट आधारित पित्त अम्ल सेंसर का उपयोग Intracellular पित्त अम्ल गतिशीलता की वास्तविक समय की निगरानी
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Van de Wiel, S., Merkx, M., Van de… More

Van de Wiel, S., Merkx, M., Van de Graaf, S. Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor. J. Vis. Exp. (107), e53659, doi:10.3791/53659 (2016).

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