Introduction
Arenaviruses 자연 1-3 설치류에서 주로 유지 포위, 단일 가닥 RNA 바이러스의 가족입니다. 이 바이러스는 일반적으로 설치류 저수지 1,2의 증상, 지속적인 감염을 설정하는 동안, 그들은 인간 3 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 중요 병원성 종은 새로운 세계 후닌 바이러스 (JUNV) 4 아프리카에서 남미, 라사 열에서 아르헨티나 출혈열의 병원체가 각각있는 올드 월드 라사 바이러스 (5)를 포함한다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 가정 (6)의 본보기 바이러스는 전 세계적으로 분포가 면역 억제의 면역 개인 6 무균 성 뇌막염, 태아 7 심각한 선천성 또는 높은 치사율을 포함하는 다양한 질환 상태에 대한 책임 고체 장기 이식 8,9 다음 개인. 미국의 부족식품의 약국 (FDA)은 백신 이들 바이러스에 대처하기 위해 효과적인 항 바이러스제는 치료 이들 신흥 / 재 신흥 병원균을 대상으로 새로운 전략을 개발하는 중요한 필요성을 강조 -approved.
arenavirus 게놈 두 개의 단일 가닥 RNA 세그먼트, 대형 (L) (~ 7.2 킬로바이트) 작은 (S) (~ 3.6 킬로바이트) 세그먼트 (10)로 구성되어 있습니다. L 세그먼트가 바이러스 폴리머 라제 (L) 및 매트릭스 단백질 (Z)을 인코딩하는 동안 S 세그먼트 바이러스 핵 단백질 (NP)과 외피 당 단백질 (GP)을 인코딩한다. L과 S 게놈 RNA 세그먼트 (vRNA들)은 비리 10-12로 포장됩니다. arenavirus 감염의 초기 단계는 바이러스 입자의 부착 JUNV 들어 인간 트랜스페린 수용체 1 (hTfR1) (13, 14)과, 바이러스 GP 및 해당 숙주 세포 수용체 사이의 상호 작용을 통해 세포를 호스팅한다. 부착 후, JUNV 입자는 클라 트린 매개 엔도 시토 시스 (15)를 통해 세포로 수행한다.입자이 구획의 낮은 pH가 GP 16, 17의 활성화를 유발 후반 엔도 좀에 다음 트래픽. 일단 바이러스와 엔도 솜 막의 융합을 개시 사이, GP 부호화 융합 펩티드 삽입 엔도 솜 막으로 활성화. 그들은 게놈 복제 및 전사에 대한 템플릿 역할을 세포질에 비리 패키지 vRNA들의 릴리스의 성공적인 융합의 결과. 바이러스의 구조 단백질과 vRNA들의 충분한 양이 생성되는 경우, 새로운 입자가 조립하고 감염된 세포에서 새싹 라이프 사이클 (18)를 완료합니다.
치료 병원성 arenaviruses 타겟팅 새로운 전략의 발견을 용이하게하기 위해, 우리 그룹은 호스트에 대한 바이러스 증식에 중요하지만, 폐기 가능하다 호스트 요소의 식별에 초점을 맞추고있다. 이러한 맥락에서, 이러한 숙주 요인에 의해 제어 바이러스 생활주기의 정확한 스테이지 (들)를 형성하는 안내 할 필요가있다항 바이러스 전략의 개발. 여기서, 우리는 선택된 숙주 단백질 및 / 또는 바이러스 분자 바이러스 엔트리 (19)의 초기 단계에 영향 여부를 식별하기위한 목적 arenavirus 세포 부착을 측정 할 수 정량 (Q) RT-PCR 기반 분석법을 설명한다. arenavirus 세포 부착을 측정하는 다른 방법은 비오틴 (20), 형광 염료 (21), 또는 방사성 동위 원소 (22)으로 표시 비리를 추천했다. 이러한 방법에 대한 단점은 입력 바이러스의 대량 방사능의 사용 (감염 (MOI)의 예를 들면 높은 다중도), 및 / 또는 입력 된 바이러스 (예를 들어, 농도 및 / 또는 바이러스의 표시)을 제조하기위한 추가 처리 단계들에 대한 요구 사항을 포함 할 수있다 . 특히, 높은 MOI를 사용하는 것이 곤란 비생산적인 부착 이벤트 15,23 비해 생산성을 구별 할 수있다. 여기에 설명 된 QRT-PCR 기반의 분석은 거의 20 패에 대한을 사용하여 첨부 이벤트를 검색 할 수 있습니다밍 단위 48 웰 플레이트에 대해 0.0004의 MOI로 변환 바이러스 (PFUs). 따라서, 분석의 감도가 강한 높은 MOI 대한 요구뿐만 아니라 바이러스 라벨 또는 농도 단계를 극복한다. 또한, 분석 내가) 비리의 엔도 사이토 시스를 측정 할뿐만 아니라 세포질에 바이러스 게놈의 방출 등의 융합에 따라하도록하고 ⅱ) 예제 바이러스 특정 QRT-PCR 시약의 개발을 통해 다른 바이러스와 함께 사용 (위해 맞춤형 할 수 있습니다 참조 24-27).
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Protocol
주 : 설명 프로토콜 (프리 PCR 실험실 방법 좋은 사전-PCR 기법을 사용하여 실험을 실시하는 설정 방법에 대한 뛰어난 개관 28 참조) 엄격한 사전-PCR 기법을 사용하여 수행하는 것이 중요하다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 프로토콜의 개요는도 1에 도시되어있다.
1. 48 웰 플레이트에서 미디어 및 종자 세포를 준비
- 50 ㎖를 첨가하여 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 이글 보통 500 ㎖ (DMEM), 1 % HEPES (N-2- 히드 록시 에틸-N-2- 에탄 설 폰산) 완충액을 준비 열 불 활성화 소 태아 혈청 DMEM 5 ㎖의 500ml의 병에 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 100X HEPES 완충액 각. 이 시약은 사에 저장 될 수있다(76); 개월 동안 C.
- 완전 DMEM 500 ㎕의 최종 부피에서 48- 웰 조직 배양 플레이트 내에 웰 당 종자 2.5 × 104 베로 E6 세포. 10~18 시간 동안 5 % CO2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
- 평일의 끝 플레이트 종자. 중 중복 또는 세중의 우물에서 각 바이러스 샘플을 테스트합니다.
주 :이 분석 용 48- 웰 기반 플랫폼이 설명되지만, 이는 96 또는 384 웰 플레이트에서 다운 사용 분석을 확장 할 수 있어야한다.
- 평일의 끝 플레이트 종자. 중 중복 또는 세중의 우물에서 각 바이러스 샘플을 테스트합니다.
2. 바이러스 세포 첨부 파일을 실행
주 :이 프로토콜에서 사용되는 바이러스를 JUNV 균주 솔직 # 1 (C # 1) 성공적 JUNV 병 (29)의 예방을위한 약독 화 생백신으로 사용되어왔다. JUNV C # 1은 생체 내 및 생체 외 모두 직렬 통로를 통해 악성 JUNV 변형 XJ에서 파생 된 12 아미노산 (30)에 의해 부모 XJ 균주와 다른했다. Becaus전자 JUNV C # 1이 바이오 안전성 수준 (BSL) -2 등급 병원체이며,이 섹션에 설명 된 작업은 적절한 BSL-2 방식 (31)를 사용하여 수행해야합니다. 이것은 개인 보호 장비 (예 : 눈 보호, 실험실 코트, 이중 장갑), 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛의 사용을 포함, 모든 직원이 기관의 교육과 안전이 유기체를 처리하는 데 필요한 승인을받은 것을 보장한다.
- 원하는 PFUs에 테스트 할 JUNV C # 1 샘플 (들)을 희석 또는 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM에서 형성 단위를 집중하고 각 웰에 추가 할 준비가 될 때까지 얼음에 저장합니다.
주 : 완전 DMEM에 희석 바이러스 결합 연구를 수행하는 대안 혈청 바이러스 첨부 간섭이 발생할 수 있는지 여부를 설정하는 축소 혈청 농도 (2 %) 및 적합한 완충액 PBS를 함유하는 최소 배지를 사용할있다. 다른 바이러스 유사 첨부 프로토콜은 bicarbo없이 RPMI 1640 배지의 사용을보고0.2 % 소 혈청 알부민, 10mM의 (2- (모르 폴리 노) 에탄 설 폰산)를 포함 네이트, 10 mM의 HEPES, pH가 6.8 32. 이 바인딩 미디어는 미디어가 인큐베이터의 CO 2 - 환경에서 제거 될 때 발생할 수있는 pH 변화를 방지하기 위해 우수 할 수있다.- 비생산적인 첨부 이벤트를 제한하기 위해 200에서 2,000까지 PFUs와 우물을 접종한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 상기 분석은 거의 20 PFU (또는 많은 6~10 × 2 PFU 등)를 이용하여 부착을 검출 할 수있다.
- 세포 상에 접종에 대한 바이러스의 마스터 믹스를 만듭니다. 각 바이러스 샘플을 잘 당 50 μL의 볼륨에서 중복 우물에 접종한다. 웰 당 2,000 PFUs 바이러스의 추가를 원하는 경우, 따라서 DMEM 완료 차가운 얼음 120 ㎕의 총 부피로 희석 4800 PFUs.
- 분석의 특이성에 대한 제어하기 위해, 하나가 TfR1 (TRVb) 또는 특급을 표명하지 아니 중국어 햄스터 난소 세포 라인의 일치 쌍을 사용하여이 세포에 JUNV의 첨부 파일로 RESS hTfR1 (TRVb-1) 감소 여부, 각각 13,33해야 하나. 또한, arenavirus 첨부 파일 34 또는 항목 35을 방지하기 위해 이러한 테의 K 같은 단백질 분해 효소와 세포를 치료. 그들은 세포 13,36에 JUNV의 항목을 차단 알려진대로 hTfR1에 대한 고유 수용성 hTfR1 또는 monocolonal 항체 ch128.1은, 또한 고려 될 수있다. 또한, 무료 만노스 14 JUNV 특정 중화 항체 (37)와 입자의 배양과 세포의 전처리 바이러스 항목을 억제 할 수 있습니다.
- 이 그럴듯한 설명이지만 JUNV 항목을 차단에도 불구하고 이러한 후자의 시약 및 방법은, 첨부 파일을 차단하는 확인되지 않은, 그러나, 유의하시기 바랍니다. 여기에 설명 된 프로토콜 정식 이러한 다양한 접근 충격 비리 부착 여부를 결정하기 위해 사용될 수있다.
- 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 제거하고배치 중 4 ° C의 냉장고에서 15 분 엔도 시토 시스를 수행하는 도금 세포의 기능을 억제하기위한 얼음.
- 다음으로, 각 웰에서 완전한 DMEM을 대기음 빠르게 얼음 차가운 PBS (인산염 완충 식염수)의 pH 7.4의 100 μl를 사용하여 두 번 아니라 각 씻는다. 그런 다음 적절한 우물 (단계 2.1에서 준비) 사전 희석 바이러스 샘플의 50 μl를 추가합니다.
- 플라스틱 포장에 접시를 감싸 즉시 다시 얼음이나 바이러스 첨부 파일이 발생할 수 있도록 1 시간 1.5에 대한 4 ° C 냉장고에 하나 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 4 ° C에서 감기, 판을 보관 버퍼를 세척 및 바이러스 샘플.
- 39 ° C에서 배양 종료 후, 바이러스 접종 물을 흡인하고 빙냉 PBS 200 ㎕를 각 웰을 3 회 세척 하였다.
3. 바이러스 성 RNA 추출
- (예를 분리하고, RNeasy 미니 키트) 코르 상업용 키트를 사용하여 C JUNV 번호 # 단층에 부착 한 입자를 바이러스 RNA를 정제하여제조 업체의 프로토콜 땡. 특히, 아래의 수정을하고, RNeasy 미니 수첩의 페이지 23-28 (제 4 판 2006 년 4 월)의 "스핀 기술 프로토콜을 사용하여 동물 세포에서 총 RNA의 정화"를 따릅니다.
- 를 Lyse 각 웰에 직접 용해 완충액 RLT 350 μl를 첨가하여 공정 (b)에 지시에 따라 세포. 세포 용해를 위해 상기 버퍼를 여러 번 섞는다. 세포가 쉽게 용균 완충액 완전한 용해가 반전 현미경 웰을보고 확인할 수 있습니다.
- 키트 컬럼 (3a 단계)에 생성 된 세포 용 해물을 전송하고 설명 된대로 프로토콜의 나머지 부분을 따르십시오. 프로토콜의 나머지 단계는 클래스 II 바이오 캐비닛의 외부에서 수행 키트 튜브 감염성 바이러스에 오염되지 않은 제공 될 수 있으므로이 점에서, 바이러스는 용해 완충 용액으로 중화되어있다.
- 되어온는 제조 업체의 프로토콜에서 옵션 9 단계를 포함스핀 열의하는 ional 원심 분리는 버퍼 RPE의 가능한 이월을 제거합니다.
- 최종 단계에서 제조사의 프로토콜 (단계 10) 뉴 클레아 제 무 DDH 2 O. 30 μL를 사용하여 스핀 칼럼으로부터 정제 된 RNA를 용출 상점이 시점에서 -80 ° C에서 RNA 또는 QRT-PCR 분석에 직접 사용합니다. 뉴 클레아 제에 의해 정제하여 바이러스 RNA 시료의 열화를 방지하기 클레아없는 시약 및 장치를 사용하여 얼음 위에서 해동 RNA 샘플을 유지한다.
참고 : 버퍼 RLT 및 RW1은 구아니딘 염을 포함하고 표백제와 혼합 할 수 없습니다. 버퍼 RW1 에탄올이 포함되어 있습니다.
바이러스 성 게놈의 4 QRT-PCR 측정
- 이후 qPCR에 대한 cDNA를에 JUNV C # 1 S 세그먼트 RNA를 변환하려면, 50 μL의 총 부피에 RT에 (단계 3.1.4에서 생성) 바이러스 성 RNA 대상으로 할 수 없다.
- 클레아의 6.75 μL : RT 반응을 설정하려면 먼저 반응에 따라 다음과 같은 시약을 각각 포함하는 마스터 믹스를 만들-free DDH 2 O, RT 프라이머 S의 2 μM 스톡 5 μL 2098- 2075-에 S 세그먼트 게놈 RNA의 NP 영역 5 μL의 상보 (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), 10X PCR 완충액 II, 25 밀리미터의 MgCl 2 용액 11 μL, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제 1 μL (0.4 단위) 1.25 μL (62.5 단위)과의 dNTP 500 μM의 재고 10 μL.
참고 arenavirus 복제 과정 동안 4 바이러스 S 세그먼트 RNA 종 생성된다 : 전체 길이 게놈 RNA (vRNA와) 전체 길이 antigenomic RNA (vcRNA) (즉, vRNA와의 역방향 보완) 두 subgenomic의 mRNA를 각각 및 NP 유전자를 코딩 GP. 여기 나열된 RT 프라이머는 S 구간 vRNA와 특정 아니지만 vcRNA, NP의 mRNA 또는 mRNA의 GP. - 조심스럽게 RT 마스터 믹스를 혼합 한 다음 각각의 0.2 ml의 PCR 튜브에 40 μl를 나누어지는. 각 튜브에 바이러스 성 RNA의 10 μl를 추가합니다. 포함 I)없이 템플릿 제어 튜브 (예 :. 뉴 클레아없는 DDH 2 O (40)에 대한 마스터 믹스 μL)과 ⅱ)없이 RT 효소 제어의 10 μl를 (예를 들면받지 않은 마스터 믹스 40 μL에 알려진 양의 바이러스 성 RNA 샘플의 10 μl를 추가 추가 모든 RT 효소) 바이러스 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA와 함께 RT 시약의 오염을 선별한다. 세포 RNA의 존재 분석 특이성에 대해 제어 할 수있는 전체 RT 마스터 믹스 감염되지 않은 세포에서 추출한 RNA를 포함합니다.
- 또한, RT 시약의 품질을 확인하기 위해 전체 마스터 믹스로 알려진 양성 바이러스 성 RNA 샘플을 포함한다. 필요한 경우 RT 반응 부피 25 μL로 감소 될 수 있습니다.
- 클레아의 6.75 μL : RT 반응을 설정하려면 먼저 반응에 따라 다음과 같은 시약을 각각 포함하는 마스터 믹스를 만들-free DDH 2 O, RT 프라이머 S의 2 μM 스톡 5 μL 2098- 2075-에 S 세그먼트 게놈 RNA의 NP 영역 5 μL의 상보 (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), 10X PCR 완충액 II, 25 밀리미터의 MgCl 2 용액 11 μL, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제 1 μL (0.4 단위) 1.25 μL (62.5 단위)과의 dNTP 500 μM의 재고 10 μL.
- 다음 사이클 조건 RT 튜브 제목 : 25 ° C를 10 분, 30 분, 48 ° C, 5 분 동안 95 ° C에 대한. 샘플을 4 ° C의 공정을 추가하여이 시점에서 -20 ° C에서 저장 또는 열 순환기에서 밤새 남아있을 수 있습니다.
- 피25 μL의 총 부피에 erform qPCR에.
- 다음 결합하여 qPCR에 마스터 믹스를 확인 : 각의 S1937 +는 1958+하는 앞으로 PCR 프라이머 (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') (9 μM 주식) 2.5 μl를 및 역방향 PCR 프라이머 S 2001에 1982 ~ (5 에 qPCR에 프로브 S 1960+의 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2 μM 주식의 2.5 μL () 1975+ (5'-6FAM - ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') 및 2 배 보편적 인 qPCR에 마스터의 12.5 μL 혼합. JUNV C # 1에 특이 여기에보고 앞으로 프라이머, NT 악성 JUNV 변형 로메로을 대상으로 처음보고 된 프라이머 서열 38에서 1로 차이가 있습니다.
- 부드럽게 솔루션을 혼합 한 후 각 웰 qPCR에 20 μl를 추가합니다. 해당 qPCR에 우물 각 RT 반응의 5 μl를 추가합니다. 시험 각 샘플에 대해 중으로 qPCR에를 실시하고 있습니다. 필요한 경우 PCR 반응 부피가 적은 등 12.5 μL로 감소 될 수 있습니다.
참고 :와 관련된 소프트웨어를qPCR에 기계 qPCR에 프라이머 대상 JUNV C # 1 NP 유전자를 코딩하는 플라스미드의 표준 희석 시리즈 각 미지 시료의 값을 비교하여 JUNV C 1 S 세그먼트 게놈 RNA의 절대 복사 번호 생성 프로브 설정합니다. qPCR의 분석에만 표준 곡선의 범위 내에있는 값을 정량 분석을 제공 할 수있다. 5, 50, 5 × 103, 5 × 5, 5 × 7 복사 웰당이 때문에, 이하의 (삼중 웰)에서 플라스미드의 양을 포함한다.
- 열 순환기에 qPCR에 판을로드하고 다음과 같은 반응 조건을 실행 : 95 ° C를 10 분 15 초와 1 분 60 ° C 95 ° C의 40주기 위해.
- 수집하고 제조자의 프로토콜에 따라 각 샘플에 바이러스 RNA의 양을 결정하기 위해 데이터를 분석한다.
- qPCR의 타르를 함유하는 플라스미드 새로 정제 샘플을 사용하여 검량선을 설정하려면서열을 얻을 제 용액의 플라스미드 카피 수를 결정한다.
- 플라스미드의 분자량을 계산한다. 전체 플라스미드의 서열이 공지 된 경우, 다음 수식을 이용하여이를 계산 : MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). 이중 가닥 플라스미드의 각 가닥에 발견 된 특정 뉴클레오티드의 총 수를 포함해야합니다.
- 플라스미드의 크기가 알려져 있지만, 그 정확한 시퀀스가없는 경우, 각각의 dsDNA의 염기쌍 600의 MW를 갖는다는 가정하에 계산 MW.
참고 : 여기에 사용는 pCAGGS - JUNV C # 1 NP의 플라스미드는 4.2 × 10 (6)의 MW 있습니다. - 플라스미드의 MW가 결정되면 μL 당 매수 재고 플라스미드 용액에 존재하는 계산 방법.
- 제 용액 플라스미드의 총 μg의 계산 후 플라스미드의 몰이 변환 (69 μg의 플라스미드을 물 300 μL, 6.9 X 1에 포함되어있는 경우, 예를 들어번호를 복사 변환 할 수있는 플라스미드 * 1 몰의 0 -5 g / 플라스미드의 4.2 × 10 6g = 플라스미드의 1.6 × 10 -11 몰), (예를 들어 플라스미드의 1.6 × 10 -11 몰 * 6.022 × 10 (23) 분자 / 몰 = 9.8 × 10 (12) 분자 (또는 사본)).
- μL 당 사본을 얻기 위해 그 용액의 부피 플라스미드 플라스미드 용액의 전체 사본을 나눈다 (예를 들면 9.8 × 10 12 카피 / 300 μL = 3.28 × 10 10 부).
- 5 ㎕의 부피는 표준 곡선을 확립하는 데 필요한 카피 수의 범위를 전달하기 위해 PCR 플레이트 상에 로딩 될 수 있도록 적절하게 용액을 희석.
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Representative Results
프로토콜의 섹션 4에 기술 된 바와 같이의 qPCR 분석의 감도와 다이나믹 레인지를 설명하기 JUNV C # 1 (범위 5-5 X 107 부)의 NP 유전자를 코딩하는 플라스미드를 공지 된 양을 qPCR을 행 하였다. 분석은 민감하고 안정적으로 표적 핵산의 5 부 (그림 2) 적은 감지 할 수 있습니다. 템플릿의 적어도 7 로그를 커버 할 수있다,도 2에 도시 된 바와 같이, 또한, 분석의 동적 범위가 크고. 도시하지 않은 동안, 우리는 핵산의 많은 9 10 × 5로 복사로 감지했다.
프로토콜에 기재된 JUNV C 1 입자의 부착 측정 분석의 유용성을 설명하기 위해 JUNV C # 1은 다양한 양 베로 E6 세포 prebound 하였다. 결합되지 않은 입자를 세척 한 후, 세포를 RNA의 정제를 용해시키고, 생성 된 RNA 샘플 QRT을 실시- PCR. 도 3에 도시 된 바와 같이, 상기 분석은 거의 20 또는 각각 0.0004 및 40의 MOIs로 변환 많은 10 × 2와 6 PFU를 사용하여 첨부 파일 바이러스 이벤트를 검출 할 수있다.
도 4에 도시 된 바와 같이, 이는 바이러스의 부착을 측정 할뿐만 아니라, 프로토콜을 변경하는 것이 가능하지만, 시간에 따라 수신되는 바이러스 입자에 함유되는 유전체의 증폭 율. 이 수정 방법은 바이러스 항목 (예를 들면 입자 이입 및 / 또는 융합 세포질 내로 바이러스 게놈의 방출)의 나머지 단계에있어서 결함이 발생 될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 대용으로 사용될 수있다. 흥미롭게도, 바이러스 게놈의 양은 유입 바이러스 게놈의 일부가 열화 제안 제 6 시간 다음 첨부 동안 감소 보인다. 이것은 extracell에서 셀에 채취한다 실패 저하 입자 일어날 수울라 공간 혹은 인해 endolysosomal 네트워크 내에서 분해. 표시된 데이터는 12 또는 18 시간 게시물 감염이 활성화 게놈 복제 화면에 최적의 시간이 될 것이라는 점을 보여줍니다.
그림 1 :. 프로토콜 워크 플로우의 묘사 바이러스 세포 부착 분석의 주요 단계는 1) 4 ° C에서 세포와 바이러스 입자의 배양이 결합되지 않은 바이러스를 제거하는 바이러스 세포 부착이 세척 다음에 발생할 수 있도록하고, 2) 정화 세포에서 바이러스 성 RNA의, 3) 역전사 (RT)는 JUNV S 세그먼트 게놈 RNA (cDNA를에 vRNA의 축적), 4) qPCR에 바이러스가 세포 부착의 척도로 JUNV S vRNA와의 복사본을 열거 변환합니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 :. JUNV S 세그먼트 게놈의 검출을위한 qPCR의 분석은 민감하고 넓은 동적 범위에서 사용할 수있는 JUNV S 세그먼트 qPCR에 프라이머 - 프로브 세트는 정확하게 알려진 양을 측정 할 수있는 능력 시험 (5, 16.6, 50, 표적 서열을 코딩하는 DNA 표준 제어 플라스미드 5 × 103, 5 × 5, 5 × 7 부). 증폭 플롯 (A)과 표준 곡선 맞춤 라인 (B)의 도시이다. R 2, 프라이머 - 프로브 세트의 상관 계수는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : JUNV 세포 부착 분석 신뢰성있게 측정적은 20 PFU. 베로 E6 세포를 이용한 입자 부착 JUNV C 번호의 공지 된 양 (1) (2 × 1 prebound, X 10 2 2, 2 × 103, 2 × 104, 2 × 5 또는 2했다 × 106 PFU) 4 ℃에서 1.5 시간 동안. 비 결합 입자를 세척하여 제거하고, 세포를 RNA 추출에 용해시키고, 생성 된 RNA 샘플은 베로 E6 세포에 입자의 부착 수단으로 JUNV C 1 S 세그먼트 vRNA와를 검출 QRT-PCR을 실시 하였다. 데이터는 SEM ± 중복 우물에서 잘 당 평균 카피 수를 나타냅니다.
그림 4 :. 감염 다음 JUNV C # 1 게놈 복제의 속도론은 베로 E6 세포를 4 ℃에서 1.5 시간 동안 2 × 103 PFU JUNV의 C # 1 (0.04 MOI)와 함께 배양 하였다. 얼음처럼 차가운 PBS 여러 세척 후, 세포 중 즉시 수확 (0 시간 시점)또는 수집 전에 표시된 시간 동안 37 ° C로 가온. 각각의 경우에, 총 RNA는 세포로부터 추출하고 JUNV C 1 S 세그먼트를 검출하는 vRNA와 QRT-PCR을 실시. 값은 SEM ± 중복 우물에서 잘 당 평균 사본을 나열됩니다.
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Discussion
우리가 설명하는 프로토콜은 간단하고 강력한는 다음과 같은 중요한 고려 사항이 관찰된다 제공했다. 첫째, 엄격한 사전-PCR 기술은 (우수한 검토를 위해 28 참조) 고용해야합니다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 둘째, 프로토콜, 바이러스, 세포, 및 미디어 바이러스 세포 부착 부에 대해 표면 - 결합 세포 내 이입의 비리 방지 39 ° C로 유지되어야한다. 셋째, RNA 추출을 위해 수집 된 세포의 양 RNA 정제 필터의 RNA 결합 용량을 초과해서는 안된다. 넷째, 정제 된 바이러스 RNA 샘플 클레아없는 시약 및 장치를 이용하여 해동 할 때 얼음을 유지하여 리보 뉴 클레아 제 - 매개 분해로부터 보호되어야한다. 다섯째, 표준 곡선의 범위는 충분히 커야 qPCR의 분석에 포함미지 시료에서 관찰 된 모든 값을 촬영합니다. 여섯째, 복제 기술은 분석의 바이러스 세포 부착 부뿐만 아니라 개별 RNA 샘플 qPCR을 모두 포함한다. 일곱째, 컨트롤 (hTfR1 표현 여부 예 세포주)는 분석의 특수성에 대해 제어하기 위해 포함될 수있다. 마지막으로, 모든 직원은 적절한 바이오 안전성 교육 및 전염성 JUNV의 C # 1 또는 다른 병원성 arenaviruses을 처리하는 기관의 승인이 있어야합니다.
qPCR의 프로브는 주로 생성물 특이성 PCR 반응의 각 단계에서 증폭되도록하는 프로토콜 qPCR에 부가 부른다. 분석의 비용 (예를 들면 비대칭 염료 SYBR 그린 I (25)의 사용) 및 / 또는 부피를 줄임으로써 프로브를 필요로하지 않는 다른 qPCR의 화학 찬성이 qPCR의 프로브를 제거함으로써 단, 감소 될 수있다 qPCR의 반응 혼합물을 사용 하였다. 프로브 독립적 qPCR에 응용하는 경우바퀴벌레는 반응 조건은 qPCR에 프라이머의 특이성을 보장 할만큼 엄격한 있는지 확인하는 것이 중요 할 것이다 사용된다. arenavirus RNA가 세포 또는 비리 온으로부터 추출 여부 비특이적 바이러스 특이 RT 프라이머 (12)의 부재하에 RT 동안 cDNA를 형성 할 수 있음 프라이밍 인식하는 것도 중요하다. 따라서 엄격하게 RT 프라이머의 대상이 바로 vRNA와 종을 반영하지 않습니다 vRNA와 특정 RT 프라이머를 이용하여 검출 번호를 복사합니다. 게놈 특이성 또는이 antigenome 필요, 우리는 바이오틴 RT 프라이머 및 스트렙 타비 딘 비드 (12)의 사용을 통해 이러한 비특이적 프라이밍 현상을 회피하는 방법을보고 한 경우.
이 분석의 중요한 강점은 극단적 인 감도이다. 다른 특징 arenavirus - 세포 부착 분석법, 각각 20 또는 21 바이오틴 입자 0.2 MOIs, 100, 또는 1000을 요구 한 형광 표지 22 방사능 표지LY. 양호한 감도 방사성 표지 입자의 결과를 사용하지만,이 특정 분석과 관련된 복잡성 물류 및 안전 우려를 증가 방사능의 사용을 필요로한다. 여기에 설명 된 qPCR에 기반 방법을 필요로 작은 (48 웰 플레이트에서 0.0004 ~의 MOI) PFU 20과 신뢰성 MOIs의 큰 동적 범위에서 첨부 파일을 검색 할 수 있습니다 (0.0004에서 예 MOIs 적어도 40) (그림 3 ). 이 분석의 민감도는 강한 가능 표준 감염성 바이러스로 생산적 결합 사건의 더욱 정확한 측정을 위해 낮은 MOIs를 사용하는 것을 가능하게한다. 높은 감도는 대폭으로 비리 라벨, 분석에 필요한 바이러스의 양을 감소시키고, 그렇게함으로써 비리의 품질에 영향을 미칠 수있는 부가적인 처리 단계 (분석에서 비리 예 : 폴리에틸렌 글리콜 계 침전 사용되고 제한 형광 물질 또는 방사성 동위 원소 및 / 또는 virio의 크로스 밴딩NS). 또한, qPCR에 분석 자체는 매우 정확하고 재현성뿐만 아니라 수행하는 간단합니다.
설명 세포 부착 분석은 바이러스 입자의 세포 내 이입뿐만 아니라 세포질 내로 바이러스 게놈의 릴리스 바이러스 융합 최종 단계를 포함한 바이러스 항목 추가 단계를 측정하기 위해 수정 될 수있다. 입자의 세포 내 이입을 측정하기 첨부 프로토콜 동일한 단계 4 ° C에서 세포 입자의 부착이 단계 2.5을 준수해야한다. 세포를 바이러스 입자 (22, 24)을 기술 된 바와 같이 endocytosed되지 않은 임의의 외부 비리 온 - 결합 된 스트립을 프로테아제로 처리하여, endocytosed 수 있도록 가온된다. 섹션 3이 프로토콜의 4 다음 바이러스 성 RNA를 추출하여 세포 내 이입의 측정으로 바이러스 게놈 RNA의 사본을 정량하기 위해 따라야 할 것입니다. 바이러스 및 엔도 좀 막의 융합 다음 게놈 uncoating을 측정하기 위해, 세포와 prebound 될 것이다4 ° C에서 바이러스, (엔도 시토 시스와 융합을 허용) 가온 및 외부 입자를 제거하고 분석을 위해 수집. 하나의 방법에서, 세포는 세포 내 소포를 보존하고 2 분획으로 분할 등장 버퍼에 용해 될 수있다 : (코팅되지 않은 바이러스 성 RNA가 분해에 영향을 받기 쉽다) RNases의 칵테일로 처리 할 것 하나는 다른 그 않을 것 (39) . 대안 적으로, 세포는 세포질 또는 엔도 솜 분획 (40)으로 분리 될 수있다. 두 경우 QRT-PCR은 바이러스 게놈 uncoating의 척도로서 세포질 바이러스 게놈을 정량하는데 사용된다. 마지막으로, QRT-PCR 분석을 쉽게 (예 24-27를 참조)에 관심있는 새로운 바이러스에 맞는 RT-PCR 시약을 제공하는 다른 바이러스에 대한 바이러스 첨부 파일, 엔도 시토 시스, 또는 융합 연구를 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 보조금 T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), 및 P20RR021905을 통해 이러한 연구의 지원에 도움이 토론과 국립 보건원 (JB)에 대한 마르쿠스 Thali, 나단 로이, 크리스토퍼 지글러, 에밀리 브루스, 베냐민 왕 감사합니다 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
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