Introduction
Technische Fortschritte haben oft im Verständnis der neurobiologischen Prozessen gefällte Quantensprünge. Zum Beispiel Hans Berger Entdeckung im Jahre 1929, daß elektrische Potentiale aus der menschlichen Kopfhaut aufgezeichneten die Form von Sinuswellen, deren Frequenz direkt auf das Niveau der Wachsamkeit des fachbezogenen, führte zu raschen Fortschritten im Verständnis der Schlaf-Wach- Regulierung, in Tieren und Menschen gleichermaßen. 1 Bis heute ist das electroencephlogram (EEG), in Verbindung mit dem Elektromyogramm (EMG), dh., elektrische Aktivität von der Skelettmuskulatur produziert, stellt die Daten "Rückgrat" fast jeder experimentellen und klinischen Einschätzung, die das Verhalten und die Physiologie mit der Aktivität der kortikalen Neuronen in benimmt Tieren, einschließlich Menschen korrelieren sucht. Im einfachsten Schlafforschungslaboratorien diese EEG-Aufzeichnungen werden unter Verwendung einer kabelgebundenen System (1), wobei d erworbenen geführtata off-line, um Muster und Spektrumsanalyse unterzogen [z. B. die Anwendung einer schnellen Fouriertransformation (FFT) -Algorithmus] zum Bestimmen der Wachsamkeit des Subjekt aufgezeichnet. 2, 3 Schlaf besteht aus S-Augenbewegung (REM) und Nicht-REM (NREM) schlafen. REM-Schlaf wird durch einen raschen Niederspannungs-EEG, zufällige Augenbewegung und Muskelatonie, einem Zustand, in dem die Muskeln effektiv gelähmt ist. REM-Schlaf ist auch als paradoxer Schlaf bekannt, weil die Aktivität des Gehirns ähnelt der Wachheit, während der Körper ist weitgehend getrennt vom Gehirn und scheint in tiefen Schlaf. Im Gegensatz dazu werden Motoneuronen während der NREM-Schlaf stimuliert aber es gibt keine Augenbewegung. 4 Hz im EEG - Human NREM-Schlaf kann in 4 Stufen, wobei Stufe 4 wird als Tiefschlaf oder Tiefschlaf und wird von großen, langsamen Gehirnwellen mit Delta-Aktivität zwischen 0,5 identifiziert aufgeteilt werden. Auf der anderen Seite, eine Unterteilung zwischen den Phasen des NREM-Schlaf in kleinere Tiere, wie Ratten einnd Mäusen, wurde nicht untersucht, vor allem, weil sie nicht über lange Konzernschlafperioden, wie in den Menschen gesehen.
Im Laufe der Jahre, und auf der Basis von EEG Auslegung, mehrere Modelle von Schlaf-Wach-Regelung, sowohl leitungs- als auch humorale-basierte, wurden vorgeschlagen. Das neuronale und zelluläre Grundlage des Schlafbedürfnis oder alternativ "Schlaf-Antrieb," bleibt ungelöst, aber wurde als homöostatischen Druck, der während der Wachperiode baut und wird durch Schlaf abgeführt konzipiert worden. Eine Theorie ist, dass endogene somnogenic Faktoren im Wachzustand und ihre allmähliche Ansammlung ist der Unterbau des Schlafes homöostatischen Druck aufzubauen. Während die erste formelle Hypothese, dass durch humorale Faktoren Schlaf reguliert hat Rosenbaum Arbeit veröffentlicht im Jahre 1892 4 gutgeschrieben ist, war es Ishimori 5, 6 und Pieron 7, die unabhängig voneinander und vor über 100 Jahren, zeigte die Existenz von schlaffördernde Chemikalien. Beide Forscher vorgeschlagen, und in der Tat bewiesen, dass Hypnogenic Stoffe oder 'hypnotoxins' in der Rückenmarksflüssigkeit (CSF) von übermüdeten Hunde anwesend waren. 8 Im Laufe des letzten Jahrhunderts einige zusätzliche mutmaßliche Hypnogenic Substanzen im Schlaf homöostatischen Prozess verwickelt sind identifiziert worden (für eine Übersicht siehe ref. 9), einschließlich Prostaglandin (PG) D 2, 10 Cytokine, 11 Adenosin, 12 Anandamid, 13 und dem Urotensin-II-Peptid. 14
Experimentelle Arbeiten von Economo 15, 16, Moruzzi und Magoun 17, und andere in den frühen und mittleren 20. produziert Erkenntnisse Jahrhundert, das zu einem gewissen Grad inspiriert leitungsbasierten Theorien von Schlaf und Wachsein, und, überschattete die dann herrschenden humorale Theorie Schlaf. Bis heute mehrere "Schaltungsmodelle" wurden vorgeschlagen, die jeweils von Daten unterschiedlicher Qualität und Quantität informiert (zur Übersicht siehe Ref. 18). Ein ModellBeispielsweise schlägt vor, langsame Wellen Schlaf wird durch Adenosin-vermittelte Hemmung der Acetylcholin-Freisetzung aus cholinergen Neuronen im basalen Vorderhirn, eine Fläche hauptsächlich consisiting des Kerns des horizontalen Schenkels des diagonalen Bandes von Broca und Substantia inominata generiert. 19 Ein weiteres beliebtes Modell der Schlaf- / Wach-Regulation wird eine Flip-Flop-Schaltmechanismus auf der Grundlage von gegenseitig hemmenden Wechselwirkungen zwischen einschläfernde Neuronen im ventrolateralen präoptischen Bereich und Wake-Induktion Neuronen im Hypothalamus und Hirnstamm. 18, 20, 21 Außerdem wird für die Umschaltung in die und aus der REM-Schlaf eine ähnliche ineinander inhibitorische Wechselwirkung wurde für Bereiche im Hirnstamm vorgeschlagen worden sind, ist, dass die ventralen periaqueductal grau, seitlichen Brückenhaube und sublaterodorsal Kern. 22. Zusammengenommen haben diese Modelle nützlich erwiesen Heuristik und lieferte wichtige Interpretationsrahmen für die Studien in der Schlafforschung; jedoch ein yet besseren Verständnis der molekularen Mechanismen und Schaltungen Regulierung des Schlaf-Wach-Zyklus wird eine vollständigere Kenntnis seiner Komponenten. Das System für die Druck- und Papierschneide Aufnahme unten detailliert sollte in diesem Ziel zu unterstützen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics Statement: Verfahren, die Tier Themen wurden von der Institutional Animal Experiment Ausschusses an der Universität Tsukuba genehmigt.
1. Herstellung der Elektroden und Kabel für EEG / EMG Recordings
- Vorbereitung EEG / EMG-Aufzeichnung Elektrode nach dem folgenden Verfahren.
Hinweis: Die Elektroden wegwerfbar und kann nur für 1 Tier verwendet werden. Planen Sie sorgfältig die Verdrahtung für alle Anschlüsse. Zeigen Markierungen an den Anschlüssen für die richtige Ausrichtung.- Löten Sie jeden Stift von einem 4-Pin-Header an eine 2-cm Edelstahldraht. Kurz gesagt, halten Sie das eine Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolben auf den Draht-Bolzengelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk. Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Wärme an das Stift anzuwenden; andernfalls wird der Kunststoff um die Stifte zu schmelzen.
- Löten Sie das freie Ende von jedem der 2 Drähte an die Stiftleiste am Kopf befestigtaus einem rostfreien Stahlschraube 1.0 mm Durchmesser. Kurz gesagt, halten Sie das freie Ende des Drahtes an den Thread unter dem Schraubenkopf, legen Sie einen heißen Lötkolben auf den Draht-Verschraubung und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk. Die 2 Adern mit Schrauben dienen als EEG-Aufzeichnungselektroden, während die 2 Adern ohne Schrauben dienen als EMG Aufzeichnungselektroden.
- Mit einer Schere abzustreifen 1 mm der Isolierung am Ende der EMG-Elektroden, um die Qualität des EMG-Signals zu erhöhen.
- Alle verlötet Pins mit Epoxid-Klebstoff vollständig zu bedecken, indem Sie einen dünnen Holzstab oder Zahnstocher, um die elektrische Geräusche während des EEG / EMG-Aufnahmen zu reduzieren.
- Bereiten Sie ein Kabel für die Verbindung der Elektrode mit dem Schleifring, wie unten beschrieben. Dieses Kabel kann wieder verwendet werden.
- Löten Sie jeden Stift von einem 4-poligen FFC / FPC-Steckverbinder mit einem Draht aus einem 30-cm-Flachkabel. Kurz gesagt, halten Sie die abisolierten Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolbenauf den Draht-Bolzengelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk.
Hinweis: Wählen Sie die Länge des Flachkabels, die für die Höhe des Versuchstieres Käfig für EEG / EMG-Aufnahmen verwendet angemessen ist. - Lötmittel Crimpbuchsen zu einer Spitze der Adern am anderen Ende des Flachkabels. Kurz gesagt, halten eine Crimp-Buchse mit dem abisolierten freien Ende des Drahtes, legen Sie einen heißen Lötkolben auf den Draht Gelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk.
- Legen Sie jeweils Crimp Buchse in eine 4-Position Crimp-Gehäuse.
- Vollständig zu bedecken den Crimp-Buchsen mit Epoxid-Klebstoff mit Hilfe eines dünnen Holzstab oder Zahnstocher.
- Löten Sie jeden Stift von einem 4-poligen FFC / FPC-Steckverbinder mit einem Draht aus einem 30-cm-Flachkabel. Kurz gesagt, halten Sie die abisolierten Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolbenauf den Draht-Bolzengelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk.
2. Die Implantation von Elektroden in der Maus-Kopf (Dauer: ca. 20 Min.)
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeugen in eine heiße Perle Sterilisator vor der Operation. Betäuben männlichen Maus (10 - 20 Wochen alt, 20 bis 30 g)mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg). Nach der Überprüfung, dass die Maus tief durch Kneifen eine Zehe betäubt, rasieren Sie die Haare auf dem Kopf und Hals mit Klipper.
- Bewegen Sie die Maus an den stereotaktischen Rahmen, und befestigen Sie den Kopf zwischen den 2 Ohr-Bars. Vaseline auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. Reinigen Sie die rasierte Haut mit Alkohol und schneiden Sie es entlang der Mittellinie mit einem Skalpell, um den Schädel freizulegen. Clip der Haut, um das Operationsfeld offen zu halten.
- Durch die Verwendung eines Hartmetallfräser (Bohrergröße: 0,8 mm Durchmesser), 2 Löcher in den Schädel, einen über den frontalen kortikalen Bereich (1 mm anterior Bregma, 1,5 mm lateral der Mittellinie) und die andere über den Scheitelbereich ( 1 mm anterior lambda, 1,5 mm lateral zur Mittellinie) der rechten Hemisphäre nach stereotaktischen Koordinaten des Paxinos und Franklin. 23
- Durch die Verwendung von Schraubendreher ein Juwelier, Ort, Edelstahl EEG-Aufzeichnung Schrauben in den Löchern und 2 - 2,5 Umdrehungen pro screw für die epidurale Positionierung über dem Kortex.
Hinweis: Schrauben zu tief, um Schäden am Hirngewebe zu verhindern, stecken. Überprüfen Sie, dass die Schrauben fest am Schädel befestigt. Dies ist wichtig, um eine stabile EEG-Signale über einen langen Zeitraum von mehreren Aufnahmen (typischerweise mehr als 1 Monat) zu haben. Wiggly Schrauben produzieren EEG Artefakten und kann sich lösen, bevor das Ende des Versuchsplan. - Befestigen Sie den Elektroden-Einheit (siehe Abschnitt 1.1, wandte Stifte nach oben) mit Sekundenkleber auf den Schädel und Abdeckung mit Zahnzement. Stellen bilateral kleine Löcher mit einer Pinzette in den trapezius (Hals) Muskeln und legen Sie die Drähte aus rostfreiem Stahl, die als EMG-Elektroden in die Löcher zu dienen. Naht der Haut mit einem Seidenfaden (0,1 mm Durchmesser), um die Exposition des Muskels zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Maus von der stereotaktischen Rahmen. Verabreichen Ampicillin (100 mg / kg) und Meloxicam (1 mg / kg) intraperitoneal an der Maus, um eine bakterielle Infektion zu verhindern und postoperativen Schmerzen zu verringern sind. Keep der Maus auf ein Heizkissen und zu überwachen, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Haus der Maus einzeln während der Wiederherstellung, um das Entfernen von Elektroden zu vermeiden, von anderen Tieren, und zu verwalten, Meloxicam (1 mg / kg) intraperitoneal am ersten Tag nach der Operation.
3. Aufnahme und den Erwerb von EEG / EMG Daten
- Nach einer 1-wöchigen Erholungsphase, Haus jede Maus einzeln in einem Versuchskäfig in einem schalldichten Aufnahmekammer angeordnet. Pflegen Sie eine Umgebungstemperatur von 23 ± 1 ° C und automatisch zu steuern Zyklen von 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit (Licht an um 08:00 Uhr, Beleuchtungsstärke ~ 100 lux).
- Schließen Sie das EEG / EMG-Elektroden-Einheit auf der Maus Kopf auf ein Aufzeichnungskabel. Sicherzustellen, dass der Aufnahmekabel ist mit einem Schleifring (die so ausgelegt ist, dass Bewegungen der Maus werden durch Verdrehen des Kabels eingeschränkt) und einen EEG / EMG-Signalverstärker verbunden ist. Filter EEG / EMG-Signale (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), Digitalisieren bei einer Abtastrate von 128 Hz durch einen Analog-Digital-Umsetzer (A / D) und schließlich auf einem Computer läuft EEG / EMG Aufnahmesoftware (4 th Eintragstabelle "Materialien", aufzeichnen von unten).
- Gewöhnen Sie die Maus für 2 - 3 Tage im Aufnahmeraum. Wenn das EEG / EMG Aufzeichnung enthält intraperitoneale Drogen Verwaltungen, vorsichtig handhaben Sie die Maus auf jeder Gewöhnung Tag zum Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneimittels.
- Anschließend starten EEG / EMG-Recording-Software (Tabelle "Materialien", 4. Eintritt von unten).
- Wählen Sie die "Daten Datei-Informationen" und klicken Sie das Kontrollkästchen neben dem Dateinamen. Geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf "Speichern".
- Wählen Sie die Registerkarte "Aufnahmebedingungen", und wählen Sie alle EEG / EMG-Kanäle, die aufgezeichnet werden sollen.
- Wählen Sie die Sampling-Frequenz (128 Hz) auf der Registerkarte "Aufnahmezustand".
- Überprüfen Sie, ob die ausgewählten Kanäle richtig in th angezeigt'Kanalinformation "Tab e.
- Wählen Sie die Registerkarte "Timer-Einstellung" und klicken Sie auf "Monitor", um EEG- und EMG-Anzeige.
- Überprüfen Sie, ob EEG / EMG-Signale werden korrekt angezeigt.
- Wählen Sie die Registerkarte "Timer-Einstellung" und stellen Sie die Uhrzeit für den Beginn und das Ende der Aufnahme in die "Haupt Timer 'Bereich.
- Klicken Sie auf "Monitor" in der Registerkarte "Timer-Einstellung", um die Aufnahme zu starten.
- Nehmen EEG / EMG-Signale im Basislinie (dh., Schlaf / Wach-Verhalten eines frei verhalten Maus) und verschiedenen Behandlungsbedingungen (z. B. Koffein Verwaltung oder Scheinbehandlung) über mehrere Tage. Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (200 mg / kg) nach der letzten Versuchstag.
4. Bewertung der Verhaltenszustand Basierend auf EEG / EMG Daten
- Starten Sie die Software für EEG / EMG-Analyse (Tabelle "Materialien", 4. Eintritt von unten). Öffnen Sie die EEG / EMG Rohdaten (.kcd-Datei) unter dem Schritt 3 hergestellt Klicken Sie auf die Registerkarte "Schlaf" und wählen Epoch Zeit. Wählen Sie 10 Sek.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Schlaf" und wählen Sie "Multi-Screening", um alle 10-sec Epochen automatisch ein Tor in 3 Stufen (dh., NREM und REM-Schlaf und Wachzustand) auf der Grundlage der Amplituden der EEG- und EMG-und Power-Spektralanalyse des EEG. 3
- Klicken Sie auf 'FFT Bedingung für EEG ".
- Stellen Sie die Parameter für die Strom Spektralanalyse [256 Bezugspunkte (entspricht 2 sec der EEG), Hanning-Fensterfunktion, und der Durchschnitt von 5 Spektren pro Epoche]. 3 Klicken Sie auf "OK".
- Klicken Sie auf "Start Screening", um die automatische Screening beginnen. Öffnen Sie die erzielte Daten (.raf Datei).
- Überprüfen Sie die Ergebnisse der automatischen Screening und, falls erforderlich, korrigieren Sie diese manuell auf der Grundlage der Standardkriterien (siehe Repräsentative Ergebnisse, 1B und Tabelle 1 2, 3 kurz, klicken Sie mit gedrückter linker Maustaste auf ein falsch bewertet Epoche und ziehen Sie den Cursor über die Kette von falsch bewertet Epochen. Lassen Sie die linke Maustaste und wählen Sie den richtigen Verhaltenszustand im Popup-Fenster.
Hinweis: Gelegentlich gibt Epochen am Übergang zwischen zwei Zuständen wachsam schwierig, eindeutig einem Zustand punkten. In solchen Fällen sollte die Zeit zum scheinbaren Zustand erzielt werden, und die gleichen Kriterien sollten ähnliche Epochen während des Experiments angewandt werden, um Daten Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1B veranschaulicht Beispiele der Maus EEG in den verschiedenen Wachsamkeit Staaten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind Epochen NREM-Schlaf klassifiziert, wenn das EEG zeigt große, langsam Gehirnwellen mit einem Delta Rhythmus unterhalb von 4 Hz und die EMG nur eine schwache oder kein Signal. Epochen wie REM-Schlaf klassifiziert, wenn das EEG zeigt schnellen Niederspannungs-Gehirnwellen in Theta-Bereich zwischen 6 und 10 Hz und die EMG zeigt eine geringe Amplitude. Andere Epochen sollte als Wach eingestuft werden (dh., Geringe bis mäßige Spannung EEG und das Auftreten von EMG-Aktivität).
Zum Beispiel kann die in diesem Protokoll beschriebenen EEG / EMG Aufzeichnung Set-up verwendet, um die Schlafmenge und Schlaf / Wach-Profil der C57BL / 6 Mäusen unter Ausgangsbedingungen oder nach der Behandlung mit Koffein zu bestimmen (Abbildung 2 und 3).
Unter baseline Bedingungen, Mäusen, die nachtaktive Tiere sind, zeigte eine deutliche zirkadianen Schlaf-Wach-Rhythmus, wie in diesen Figuren während der Lichtperiode als im Dunklen (2A) zu sehen ist, mit größeren Mengen an Schlaf. Während der 12-stündigen Lichtperiode zeigten die Mäuse 6,7 h und 0,9 h von NREM und REM-Schlaf sind; wohingegen während der 12-stündigen Dunkelperiode war Wachheit vorherrschende (2B). Auf der anderen Seite kann die Qualität des Schlafes auf der Grundlage der Wachsamkeit Staat und EEG-Leistungsspektrum-Analyse (2C-F) ausgewertet werden. In der Regel können die Polygraphie Aufnahmen von EEG- und EMG-zur Folge Dauer Verteilung zu bestimmen, mittlere Dauer und Bühnenübergangszahl für jede Wachsamkeit Zustand (2C-E) werden. Darüber hinaus ist die EEG-Leistungsspektrum für NREM und REM-Schlaf bei Mäusen während der hellen und dunklen Periode (2F) zeigt starke EEG Leistungsdichte im Frequenzbereich von 0,5 bis 4 Hz und 6-10Hz. Es sei darauf hingewiesen, dass der EEG während des REM-Schlafes enthält kleine Mengen von Deltawellen werden (0,5 bis 4 Hz), da die vermischten Zustände NREM und REM sind manchmal eine Verunreinigung.
Drogen Auswirkungen auf die Schlaf-Wach-Verhalten von Mäusen zu bewerten, sind 24-30 EEG- und EMG-Regel für 2 aufeinanderfolgenden Tagen aufgezeichnet. Am Tag 1 um 10:00 Uhr in der frühen Phase der Lichtperiode; zu bestimmen, beispielsweise die Erregung Wirkung von Koffein auf C57BL / 6-Mäuse, 24 wurden die Mäuse mit Vehikel (intraperitoneal 10 ml / kg Kochsalzlösung) behandelt. Die Tiere wurden dann mit Coffein (15 mg / kg) 24 Stunden später behandelt, und die Wachsamkeit Zustände wurden offline in wachen, REM und NREM-Schlaf klassifiziert. 3A zeigt typische Beispiele für EEG, EMG, und hypnograms nach der Verabreichung von Koffein (untere polysomnographischen Platten) oder Vehikel (obere polysomnographischen Platten) in einer C57BL / 6-Maus. Caffeine increuf die Menge der Wachheit in C57BL / 6-Mäusen 2,8-fach für 3 h nach der Injektion (3B).
Abbildung 1. Schlaf-Bioassay-System für Mäuse.
(A) Um EEG-Signale zu überwachen, sind Edelstahlschrauben epidural den frontalen und parietalen kortikalen Bereichen 1 Hemisphäre implantiert. Zusätzlich wird die EMG-Aktivität von Edelstahldrähten bilateral in den Trapezmuskeln platziert überwacht. (B) Typische Beispiele für EEG, EMG, EEG und Leistungsdichte für 10 sec im NREM oder REM-Schlaf oder Wachsamkeit in einer Maus. In NREM-Schlaf, EEG zeigt hoher Amplitude Wellen; und das Delta-Band (0,5 bis 4 Hz) dominant ist (links). Im REM-Schlaf, EEG zeigt niedrige Amplitude Wellen, mit dem Theta-Band (6-10 Hz) dominant (Mitte). Im Wachzustand, dem EEG zeigt geringer Amplitude Wellen, mit keine Frequenz dominant (rechts). EMG-Signale sowohl in der unteren NREM und REM-Schlaf als im Wachzustand sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schlaf-Wach-Profile unter Ausgangsbedingungen in C57BL / 6-Mäuse durch EEG / EMG-Aufnahmen beurteilt.
(A) Zeitverlauf Veränderungen im Stundenbetrag jeder Verhaltens Bühne. Weiße und schwarze Balken über der x-Achsen zeigen die Hell- und Dunkelperioden auf. (B) Gesamtbetrag jeder Stufe 12 h zeigt eine größere Menge von NREM und REM-Schlaf während der Lichtperiode im Vergleich zu dem in der dunklen Zeit. (C) Verteilung von episode Dauer der einzelnen Phasen. (D) mittlere Dauer der einzelnen Phasen ist länger für die Wachsamkeit bei der Dunkelperiode. (E) Bühnenübergangszahl jeder Stufe zeigt häufigere Übergänge während der Lichtperiode. (F) EEG-Leistungsspektrum im NREM und REM-Schlaf zeigt im Wesentlichen keine Leistungsdichteunterschiede zwischen hellen und dunklen Perioden. Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben (n = 5). * P <0,05, ** p <0,01, wie von gepaarten zweiseitigen Student t-Test beurteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Arousal Wirkung von Koffein durch EEG / EMG-Aufnahmen beurteilt.
(A) Typische Beispiele für EEG, EMG, und hypnograms nach der Verabreichung von Vehikel (oberes Feld) oder Koffein in einer Dosis von 15 mg / kg (unteres Feld). (B) Zeitverläufe der die Wachsamkeit bei Mäusen, die mit Koffein. (C) Wakefulness über einen 3-Stunden-Zeitraum nach der Injektion von Koffein behandelt. Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben (n = 5). ** P <0,01 im Vergleich zur Fahrzeug Injektion, wie durch gepaarten zweiseitigen Student t-Test beurteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| NREM-Schlaf | REM-Schlaf | Wachsamkeit | |
| EEG-Amplitude | Hoch | Niedrig | Niedrig |
| Dominant EEG-Frequenz | Delta-Band (0,5-4 Hz) | Theta-Band (6-10 Hz) | Keine |
| EMG-Amplitude | Niedrig | Niedrig | Hoch |
Tabelle 1: Allgemeine Kriterien zur Behavioral Staaten von EEG / EMG Signale Note.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Set-up für EEG / EMG-Aufnahmen, die die Bewertung von Schlaf und Wachsein unter geräuscharme, kostengünstige und Hochdurchsatzbedingungen ermöglicht. Aufgrund der geringen Größe des EEG / EMG Elektrodenkopfanordnung kann dieses System mit anderen Implantaten zur intra-Hirn Versuche einschließlich Optogenetik (Glasfaser-Implantation) oder in Verbindung mit gleichzeitiger Kanüle Implantation Mikroinfusion von Medikamenten in die Maus kombiniert werden Gehirn. 31. Darüber hinaus ist die Gestaltung des Elektrodenkopfanordnung in Bezug auf Multi-Pin-Header bietet Flexibilität in der Anzahl der Aufzeichnungskanäle, wenn die Messung von zusätzlichen elektrischen Signale (z. B. kontralaterale EEG, Elektrookulogramm oder lokale Feldpotential) wird benötigt .
Es wird jedoch einzelne Gehäuse für die in diesem Protokoll, die daher begrenzt die Beurteilung der Verhaltenszustände, dh beschrieben Kabel-basierte Design erforderlich., Schlaf und wakefulness, in Kombination mit sozialer Interaktion oder komplexe Verhaltenstests. In diesen Fällen ist eine drahtlose Schlafüberwachungssystem wahrscheinlich besser geeignet, obwohl Telemetrieeinrichtungen sind nicht ohne ihre eigenen Begrenzungseigenschaften, insbesondere Batterie Kosten und Lebensdauer.
Die Qualität der EEG / EMG-Signale ist wichtig für die Scoring von Verhaltenszustand entsprechend den in Abbildung 1 und Tabelle 1. Verwackeln Elektroden gezeigten Kriterien (dh., Schrauben usw.) sind oft die Ursache für elektrische Störungen und damit Artefakte im EEG und FFT Analyse. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die Qualität des EEG-Signal vollständig zu bedecken, die Elektrodenstifte mit Zahnzement, um Luftblasen zwischen den Schrauben und Zement zu vermeiden, was zu einer erhöhten elektrischen Rauschen. Die Qualität der EEG-Signale können in einem offensichtlich Schlaf Maus durch visuell bestätigt wurde, dass sie eine hohe Amplitude und niedriger Frequenz geprüft werden.
Kosten undZeit Implantatelektroden sind kritische Faktoren für viele Schlafforschungslaboratorien und werden als ein großer Nachteil für große Screening von Schlaf-Wach-Verhalten bei Mäusen. Die hier beschriebene EEG / EMG Aufzeichnungssystem etabliert und betrieben werden niedrigen bis moderaten Kosten, einschließlich wiederkehrende Kosten für die Elektrodenmaterialien und Medizinbedarf (ca. 2 USD pro Maus) und Investitionen für EEG / EMG Aufnahmegeräte (Schleifring, Verstärker und A / D-Wandler; rund 2.000 USD pro Maus).
Mit Bezug auf die Zeit, kann ein erfahrener Forscher, die Elektrodenimplantation für 1 Maus in weniger als 20 min zu schließen; und somit ist es möglich, auf mehr als 20 Mäuse pro Tag arbeiten. Ein weiterer wichtiger Faktor für die Gesamteffizienz der Beurteilung des Schlafs auf der Grundlage des EEG / EMG-Messung ist die Verwendung von Software zur Erfassung und automatischen Scoring EEG / EMG-Daten. Für diese Zwecke eine Vielzahl von kommerziellen und selbst entwickelte Software ist mit einemhohe Variabilität in der Preisgestaltung oder Scoring-Genauigkeit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-pin header | Hirose | A3B-4PA-2DSA(71) | |
| Ampicillin | Meiji Seika | ||
| Analog-to-digital converter | Contec | AD16-16U(PCIEV) | |
| Caffeine | Sigma | C0750 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | |
| Crimp housing | Hirose | DF11-4DS-2C | |
| Crimp socket | Hirose | DF11-30SC | |
| Dental cement (Toughron Rebase) | Miki Chemical Product | ||
| Epoxy adhesive | Konishi | #16351 | |
| FFC/FPC connector | Honda Tsushin Kogyo | FFC-10BMEP1(B) | |
| Flat cable | Hitachi Cable | 20528-ST LF | |
| Instant glue (Aron Alpha A) | Toagosei | N/A | |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | N/A | |
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| Signal amplifier | Biotex | N/A | |
| Sleep recording chamber | APL | N/A | |
| SleepSign software | Kissei Comtec | N/A | for EEG/EMG recording/analysis |
| Slip ring | Biotex | N/A | |
| Stainless steel screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 × 2.0 |
| Stainless steel wire | Cooner Wire | AS633 |
References
- Berger, H. Über das Elektrenkephalogramm des Menschen. Arch. Psych. 87 (1), 527-570 (1929).
- Tobler, I., Deboer, T., Fischer, M. Sleep and sleep regulation in normal and prion protein-deficient mice. J. Neurosci. 17 (5), 1869-1879 (1997).
- Kohtoh, S., et al. Algorithm for sleep scoring in experimental animals based on fast Fourier transform power spectrum analysis of the electroencephalogram. Sleep Biol. Rhythm. 6 (3), 163-171 (2008).
- Rosenbaum, E. Warum müssen wir schlafen? : eine neue Theorie des Schlafes. , August Hirschwald. (1892).
- Kubota, K. Kuniomi Ishimori and the first discovery of sleep-inducing substances in the brain. Neurosci. Res. 6 (6), 497-518 (1989).
- Ishimori, K. True cause of sleep: a hypnogenic substance as evidenced in the brain of sleep-deprived animals. Tokyo Igakkai Zasshi. 23, 429-457 (1909).
- Legendre, R., Pieron, H. Recherches sur le besoin de sommeil consécutif à une veille prolongée. Z. Allegem. Physiol. 14, 235-262 (1913).
- Inoué, S., Honda, K., Komoda, Y. Sleep as neuronal detoxification and restitution. Behav. Brain. Res. 69 (1-2), 91-96 (1995).
- Urade, Y., Hayaishi, O. Prostaglandin D2 and sleep/wake regulation. Sleep Med. Rev. 15 (6), 411-418 (2011).
- Ueno, R., Ishikawa, Y., Nakayama, T., Hayaishi, O. Prostaglandin D2 induces sleep when microinjected into the preoptic area of conscious rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 109 (2), 576-582 (1982).
- Krueger, J. M., Walter, J., Dinarello, C. A., Wolff, S. M., Chedid, L. Sleep-promoting effects of endogenous pyrogen (interleukin-1). Am. J. Physiol. 246 (6 Pt 2), R994-R999 (1984).
- Porkka-Heiskanen, T., et al. Adenosine: a mediator of the sleep-inducing effects of prolonged wakefulness. Science. 276 (5316), 1265-1268 (1997).
- Garcia-Garcia, F., Acosta-Pena, E., Venebra-Munoz, A., Murillo-Rodriguez, E. Sleep-inducing factors. CNS Neurol. Disord. Drug. Targets. 8 (4), 235-244 (2009).
- Huitron-Resendiz, S., et al. Urotensin II modulates rapid eye movement sleep through activation of brainstem cholinergic neurons. J. Neurosci. 25 (23), 5465-5474 (2005).
- Wilkins, R. H., Brody, I. A. Encephalitis lethargica. Arch. Neurol. 18 (3), 324-328 (1968).
- von Economo, C. Die encephalitis lethargica. Wien. Klin. Wochenschr. 30, 581-585 (1917).
- Moruzzi, G., Magoun, H. W. Brain stem reticular formation and activation of the EEG. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- Jones, B. E. Progress in Brain Research. Krnjevic , K., L, D. escarries, S, M. ircea 145, Elsevier. 157-169 (2004).
- Saper, C. B., Scammell, T. E., Lu, J. Hypothalamic regulation of sleep and circadian rhythms. Nature. 437 (7063), 1257-1263 (2005).
- Fort, P., Bassetti, C. L., Luppi, P. H. Alternating vigilance states: new insights regarding neuronal networks and mechanisms. Eur. J. Neurosci. 29 (9), 1741-1753 (2009).
- Lu, J., Sherman, D., Devor, M., Saper, C. B. A putative flip-flop switch for control of REM sleep. Nature. 441 (7093), 589-594 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic. (2001).
- Lazarus, M., et al. Arousal effect of caffeine depends on adenosine A2A receptors in the shell of the nucleus accumbens. J. Neurosci. 31 (27), 10067-10075 (2011).
- Huang, Z. L., et al. Adenosine A2A, but not A1, receptors mediate the arousal effect of caffeine. Nat. Neurosci. 8 (7), 858-859 (2005).
- Qu, W. M., Huang, Z. L., Xu, X. H., Matsumoto, N., Urade, Y. Dopaminergic D1 and D2 receptors are essential for the arousal effect of modafinil. J. Neurosci. 28 (34), 8462-8469 (2008).
- Huang, Z. L., et al. Arousal effect of orexin A depends on activation of the histaminergic system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (17), 9965-9970 (2001).
- Xu, Q., et al. A mouse model mimicking human first night effect for the evaluation of hypnotics. Pharmacol. Biochem. Behav. 116, 129-136 (2014).
- Cho, S., et al. Marine polyphenol phlorotannins promote non-rapid eye movement sleep in mice via the benzodiazepine site of the GABAA receptor. Psychopharmacol. 231 (14), 2825-2837 (2014).
- Liu, Y. Y., et al. Piromelatine exerts antinociceptive effect via melatonin, opioid, and 5HT1A receptors and hypnotic effect via melatonin receptors in a mouse model of neuropathic pain. Psychopharmacol. 231 (20), 3973-3985 (2014).
- Qu, W. M., et al. Lipocalin-type prostaglandin D synthase produces prostaglandin D2 involved in regulation of physiological sleep. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17949-17954 (2006).
