Introduction
フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、高い時間および空間分解能1と生細胞中の細胞機能のより良い理解を得るために使用されます。 FRETは、励起されたドナーフルオロフォアからのエネルギーは、アクセプターフルオロフォアへ転送されます。 FRETの効率は、ドナーとアクセプターフルオロフォアとその方向との間の距離に強く依存するため、2つの蛍光体に影響を与えるコンフォメーション変化の敏感な読み出しです。この現象は、小分子のイメージングのためのFRETベースのバイオセンサーを生成するために利用されます。それらの濃度の変化は、ドナーフルオロフォア2対アクセプターの発光強度の比の増加/減少するように監視することができます。例えば、FRETベースのカルシウムのバイオセンサーは細胞3生き内遊離カルシウム濃度の迅速かつ安定した検出を可能にします。 FRETベースのバイオセンサの他の利点は、単一の生細胞内で撮像され、T相続人の非侵襲性は、それらの能力が異なる細胞型および細胞区画4を標的とします。
細胞内の胆汁酸動態の多くの側面は、まだよく理解されていません。例えば、少しは、共役および非抱合型胆汁酸輸送の規制の根底にあるメカニズムについて知られています。既存の技術は、この輸送は、主に、ルシフェラーゼベースのレポーター、放射性標識胆汁酸、または蛍光胆汁酸類似体を利用する監視します。後者は、おそらくそれらの特性に影響を与え、胆汁酸の修飾を必要とします。ルシフェラーゼベースのレポーターは悪い時間分解能を持っています。また、これらの技術は、サンプルの損失をもたらし、単一細胞でのイメージングには適用されません。したがって、それはレシオメトリック検出5,6の利点を備えているので、特に、FRETバイオセンサーを使用して、輸送活性の生きた単一細胞イメージングを可能にする方法を使用することが有益であろう。一方、CFの変種P / YFPのフォームは、最も頻繁に、FRETペアを使用し、自己会合を誘発する変異を有するmOrangeとmCherryをを使用して、新しい戦略がレッドシフト胆汁酸センサー7を含む小説センサー、とのFRETツールボックスの拡大につながっています。
我々は以前ファルネソイドX受容体（FXR）のリガンド結合ドメインと融合されるドナーフルオロフォア（セルリアン）とアクセプターフルオロフォア（シトリン）で構成され、遺伝的にコードされたFRET胆汁酸センサー（BAS）を、作成した（FXR-LBD）そして、LXXLLモチーフ8を含むペプチド 。胆汁酸依存的にFXR-LBDとこのペプチドの仲間。 FXRの活性化の際に、シトリンと紺碧の間の距離は、立体構造の変化に起因する変更されます。哺乳動物細胞株における、FXR活性化の結果シトリン/セルリアン比で明らかに検出可能な増加で、精製されたセンサーは、反対方向に動作し、FXRの活性化の際に減少FRET比をもたらしました。このセンサー（CytoBAS）細胞質の胆汁酸動態のモニタリングを可能にします。細胞内ターゲティングモチーフのカルボキシル末端付加することで、BASの構築物は、異なる細胞区画における胆汁酸濃度の測定が可能、核（NucleoBAS）およびペルオキシソーム（PeroxiBAS）を標的とすることができます。ペルオキシソーム標的モチーフの添加は胆汁酸への応答性を損なうものではないが、細胞透過性FXRリガンドは、ペルオキシソーム8内 PeroxiBASの任意のFRETの変化を誘導しませんでした。この矛盾の性質は不明であるため、プロトコルは以下CytoBASとNucleoBASに焦点を当てています。
この遺伝的にコードされたFRETセンサーの使用は、最近、肝胆汁酸輸送体+ /タウロコール酸共輸送ポリペプチド（NTCP）Naおよび有機溶質輸送体アルファ/ベータ（OSTαβ）を8含む細胞で実証されました。 NTCPは、主要な肝胆汁酸輸入国であるとOSTαβは基底外側の腸胆汁です電気化学的な胆汁酸濃度勾配9、10に依存輸入および輸出の両方として機能することができる酸トランスポーター。最近のデータは、NTCP、および/またはOSTαβによる胆汁酸輸送の際に、リガンド - FXR-LBD相互作用の結果として、FRET比の堅牢かつ高速応答を観察することができることを示しました。
ここで、我々は、そのような共焦点顕微鏡分析および蛍光セルソーター（FACS）などのFRETを測定する方法のための詳細なプロトコルを記述する重要なステップを強調表示し、潜在的な問題に対処し、別の方法を説明します。この遺伝的にコードされたFRETセンサーを使用して、FXR-LBDと胆汁酸との相互作用を定量化し、生細胞内で直接監視し、リアルタイムでの胆汁酸の輸送および動態を可視化する迅速かつ簡単な方法を提供することができます。 CytoBASとNucleoBASをコードする哺乳動物発現プラスミドは、市販されています。したがって、このバイオセンサーは、さらにに貢献することができます胆汁酸輸送体またはFXRを活性化し、胆汁酸の生物学およびシグナル伝達をより深く洞察を提供する化合物の理解。
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Protocol
1.一過性トランスフェクション
注：CytoBASとNucleoBASは（材料表を参照してください）が正常にいくつかの細胞型、（U2OS、Huh7細胞、HepG2細胞、H69、MDCKおよびHEK293T細胞）で使用されています。センサーを使用するための主な要件は、それが細胞に入るために、符号化DNAを必要とする、発現される必要があることです。
- 80％コンフルエント25cm 2のフラスコから細胞を回収します。特定の細胞株（U2OSとのHuh7細胞を10％FBS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）に適した完全培地中の細胞を希釈します。
- 滅菌8よくチャンバーカバーガラス（1.4 cm 2）とに所望の密度で細胞をプレート。これは必須ではないが、実験の日に、細胞のサブコンフルエント（60〜80％コンフルエント）層を目指します。
- ウェルあたり400μlの最終体積に完全培地を追加します。細胞を24時間付着させます。
- NucleoBAS0.5μgのを追加することにより、滅菌チューブ中でトランスフェクションミックスを調製または培養培地100μlにCytoBASのDNA（血清/抗生物質を含みません）。よくボルテックス。トランスフェクション試薬を加え、ボルテックスで混和します。最適な効率を与えるトランスフェクション試薬は、細胞型に依存しており、事前のテストが必要になる場合があり。
- 例えば、1 mg / mlのポリエチレンイミン（PEI）の2.5μLを使用して、DNA / PEIは、室温で15分間混合しインキュベートします。
- 細胞への液滴にトランスフェクション混合物を加え、穏やかに手でウェルプレートを振とうして混合します。 〜9.6センチメートル2のウェルについて、混合物の100μlのを追加します。一過性にトランスフェクトされた細胞のための個々のイメージング室のためのトランスフェクション混合物の10μLを使用します。
注：24-48時間後、細胞は、胆汁酸センサーを発現する実験のために使用することができます。
2.安定なトランスフェクション
- 80％コンフルエント25cm 2のフラスコから細胞を回収します。特定の細胞株（10％ウシ胎児Sに適した完全培地中でペレットを希釈U2OSとのHuh7細胞についてerum、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）mlで150,000細胞の濃度を、6ウェル培養プレート（2 mlの端容量）でウェルあたり30万人の細胞を加えます。
- 細胞を24時間付着させます。
- 培地（血清/抗生物質を含まない）の100μlに（材料表を参照してください）CytoBASまたはNucleoBAS DNA0.5μgのを追加することにより、滅菌チューブ中でトランスフェクションミックスを調製します。よくボルテックス。トランスフェクション試薬を加え、ボルテックスで混和します。
- 例えば、1 mg / mlのポリエチレンイミン（PEI）の2.5μLを使用して、DNA / PEIは、室温で15分間混合しインキュベートします。
- 細胞への液滴中のトランスフェクション混合物の100μLを加え、穏やかに手でウェルプレートを振とうして混合します。安定な細胞株を作成するときは、必ずトランスフェクトしていないコントロールが含まれています。
- 37℃、5％CO 2で細胞O / Nを成長させます。
- 製造業者のプロトコールに従ってトリプシン処理細胞（37℃ワットで細胞をインキュベートしますi番目の1.5ミリリットルを25cm 2の細胞培養あたりのトリプシンを予熱し）し、室温で5分間250×gで、それらをスピンダウン。上清を除去し、完全培地13 ml中に細胞を再懸濁。 0.5ミリリットル（低密度）、1.5ミリリットル（中密度）、および4.5ミリリットル（高密度）：様々な直径10cmの培養皿の上にセルを分割します。 6.5ミリリットルの残りについても同じ操作を行います。
- 10 mlの最終体積に培地を加えます。 U2OS細胞の場合、そのようなCytoBASとNucleoBASは陽性細胞を選択するための構築物としてネオマイシン耐性カセットを有するプラスミドを800 / mlのG418を使用しています。この濃度依存性の細胞型で、非トランスフェクト細胞は、（U2OS細胞を800μgの/ mlのG418）2〜10日以内に死亡した最低の抗生物質（G418）の濃度を選択することによって決定することができます。
- 非トランスフェクト細胞が死んでいるまで、適切な抗生物質（G418）を含む培養培地ごとに72時間を更新します。
- 20Xの目的のために顕微鏡下で培養プレートを調べ陽性コロニー（蛍光緑、シアンや黄色の蛍光のために使用されるほとんどのフィルターセットを使用して監視することができます）。
- 培養皿の外側の底にペンで他のコロニーから単離し嘘陽性コロニーをマーク。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回プレートを洗浄し、それを吸引除去します。約15無菌クローニングシリンダーを取り、無菌のシリコーンにそれらを浸し。ペトリ皿に軽く押すことによって選択されたコロニーの周りにそれらを適用していない複数のコロニーをクローニングリングに含まれていることを確認します。
- ピペット20クローニングシリンダー内の予熱したトリプシン（1倍、0.25％）のμLと切り上げた細胞のほとんどは、（顕微鏡で観察）まで37℃でインキュベートします。
- クローニングシリンダー内（U2OSとのHuh7細胞を10％FBSおよび800μgの/ mlのG418）血清および適切な抗生物質を培地150μlを添加して、ダウン細胞を再懸濁し、96に転送するには、いくつかの回をピペットとウェルプレート。 4-24時間後に培地を更新し、細胞が数日（37℃、U2OSとのHuh7細胞について、5％のCO 2）でコンフルエントに成長することができます。
- 3日または4日ごとに抗生物質を含む培地をリフレッシュします。細胞がコンフルエントに成長しているときに、大きなウェルプレートに移します。文化は実験のための十分な大きさになるまで、この手順を繰り返します。バックアップのためのいくつかのバイアルを凍結保存。凍結保存培地は補充物を含まない培地（DMEM）中の20％FBSおよび20％DMSOから成ります。
注意：ここで、細胞株は、モノクローナル抗体および胆汁酸センサーを表現するための安定であると考えられます。抗生物質G418（400μgの/ mlで）の半分の濃度は、現在安定した細胞株での発現を維持するのに十分です。
3.レンチウイルス形質導入
注：一部の細胞株は、例えば、ポリエチレンイミン（PEI）法などのより伝統的な方法によってトランスフェクトすることは困難と考えられています。細胞のウイルス形質導入は、効率的な代替ツールFでありますまたは遺伝子送達と安定した導入遺伝子の発現。
- 80％コンフルエント25cm 2のフラスコから細胞を回収します。特定の細胞株に適した完全培養培地中の細胞（U2OSとのHuh7細胞を、10％FBS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）で希釈し、6ウェル培養プレートにウェルあたり約200,000細胞を加えます。
- ウェル当たり2ミリリットルの最終容量まで培地を追加します。細胞を24時間付着させます。
- （リクエストに応じて利用可能）培地を含有する500μlのCytoBASのレンチウイルスに4-6時間、細胞をインキュベートすることによって、ウイルス形質導入を行い10 / mlのジエチルアミノエチル（DEAE） - デキストランまたは他のレンチウイルスを含む完全培地で1ミリリットルの合計量まで充填形質導入増強剤。形質導入されていない対照細胞とよくを含めることを忘れないでください。
- 培地を除去し、所望の抗生物質（500 / mlのハイグロマイシン）を含む完全培地2 mlを加え。提供CytoBAS伝達のためのレンチウイルス構築物を使用してくださいS細胞にハイグロマイシン耐性。所望の条件下で細胞を増殖させます。
- すべて陰性対照細胞は、（ほとんどの細胞株について約1〜2週間かかります）死んでいるまで、（500 / mlのハイグロマイシン）、抗生物質3日ごとに培地を更新したときに80％のコンフルエント細胞を分割します。細胞株は、現在胆汁酸センサーを発現する安定したと考えられています。
- また、1〜3日ウイルス形質導入後の実験のための細胞を使用しています。生きたウイルスが存在する可能性があるように、これは適切な安全レベルの部屋でFRET-読み出し装置を必要とします。
- 代替的に、安定な細胞株の迅速な単離のために、蛍光活性化細胞選別（FACS）を行います。
- コンフルエント160センチメートル2フラスコから細胞を回収します。
- 1ml当たり最大5×10 6細胞の濃度を<5％血清を含むリーボビッツ培地中の細胞（L-15培地）で希釈
- 選別された細胞の収集のために、収集培地1ml（L-1をFACSチューブを埋めます5培地+ 1.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％のL-過剰及び20％血清）。
- 405レーザーで励起シトリン（520から580ナノメートル）またはセルリアン（450から520 nm）でのソート細胞。
- 約500,000個の細胞をソーティングした後、細胞（5分、250×gで）をスピンダウンし、5 ml中に再懸濁し、通常の完全培地（10％FBS、250 / mlのハイグロマイシンU2OSとのHuh7 CytoBAS細胞）およびT25培養でそれらをめっきフラスコ。所望の条件（37℃及びHuh7細胞U2OS細胞について、5％のCO 2）で細胞を成長させます。
胆汁酸センサー4.ライブ細胞イメージング
注：胆汁酸輸送体を含む細胞は、親油性化合物を削除する1〜10％の炭ろ過血清を含む培地で培養することができます。正常血清は、多くの場合、胆汁酸センサーの細胞内の胆汁酸の蓄積と飽和につながる可能性胆汁酸が含まれています。
- 共焦点顕微鏡を使用して、FRET測定
- 安定細胞またはtransieのプレートntly無菌の8ウェルカバースリップ底チャンバースライドに所望の密度でセンサーを表現（1.4 cm 2）が必要です。実験の日に、密集度が約60〜70％となるように（木炭濾過した血清を使用して）完全培地中で細胞を増殖させます。
- PBSまたはリーボビッツのL-15培地1×200μlで一度チャンバースライドで接着細胞を洗浄。
- 何のCO 2の制御が必要でないように吸引し、300μlのリーボビッツのL-15培地と交換してください。
注：フェノールレッドなしのDMEMも同様に使用されるが、CO 2緩衝条件を必要とすることができます。胆汁酸センサーショー（一部）pH感受性はそれほどデータ収集中のpHを一定に保つことを目指しています。 - L-15培地中でも、共焦点イメージング実験において使用される化合物を希釈します。 、撮像中に、チャンバー内の液体の比較的大量の試料（50〜100マイクロリットル）の急速な混合を確保するために添加しなければならないことを考慮してくださいそう3-5xソリューションを作ります。
- 37℃のインキュベーションチャンバーと共焦点顕微鏡の画像処理ソフトウェアを起動して、紫色の405nmレーザーをオンにします。客観的にイマージョンオイルの滴を入れて、その上に8室を配置します。 FRETの単一細胞イメージングのために、63X油の目標を使用しています。センサーが正常に室温で使用されてきたが、細胞の挙動を変更することがあります。
- 適切に共焦点顕微鏡の設定を行います。
- 取得モードを設定します。XYT（単一焦点面のタイムラプスイメージング）。
- 化合物は、実験を一時停止することなく、取得の間に追加することができるように、20秒間隔で画像を取得します。
- セルリアン：発光検出のための設定スペクトル範囲450から520 nmの。シトリン：520から580 nmの。
- 透照光を用いた単一細胞層に焦点を当てています。撮影を開始し、より正確にz位置を調整します。ゲインを調整したままでバックグラウンドからの信号を区別するために、各チャネルのオフセット目的の細胞内の全ての画素についても飽和下る。
- 関心領域（ROI）を定義するために円を描画します。同様の蛍光強度を示す細胞を選択します。明らかに大きさや形状に平均セルと異なるセルを避けてください。センサの光退色を最小限にするために、できるだけ短時間で光に細胞をさらします。これは、細胞周辺部に非常に近接していないのROIを描画することをお勧めします。この領域は、焦点によるドリフト（z方向に移動する細胞）がより困難に実験中の蛍光比の変化を監視することに蛍光強度の変化に最も敏感です。
- 共焦点顕微鏡を用いて測定を開始します。セルリアンとシトリン蛍光が安定するまで待ちます。
- 測定時に選択された時点で50〜100μlの胆汁酸または他の化合物を追加します。液体（最終容量の1/3に五分の一）の比較的高い量は、/ P振盪せずに（10秒以内）よく流体を混合するために必要です上下ipetting。ピペットチップで8ウェルチャンバーの縁に触れ、細胞が焦点から出ないように、ゆっくりと液体を追加しないことを確認してください。プラトー期に達する前に、新しい化合物を添加しないでください。これは、約200秒かかります。
- 100μlのGW4064、最終濃度5〜10μM（センサ飽和用量）を加えて、各実験を終了し、センサー蛍光が安定するまで待ちます。
- 実験を保存して、.AVIファイルとしてデータをエクスポートします。
- プラグイン>スタック>スタックのインターリーバを選択することで、ImageJの両方のAVIファイル（01チャンネル、シトリンチャンネル00、セルリアン）で開きます。 （http://www.openmicroscopy.orgで入手可能）は、適切なプラグインを使用して直接イメージJで別の方法として、インポート共焦点ファイル（ 例えば、.lsmまたは.lifファイル）と4.1.14のステップに移動します。
- スタック1の場合：チャンネル01（シトリン）を使用します。
- スタック2の場合：チャネル00（セルリアン）を使用します。
- [編集]> [選択]をクリックして[追加]> [マネージャに、ROIマネージャ]ウィンドウを開きます。チェックボックス「すべて表示」をチェックしてください。
- 楕円形選択ツールで特定のセルをカバーする利息（ROIを）のいくつかの領域を描画します。また、バックグラウンド信号を決定するためにセンサーを発現しない細胞外または細胞内の領域内の1つの円を描きます。それが原因焦点ドリフト（z方向に移動する細胞）または細胞移動の蛍光強度の変化は明らかだったときの実験では、細胞周辺部に非常に近接していないのROIを描画することをお勧めします。
- 一つのセルを選択します。プラグイン>比率プロファイラをクリックします。 RAW、比とRatio_Profile：これは、3の画面になります。 RAWウィンドウは、FRETがある場合シトリン（青線）の強度の増加と紺碧（赤線）の減少を示しています。比ウィンドウは、FRETの増加に伴って増加しますセルリアン比シトリン/についての情報を提供します。 Ratio_Profileウィンドウは、両方のチャネルで測定された蛍光強度の実際の数を示します。 MICROS場合ファイルは、チャンネル順序を逆可能性があります使用されているセットアップ固有のファイル（ 例えば、.lsmまたは.lifの代わりに.AVI）を対応。
- 補足データとして添付のスプレッドシートにRatio_Profileウィンドウからデータをコピーします。他のすべてのセル（と背景ROI）についても同様にします。
注：オンライン表計算では、すべてのデータが最大BAS活性化が予想される状態に正規化されます。 GW4064は、FXRの最も強力な活性化因子であることを考えると、GW4064の余剰とのインキュベーション後の蛍光比が1に設定されているこれは、GW4064を添加した実験の全てを終了することが重要です。これの利点は、データがもはやより容易に比較することができ、別の日に、レーザ強度又は検出器利得及び実験に依存しないことです。また、スプレッドシートの下のグラフでは、実行中の平均値は、実験ノイズの曲線を平滑化するために使用することができます。動的データを分析するときただし、実行中のアベラので、このグラフを使用しないでくださいGEはまた、速い動的応答を滑らかにします。
- 蛍光活性化セルソーティングを使用したFRET測定（FACS）
- 無菌FACS取り込みバッファー（0.3 mMのEDTA、0.5％のBSA、0.01％NaN 3を、10 mMのD-グルコース）でのFACS実験の全ての化合物を希釈します。
- PBS中の5mMのEDTAを用いて80％コンフルエントなT-160 cm 2の細胞培養フラスコから収穫細胞。 5分間250×gで遠心分離した細胞。 RTで5ミリリットルのFACS取り込みバッファに細胞ペレットを2回洗浄します。
- コールターカウンターや計数チャンバーを用いて細胞を数えます。
- 1×10 6細胞/ mlの濃度になるようにFACS取り込み緩衝液中でペレットを希釈します。単一細胞の均質な懸濁液を作成するために、上下にピペット。細胞は脱凝集するのが困難である場合は、ノズル目詰まりを最小限に抑えるために選別前の細胞ストレーナーを通してサンプルを置きます。
- FACSチューブあたりピペットで200μlの細胞と光から保護。
- 化合物の所望の濃度を追加する（ 例：、胆汁酸、合成FXRリガンド、トランスポーター阻害剤）。渦。 （暗所では）振とうしながら室温で20〜30分間インキュベートします。
- 一方、FACSを（レーザーはウォームアップ時間が必要）を起動します。
- 実験のためのフローサイトメトリー・ゲーティングのパラメータを設定します（ 図3を参照）。
- ゲートを決定するために、細胞をトランスフェクト10〜20万NucleoBASまたはCytoBAS周りロード。
- 最初のプロットの中心にセルをプロットするFSCとSSCの電圧を調整します。
- 青紫色レーザを用いて、セルリアン（40分の450 nm）の電圧値とシトリン（20分の525 nm）の電圧を調整し、すべてのNucleoBASまたはCytoBAS陽性細胞は散布図内にプロットされていることを確認してください。
- 正しいゲート（門P4までのゲートP1）を設定し、 図4を参照してください 。
- SSC-A / FSC-プロットの中央にメイン集団を選択することにより、通常は左下隅に表示された死細胞を排除するためにゲートP1を使用してください。
- でゲートP2を使用してくださいFSC-H / FSC-ウィンドウは分析からデュプレットを削除します。単一細胞が二重以上の対角線に提示されています。
- シトリンでゲートP3（20分の525 nm）の/セルリアン（40分の450 nm）のウィンドウがシトリンと紺碧の高い細胞をゲートすることによって、NucleoBAS / CytoBAS陽性細胞を選択するために使用することができ、人口が右上に斜めに表示しましたプロット。
- できるだけ近い人口の左上にあるゲートP4を、描画し、細胞の5％以下は、このゲート内に収まることを確認してください。
- 自家蛍光を決定するためにいくつかの非トランスフェクト細胞（CytoBASまたはNucleoBASの発現なし）をロードします。トランスフェクトしていない人口は、ゲートP3に配置されない場合があります。自動蛍光細胞を排除するために、必要なときにゲートP3を調整します。
- FACSにチューブを配置する前に、サンプルをボルテックス。各サンプルについて、ゲートP3に少なくとも10,000細胞を測定します。
注：人口階層ウィンドウは、イベントの数を示します親ゲートの各ゲートと％を表示されています。ゲート4には、親の％はすべてNucleoBAS陽性細胞の割合として増加シトリン/セルリアン比で細胞を述べています。
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Representative Results
提示FRET-BASセンサはFXRのリガンド結合ドメイン（LBD-FXR）2つのフルオロフォアシトリンと紺碧に取り付けられている）とLXXLLモチーフに基づいています。このセンサは、高い空間分解能と時間分解能（ 図 1 A）と生細胞内で胆汁酸輸送の調査を可能にします。セルリアンとシトリンの変異は分子内複合体（ 図 1 B）の形成を促進するために適用しました。胆汁酸および他のFXRリガンドは、FXRに結合し、それによりコンホメーション変化によってシトリンと紺碧の間の距離を変化させます。哺乳動物生細胞では、これは、増加したFRET効率（シトリン増加、セルリアン減少）（ 図 1 C 1 D）が得られます。共焦点顕微鏡を用いて生細胞の定量的強度に基づくFRET実験の間に、私tは平均シトリン/セルリアン比はGW4064（5μM）（ 図での処理後に著しく増加したタウロケノデオキシコール酸（TCDCA）は、FRETの変更を示していない胆汁酸トランスポーターを欠くNucleoBASを表す（30μM）U2OS細胞を処置されたことが観察されました1 C）。これとは対照的に、U2OS細胞を共発現NucleoBAS、NTCPとOSTαβはTCDCAを添加するとシトリン/セルリアン比の明らかな増加、及びGW4064の追加（ 図 1 D）後の比でさらに大きな増加を示しました。これは、TCDCAが細胞膜を通過することができず、細胞に入るために、特定の輸送体を必要とすることを示しています。
センサーの細胞局在は、特定の局在化シグナルの存在によって決定されます。 NucleoBASは、核局在化シグナル（ 図 <によって核に標的化されますCytoBASは任意の局在化シグナルを含んでいるので、サイトゾル（ 図 2 A）に残っていませんが、強い> 2 B）。バイオセンサーは、同じ細胞におけるタンパク質の発現/局在化およびFXR活性の測定を可能にする、他の蛍光タンパク質の画像化と組み合わせることができます。例えば、 図 2 のCは、U2OS細胞はNucleoBASとNTCP-mKate2で同時トランスフェクトを示しています。さらに、センサは、同時に複数のパラメータの細胞内イメージングのために他のセンサーと組み合わせることができます。例えば、NucleoBASはTGR5（ESTクローンIMAGE番号5221127）、同時に同じセル内TGR5とFXRの活性化を測定するためのcAMPの細胞質ゾルセンサー（TのEpac VV）11と一緒に発現させました。核におけるFXR活性化は可視であったTGR5に結合すると、cAMPレベルは、cAMPのセンサーによって検出された細胞質ゾルに増加しました同時にualized。 図 2D-F GW4064（5μM）（ 図 2 D）で処理した後NucleoBAS-TGR5- TのEpac VV細胞の6共焦点画像で構成される時系列を示し、TCDCA（10μM）（ 図 2 E）を伴うまたはケノデオキシコール酸（CDCA） （10μM）（ 図 2 F）= 0緑色のに比べて、放射率（FXR活性）の増加を表す450分の525 nmの放射率が低下する領域（cAMPの上昇を表す）とピンク色を表し、tの実験開始時の比。
また、フローサイトメトリー単一細胞レベルまたは集団全体での高スループットスクリーニングにおける細胞のプールをスクリーニングすることができます。 NucleoBASを発現しているU2OS細胞はexcitました紫405 nmのレーザーと蛍光とEDがシトリンのためのセルリアンと20分の525レンジの40分の450の範囲で収集しました。 FACSベースのFRET実験の効率を向上させるために、適切なゲート（図3）に設定されなければなりません。 P1のゲートは、細胞の破片を除外し、P2のゲートは、分析からデュプレットを削除します。次に、分析は（488レーザーで励起）と紺碧（405レーザーで励起）最後にゲート3により陽性細胞シトリンに制限され、ゲートP4は高シトリン/セルリアン発光比を有する細胞の割合を表す（紺碧の励起を使用して、 405nmのレーザー）を持ちます。各サンプルについて、ゲート3に減少した少なくとも10,000個の細胞を測定しました。
その後、FACSベースのFRETのフローサイトメトリーは、TCDCA及びGW4064での30分間のインキュベーション後に、生細胞におけるFRETの増加を計算しました。 NucleoBASを発現する非処理されたU2OS細胞は、ゲートP4の<5％の細胞（シトリン/ Cを示しましたerulean-high細胞）。任意の胆汁酸輸送体の非存在下では、同様の割合は、30μMTCDCA処理した細胞（ 図 4 A）で観察されました。これとは対照的に、細胞を共発現NucleoBAS、NTCPとOSTαβは約38％のシトリン/セルリアン-high細胞の量の増加を示しました。 10μMのGW4064を加えた後、細胞のほぼ90％がOSTαβやNTCP（ 図 4 B）の発現のシトリン/セルリアン高にかかわらずでした。データは棒グラフ（ゲート4％の細胞集団4）（ 図 4 C、D）またはシトリン、セルリアン比（ 図 4 E、F）の集団のヒストグラムとして提示することができます。
F胆汁酸センサー（BAS）の igure 1. デザイン。（A）遺伝的にコードされた胆汁酸センサーの作用様式の構造表現。これは、ドナーフルオロフォア（セルリアン）とアクセプターフルオロフォア（シトリン）FXR-LBDを介して連結されたとFXR補因子ペプチド（LXXLLモチーフ）に融合した構成されています。 （B）BASの概略ドメインアーキテクチャ。 Q204F / V224Lの蛍光体変異はセルリアンとシトリンの間に分子内相互作用の形成を促進します。 CytoBAS構築物は任意のターゲティング配列を欠いているので、サイトゾル局在化を示し、一方NucleoBAS構築物は、C末端核局在化シグナル（NLS）を含有し、したがって、核内に蓄積します。 （C）抱合胆汁酸輸送を監視するためのツールとして、BASと代表共焦点ベースのFRET実験。シトリン/セルリアン比の変化は細胞内で、30μMのTCDCAの添加のみEXP後に観察されませんressing NucleoBAS。 5μMGW4064を添加した場合、大幅に増加シトリン/セルリアン比が観察されました。 TCDCAの（D）輸入（30μM）NTCPとOSTαβ同時トランスフェクト細胞では、センサのかなりの活性化を引き起こします。その後のGW4064（5μM）治療はシトリン/セルリアン比のさらなる増加につながります。結果は平均±SDとして表され、N = 6個々の細胞である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2。ローカライゼーションFRET-BAS生細胞において構築物。CytoBAS（A）またはNucleoBAS（B）をトランスフェクトしたU2OS細胞の共焦点顕微鏡像。 （C）U2OS細胞共同TRANNucleoBASとNTCP-mKate2でsfected。スケールバーは10μmで表しています。 （D - F）NucleoBAS-TGR5- T EPAC VVトランスフェクトされた細胞の時系列。 （D）GW4064は、FXRを活性化させるには、TGR5（450分の525 nmの比率を増加させた）、ではありません。 （E）TCDCAは（450分の525 nmの比の減少）、原形質膜にTGR5を活性化するが、核内でFXRを活性化するために細胞に侵入することができません。 （F）CDCAは、核内に、原形質膜上のTGR5と同様にFXRを活性化する（細胞質では減少、核内で450分の525 nmの比率を増加させた）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3。ゲーティングparameteフローサイトメトリーRS。（A）SSC-A / FSC-ウィンドウでP 1のゲートは、死細胞を排除するために使用されます。 FSC-H / FSC-ウィンドウ（B）は 、P2のゲートは分析からダブレット事象を排除するために描かれています。 （C）シトリン（20分の525 nm）の/セルリアン（40分の450 nm）の窓、NucleoBAS（およびCytoBAS）で陽性細胞が（ゲートP3）が選択されています。 （D）最後に、シトリン中（20分の525 nm）で/セルリアン（40分の450 nm）の窓、P4のゲートは、FACS実験のシトリン/セルリアン-high細胞が含まれています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図 4。 NucleoBASを使用して、胆汁酸輸送を測定する代表的FACS実験。（ シトリン/セルリアン-高い生活NucleoBAS発現U2OS細胞（A）およびU2OS細胞制御バッファ（左）、30μMで処理した後NucleoBAS、OSTαβとNTCP（B）を共発現量を示す>、B）のFACSプロットTCDCA（中央）または10μMGW4064（右）。 NucleoBAS及び（D）または（C）OSTαβおよびNTCPなしに同時トランスフェクションを発現するU2OS細胞におけるTCDCAまたはGW4064での30分間のインキュベーション後シトリン/セルリアン高細胞の割合を示した（C、D）バーグラフ。 （E、F）TCDCA（黄色）との30分間のインキュベーション後OSTαβおよびNTCPの有無にかかわらずNucleoBASを発現しているU2OS細胞、GW4064（赤）または対照緩衝液（青）の集団においてシトリン/セルリアン比の分布を示すヒストグラム。すべての条件を3回測定しました。バーは平均値+標準偏差（SD）を表す（N = 3）。ttps：//www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、生きた細胞内の胆汁酸輸送の時空間ダイナミクスを監視することができる新規な遺伝的にコードされた胆汁酸センサーを使用するための詳細なプロトコールを提示します。このバイオセンサーは、それによって、FRETベースの胆汁酸センサー（BAS）を形成する、FXR-LBDに融合されセルリアンとシトリン蛍光タンパク質で構成されています。
細胞培養およびFACSまたは（共焦点）顕微鏡の基本的な経験をしたとき胆汁酸センサーは、使用中の比較的簡便です。しかし、いくつかの側面は、いくつかのトラブルシューティングが必要な場合があります。胆汁酸輸送体と組み合わせた胆汁酸センサーを使用する場合には、木炭濾過血清を含む培地中で細胞を培養することが推奨されます。木炭は、さらに血清からの吸着によって胆汁酸のレベルを低下させます。これは非感受性センサーの最も一般的な原因であるため、特に、NTCPなどの輸入の存在下では、これは、培養中のセンサの飽和を防ぐために重要です実験中。そのため、他のセンサは、より大きなダイナミックレンジ8を作成し 、胆汁酸に対する感度を変更する突然変異を含む（NucleoBAS N354K / I372V）が作成されました。センサが既に飽和しているかどうかを定義するために、シトリン/セルリアン比は、これらの細胞を低細胞内の胆汁酸レベルを有すると仮定されるので、任意の胆汁酸トランスポーターを発現しない対照細胞における比と比較することができます。あるいは、蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）の測定は、強度に依存しない方法12にFRETを調査するために行うことができます。この技術は、本論文の範囲を超えて、さらに特殊な装置を必要とします。鈍感センサーの他の理由は、自己蛍光および/またはNucleoBASに発現を失った細胞の使用を含みます。注目すべきは、実験中（例えばによる焦点シフトする）紺碧とシトリンの強度の変動は一方で、撮影時のFRET変化の直接的な可視化を曖昧にすることができますセンサのレシオメトリック性質はまだ胆汁酸動態のモニタリングを可能にします。比率の増加は明らかであるが、多くの場合、絶対強度の変化は、FXRリガンドの添加の際に個々のフルオロフォアのために控えめです。
BASセンサーでトランスフェクトした細胞におけるFRET分析のために、適切なレーザー光とフィルタが選択されるべきです。 FRETの間シトリン強度の増加は、450から520（紺碧）および520から580（シトリン）にわたって監視排出量紫色ダイオード（405 nm）のレーザーを用いて測定する必要があります。考慮すべき重要な側面は、光退色に対するセンサの感度です。一方または両方のフルオロフォアの強度は徐々に配位子を添加しない時に低下するとき、それは、多くの場合、光退色を示しています。レーザパワーが高すぎる場合、この現象は、主に発生します。この望ましくない効果を回避するために、レーザパワーは、フルパワーの5％を超えないように、細胞は可能な限り暗所に保存しなければなりません。制限右のセルを検索するための時間。蛍光強度の変動も、z軸における焦点ずれによって引き起こされ得ます。これに対抗するために、ピンホールのサイズを大きくすることができ、セル境界に非常に近接していない関心領域を描画することが望ましいです。
胆汁酸のためのFRETセンサーは、トランスフェクトし、安定した表現型を有することができ、複数の細胞型（U2OS、Huh7細胞、HepG2細胞、H69、MDCKおよびHEK293T細胞）で試験されています。しかしながら、そのような肝細胞などの一次および分化した細胞は、トランスフェクトすると、特性的に安定維持することが困難です。ウイルス形質導入は困難なトランスフェクト細胞（リクエストに応じてご利用いただけ構築）を支援することができます。我々は現在、急速に分離すると脱分化新たに単離された一次細胞におけるセンサの使用を可能にするために、マウスのラインを生成しています。
記載の共焦点実験を行うためには、選択された細胞株が培養皿に付着していることが不可欠であり、Si中の成長しますngle細胞層。しかし、むしろ容易にトリプシン処理することができ、懸濁液中で増殖する細胞、または付着細胞は、また、FACSを用いて測定することができます。最後に、特定の輸送経路を分析する際に、内因性胆汁酸輸送または合成することなく細胞株を選択することをお勧めします。 すなわち 、特定のトランスフェクトされた（変異型）トランスポータータンパク質の活性を測定する場合。
提示遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーBASは、単一の生細胞の胆汁酸輸送を監視するための貴重なツールです。 BASは、胆汁酸の細胞内8ダイナミクスのイメージングを可能にする、胆汁酸の多種多様によって活性化されるFXR-LBDが含まれています。これは、他の技術の使用に関連して大きな利点を与えます。例えば、プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ルシフェラーゼシグナルは、細胞内の情報をサポートしていない、細胞内のレポーターの安定性に依存しており、サンプルの破壊を必要とします
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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