Introduction
技术的进步往往沉淀飞跃的神经生物学过程的理解。例如，汉斯Berger的发现于1929年，从人的头皮记录电势采取正弦波的形式，其频率直接与受试者的觉醒状态的水平，导致在睡眠觉醒的理解迅速进展法规，在动物和人类一样的。1为了这一天的electroencephlogram（EEG），与肌电图（EMG）， 即相结合，由骨骼肌产生的电活动，代表了几乎所有的实验和临床数据“脊梁”评估，即寻求相关行为和生理与皮质神经元的行为动物，包括人类的活动。在最基本的睡眠研究实验室这些脑电图记录是通过使用一个基于电缆的系统（图1），其中获得ð执行ATA进行离线到图案和频谱分析[例如，施加快速傅立叶变换（FFT）算法]来确定受试者的警觉状态被记录。2，第3睡眠由快速眼动（REM）和非快速眼动（NREM）睡眠。 REM睡眠的特征在于快速低压脑电图，随机眼球运动，和肌肉弛缓，一种状态，其中的肌肉得到有效瘫痪。 REM睡眠也被称为异相睡眠的，因为大脑活动类似于觉醒，而体是来自大脑的主要断开，似乎是在深度睡眠。与此相反，运动神经元期间NREM睡眠刺激但没有眼睛运动。人NREM睡眠可分为4个阶段，其中第4阶段被称为深睡眠或慢波睡眠，并与0.5之间的三角活动确定大的，缓慢的脑电波 - 4赫兹的脑电图。另一方面，在较小的动物NREM睡眠的相之间的细分，象大鼠次的小鼠，还没有建立，主要是因为它们在人类可见没有睡眠的长综合时间。
多年来，和脑电图解释的基础上，几种模式的睡眠觉醒调节，既电路交换和体液为基础，已经被提出。神经和睡眠的需要，或者细胞基础“睡眠驱动器，”仍然没有得到解决，但已被概念化为衡压力在清醒周期的建立，是由睡眠消散。有一种说法是，在觉醒，他们的点滴积累是睡眠衡压力托底内源性somnogenic因素的累积。虽然睡眠是通过体液因素的调控的第一个正式假说已记入出版罗森鲍姆的工作，于1892年4，这是石森5,6和 Pieron 7谁独立，并在100多年前，展现了促睡眠的化学物质的存在。这两个研究人员提出，事实上证明，这hypnogenic物质或“hypnotoxins”存在于睡眠剥夺狗的脑脊液（CSF）8近百年来牵连的睡眠自我平衡过程中的几个额外的假定hypnogenic物质已被确定（综述见文献9），包括前列腺素（PG）的D 2，10细胞因子，11腺苷，12花生四烯酸乙醇胺，13和尾加压素II肽。14
在初期和中期，20 世纪产生的结果，鼓舞睡眠和清醒和电路为基础的理论在一定程度上由Economo 15，16，Moruzzi和Magoun 17，和其他人的实验工作，盖过了当时的体液学说睡觉。到目前为止，几个“电路模型”已经提出，每一个通知不同的质量和数量的数据（综述见参考文献18）。一种模式例如提出，慢波睡眠是通过从胆碱能神经元在基底前脑，区域主要consisiting布罗卡的对角线频带和质inominata的水平肢的细胞核的腺苷介导的抑制乙酰胆碱的释放产生的。睡眠/觉醒第 19另一种流行的模型描述的触发器开关机构的睡眠诱发的神经元之间的腹外侧视前区和下丘脑和脑干相互抑制相互作用唤醒诱导的神经元基础上的。18，20，21此外，对于在进出REM睡眠的开关，一个类似的往复抑制相互作用已提出在脑干区域，即腹侧导水管周围灰质，横向脑桥被盖，和sublaterodorsal核。22总的来说，这些模型已经证明有价值启发式和提供重要的解释性框架，在睡眠的调查研究;然而，一个叶的分子机制和电路调节睡眠 - 觉醒周期的叔更全面的理解将需要其组件的更完整的认识。该系统为印刷业记录下文详述应该有助于这一目标。
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Protocol
伦理声明：涉及动物主题程序已经批准在筑波大学的体制动物实验委员会。
1.准备电极和电缆脑电图/肌电图记录
- 按照下列程序准备脑电/肌电图记录电极。
注意：电极是一次性的，并且只能用于1动物。认真规划所有连接器的接线配置。将标记的连接器正确的方向。- 焊接一个4针接头的每个引脚到2厘米的不锈钢丝。简言之，把导线到销的一个端部，放置一个热烙铁到丝销接头，和熔体一些焊料以保证足够的刚焊接操作顺利进入关节。要小心，不要过多的热量适用于针;否则，绕销塑料就会熔化。
- 焊锡的每个附连到销头的头部2导线的自由端的1.0毫米直径的不锈钢螺钉。简言之，把导线以下面的螺丝头的螺纹的自由端，放置一个热烙铁到线螺纹接头，和熔体一些焊料以保证足够的刚焊接操作顺利进入关节。在2线与螺丝作为脑电图记录电极，而2线无螺丝作为肌电记录电极。
- 用剪刀剥离关闭1毫米绝缘的肌电电极年底增加了肌电图信号的质量。
- 完全覆盖所有的焊接管脚用环氧树脂胶粘剂用细木棍或牙签，以减少在脑电图/肌电图记录的电噪声。
- 对于如下所述的滑环连接电极准备的电缆。该电缆可重复使用。
- 焊接一个4针FFC / FPC连接器的每个引脚有30厘米的扁平电缆的电线。简言之，把导线到销的剥离端，放置一个热烙铁上线脚关节和一些熔化焊锡，以确保刚够焊料运行顺利进入关节。
注意：选择扁平电缆，它是适合用于脑电图/肌电图记录实验动物笼的高度的长度。 - 焊料卷曲套接字在扁平电缆的另一端的电线的前端。简言之，保持压接插座的导线的裸露自由端，放置一个热烙铁到丝窝接头和熔体一些焊料以保证足够的刚焊接操作顺利进入关节。
- 将每个压接插座成4位压接壳体。
- 完全覆盖用细木棍或牙签压接插座与环氧胶粘剂。
- 焊接一个4针FFC / FPC连接器的每个引脚有30厘米的扁平电缆的电线。简言之，把导线到销的剥离端，放置一个热烙铁上线脚关节和一些熔化焊锡，以确保刚够焊料运行顺利进入关节。
2.植入电极在小鼠头部（时间：约20分钟）
- 在消毒手术前一个热点珠灭菌所有的外科手术工具。麻醉雄性小鼠（10 - 20周龄，20 - 30克）腹膜内注射戊巴比妥（50毫克/千克）。检查鼠标深受捏脚趾麻醉后，刮胡子的头部和颈部与快船队的头发。
- 将鼠标移动到立体框架，并修复了2耳棒的头部。取适量涂抹于眼睛凡士林，以防止干燥。净化剃光皮肤用酒精和剪沿中线用手术刀，露出颅骨。剪辑肌肤保持手术区开放。
- 通过使用硬质合金铣刀（钻头尺寸：0.8毫米直径），钻头2个孔进入颅骨，一个比额叶皮质区（1毫米前方前囟，1.5毫米横向于中线）和其他在顶区（ 1毫米先于拉姆达，1.5毫米横向中线）的右半球，根据Paxinos和富兰克林的立体坐标。23
- 通过使用一个珠宝商的螺丝刀，在孔的地方不锈钢脑电图记录的螺钉，使2 - 2.5圈的每个SCRE瓦硬膜外定位在皮层。
注：请勿将螺丝钉过深，以防损伤脑组织。检查螺钉紧紧地固定在头骨。这是很重要的过程中的多个记录（通常，超过1个月）的长期具有稳定的EEG信号。威格利螺丝生产脑电图文物和可能的试验计划结束前脱落。 - 固定电极组件（参见1.1节，销向上翻）与瞬间胶的头骨，并盖上牙科水泥。请与斜方肌（颈）的肌肉镊子双边小孔，插入充当肌电电极插入孔的不锈钢丝。缝合用丝线（0.1毫米直径）的皮肤，以避免肌肉的曝光。
- 从立体框架取下鼠标。辖氨苄青霉素（100毫克/千克）和美洛昔康（1毫克/千克）经腹膜内给小鼠，以避免细菌感染并减少手术后疼痛，分别。柯EP鼠标上的隔热垫和监视它，直到它已经恢复足够的意识，以保持胸骨斜卧。房子单独恢复期间鼠标，以避免去除电极由其他动物，和管理美洛昔康（1毫克/千克）经腹膜内对手术后的第一天。
3.记录和采集脑电/肌电数据
- 后1周的恢复期，房子单独每只小鼠在实验笼放置在一个隔音录音室。保持23±1°C的环境温度和自动控制为12小时光照/ 12小时黑暗周期（开灯08:00，光照强度〜100勒克斯）。
- 鼠标头部脑电图/肌电电极组件连接到记录电缆。确保记录电缆被连接到一个滑环（其目的是使鼠标的移动并不限于由电缆的扭转）和脑电图/ EMG信号放大器。过滤EEG / EMG信号（EEG，0.5-64赫兹;肌电图，16-64赫兹），数字化以128赫兹的采样速率由模拟-数字转换器（A / D）和最后一台计算机上运行的EEG /肌电图记录软件（表'材料'， 第 4项上记录从底部）。
- ，观察者鼠标2 - 录音室中3天。如果EEG / EMG记录包括腹腔内药品监督管理部门，轻轻地在给药时处理鼠标上的每一个习惯一天。
- 随后，开始EEG / EMG记录软件（表'材料'，从下第 4项）。
- 选择“数据文件信息”选项卡，然后点击旁边的文件名框中。输入一个文件名，然后单击“保存”。
- 选择“录制状态”选项卡，并选中所有脑电图/肌电图通道将被记录下来。
- 在“录制条件”选项卡中选择采样频率（128赫兹）。
- 检查选择的通道是个正常显示E'频道信息“选项卡。
- 选择“定时设置”选项卡，然后单击“监视器”，显示脑电图和肌电图。
- 检查EEG / EMG信号显示正常。
- 选择“定时设置”选项卡，设置时钟时间记录在“主定时器”区域的开头和结尾。
- 点击“监视”中的“计时器设置”选项卡开始录制。
- 在基线记录 的EEG / EMG信号（ 即 ，自由表现小鼠的睡眠/觉醒行为）和不同的处理条件（如，咖啡因管理或假治疗）在几天。安乐死小鼠腹膜内注射戊巴比妥（200毫克/千克）的最后试验天之后。
基于脑电/肌电图的数据行为状态4.计分
- 启动软件脑电/肌电图分析（表'材料'，从底部4 个入口 ）。打开在步骤3中产生的脑电图/肌电图的原始数据（.kcd文件），点击“休眠”选项卡，选择大纪元时间。选择10秒。
- 点击“休眠”选项卡，选择“多筛选”自动得分全部10秒的时期分为3个阶段（ 即 ，NREM和REM睡眠和觉醒），脑电图和肌电图和功率谱分析的幅度的基础上，的脑电图。3
- 点击“FFT条件脑电图”。
- 设置参数为功率谱分析[256基准点（相当于2秒的脑电图），汉宁窗函数，以及5光谱每个时期的平均] 3点击“确定”。
- 点击“开始筛选'开始自动筛选。打开得分数据（.RAF文件）。
- 检查自动筛选结果，如果有必要，基于标准的标准手动纠正它们（见代表结果， 图1B 和表1 >）。2，3简而言之，单击并按住不正确的拿下了划时代鼠标左键并拖动光标跨越的错误打进时代的字符串。松开鼠标左键，在弹出的窗口中选择正确的行为状态。
注意：有时，时代在两个警觉状态之间的转换也难以明确比分一种状态。在这种情况下，历元应评价的表面上的状态，并且在同一标准应该被应用到类似的历元在整个实验，以保证数据的再现性。
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Representative Results
图1B示出的鼠标脑电图在不同警觉状态的例子。如表 1所示，信号出现时间被分类为NREM睡眠如果脑电图显示缓慢的大脑电波低于4 Hz的δ节奏和肌电图仅具有弱或无信号。时期被列为REM睡眠，如果脑电图显示6和10赫兹之间的θ范围内迅速低电压脑电波和肌电图显示低振幅。其他历元应归类为觉醒（即，低到中等电压EEG和发生EMG活动的）。
例如，在该协议中描述的脑电/肌电图记录设置可被用于确定下基线条件或含咖啡因的处理后的睡眠量和C57BL / 6小鼠的睡眠/清醒轮廓（ 图2和3）。
B项数基线条件，小鼠，这是夜间活动的动物，显示出明显的昼夜节律睡眠-觉醒节律，作为在光期间比在暗1（图2A）在这些图中看到的，具有较大的睡眠量。在12小时光照期，老鼠都表现出6.7小时和0.9小时NREM和REM睡眠，分别;在12个小时的黑暗期，而，失眠占优势（ 图2B）。另一方面，睡眠质量可以警觉状态和脑电图功率谱分析（图2C-F）的基础上进行评估。通常，EEG和EMG的裁纸录音可以用来确定发作持续时间分布，平均持续时间，并且对于每个警戒状态 （图2C-E）级转变数。而且，脑电图功率谱中的光与暗周期（图2F）和NREM REM睡眠中的小鼠显示了在0.5的频率范围内强烈的EEG功率密度- 4赫兹和6 - 10赫兹，分别为。应当指出的是，在REM睡眠脑电图包括少量增量波（0.5 - 4赫兹）时，由于NREM和REM睡眠的混合体的状态有时污染物。
为了评估对小鼠的睡眠-觉醒行为的药物作用，24-30脑电图和肌电图通常被记录，连续2天。在光照期的早期阶段在第1天上午10:00;以确定，例如，咖啡因对C57BL / 6小鼠的觉醒效应，24中的小鼠用赋形剂（腹腔以10ml / kg盐水）。动物，然后用咖啡因（15毫克/千克）治疗24小时后，和警惕的状态进行了分类下线到清醒，REM睡眠和NREM睡眠。 图3A显示脑电图，肌电图，和hypnograms的给药后的典型例子咖啡因（低级多导睡眠图）或媒介物（上部多导睡眠图）在C57BL / 6小鼠。咖啡因increASED觉醒在C57BL / 6小鼠的2.8倍的量的注射（图3B）经过3小时。
图1.睡眠生物测定系统的小鼠。
（a）监测脑电信号，不锈钢螺丝注入硬膜外超过1半球的额叶皮层和顶叶区域。此外，EMG活动是由斜方肌内双边置于不锈钢丝监测。（B）中为10秒脑电图，肌电图，和脑电图功率密度的NREM或REM睡眠或清醒的小鼠中典型的例子。在NREM睡眠，脑电图显示高幅波;和增量带（0.5 - 4赫兹）是占主导地位的（左）。在REM睡眠，脑电图显示低振幅波与θ波带（6 - 10赫兹）占主导地位（中）。在清醒时，EEG表示低振幅波，不带频率是占主导地位的（右）。肌电信号较低两个NREM和REM睡眠比在觉醒。 请点击此处查看该图的放大版本。
在基线状况在C57BL / 6小鼠的脑电图/肌电图记录评定图2.睡眠-觉醒配置文件。
（一）在每一个行为阶段时量时间变化。白及以上的 X -axes黑棒表示光照和黑暗时期，分别。（B）的每个阶段的合计量为12小时显示NREM和REM睡眠期间的光周期较大量与在黑暗时期相比较。 （三）电子商务配送每个阶段的pisode持续时间。（D）的平均数每个阶段持续时间较长为觉醒在黑暗时期。（E）的过程中的光周期的每个阶段的阶段转变数表示更频繁的转换。（F）的脑电图NREM期间功率谱和REM睡眠基本上未显示的明暗周期之间的功率密度的差异。数据表示为平均值±SEM（N = 5）。 * P <0.05，** P <0.01，所评估的成对双尾学生的t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图咖啡因脑电图/肌电图记录评估3.觉醒的影响。
。（B）的时间的课程“1”>（A）的觉醒与咖啡因。（C）的觉醒处理过注射咖啡因后3小时内的小鼠。数据表示为平均值±SEM（N = 5）。 ** P <0.01相比，车辆注入的评估，配对双尾t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
| NREM睡眠 | REM睡眠 | 清醒 | |
| 脑电图幅度 | 高 | 低 | 低 |
| 主导脑电频率 | 三角洲波段（0.5 - 4赫兹） | 西塔带（6 - 10赫兹） | 无 |
| 肌电图振幅 | 低 | 低 | 高 |
表1： 一般标准分数的行为状态脑电图/肌电信号。
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Discussion
这个协议描述一个建立脑电/肌电图记录，允许睡眠和清醒的下低噪声，低成本，以及高通量条件的评估。由于脑电图/ EMG电极头组件的小尺寸，本系统可与其它植入物用于帧内脑实验，包括光遗传学（光纤植入），或结合同步插管植入，微注射的药物进入鼠标进行组合脑31。此外，电极头组件相对于多针头的设计提供了灵活性在记录信道数，如果需要的额外的电信号（例如，对侧脑电图，眼电或局部场电位）测量。
然而，个人住房需要在这个协议中，这因此限制行为状态的评估， 即所描述的基于电缆的设计，睡眠和华kefulness，与社会互动或复杂的行为测试的组合。在这些情况下，一个无线睡眠监测系统很可能更合适，尽管遥测设备不是没有自己的限制特性，特别是电池的成本和寿命。
脑电图/ EMG信号的质量是根据在图 1和表 1。威格利电极中所示的标准行为状态的得分重要（即，螺丝）往往是造成在脑电图和FFT工件电噪声的原因分析。此外，对于脑电信号的质量，以完全覆盖用牙科水泥电极螺钉，以避免螺钉和水泥之间的气泡，从而增加电噪声是很重要的。 EEG信号的质量可以在明显睡小鼠通过在视觉上确认它们具有高振幅和低频进行检查。
成本和时间到植入电极是关键因素许多睡眠研究实验室和被认为是在小鼠睡眠 - 觉醒行为大规模筛选的主要缺点。此处所描述的脑电/肌电图记录系统可以建立和操作在低到适中的成本，包括经常性成本为电极材料及医疗用品（约2美元每只小鼠）和投资脑电/肌电图记录设备（滑环，放大器和A / D转换器，每只小鼠约2,000美元）。
相对于时间，熟练的研究人员可以得出结论：在电极植入1小鼠在不到20分钟;因此，有可能在超过20只小鼠每天操作。睡眠脑电图/肌电图测量的基础上评估的整体效率的另一个关键因素是使用软件的采集和脑电图/肌电图数据的自动计分。为了这些目的，各种商业和内部开发的软件可与一个高变异性定价或评分的准确性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-pin header | Hirose | A3B-4PA-2DSA(71) | |
| Ampicillin | Meiji Seika | ||
| Analog-to-digital converter | Contec | AD16-16U(PCIEV) | |
| Caffeine | Sigma | C0750 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | |
| Crimp housing | Hirose | DF11-4DS-2C | |
| Crimp socket | Hirose | DF11-30SC | |
| Dental cement (Toughron Rebase) | Miki Chemical Product | ||
| Epoxy adhesive | Konishi | #16351 | |
| FFC/FPC connector | Honda Tsushin Kogyo | FFC-10BMEP1(B) | |
| Flat cable | Hitachi Cable | 20528-ST LF | |
| Instant glue (Aron Alpha A) | Toagosei | N/A | |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | N/A | |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| Signal amplifier | Biotex | N/A | |
| Sleep recording chamber | APL | N/A | |
| SleepSign software | Kissei Comtec | N/A | for EEG/EMG recording/analysis |
| Slip ring | Biotex | N/A | |
| Stainless steel screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 × 2.0 |
| Stainless steel wire | Cooner Wire | AS633 |
References
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