Introduction
Arenavírus são uma família de vírus com envelope, de ARN de cadeia simples que são mantidas essencialmente em roedores na natureza 1-3. Embora estes vírus tipicamente estabelecer uma infecção assintomática, persistente em reservatórios de roedores 1,2, que pode causar doença grave em humanos 3. Espécies patogênicas importantes incluem o vírus Novo Mundo Junin (JUNV) 4 e o vírus Old Lassa Mundial 5, que são os agentes etiológicos da febre hemorrágica argentina na América do Sul e da febre de Lassa na África, respectivamente. Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), o vírus protótipo da família 6, tem uma distribuição mundial e é responsável por uma variedade de doenças, incluindo meningite asséptica em indivíduos imunocompetentes 6, defeitos congênitos graves no feto em desenvolvimento 7, ou de alta letalidade em imunossuprimidas indivíduos na sequência de órgãos sólidos transplante 8,9. A falta de Estados UnidosFood and Drug Administration (FDA) -aprovado vacinas ou medicamentos antivirais eficazes para combater estes vírus destaca a necessidade crítica de desenvolver novas estratégias para atingir terapeuticamente esses patógenos emergentes / re-emergente.
O genoma arenavírus consiste em dois segmentos de ARN de cadeia simples, a grande (L) (~ 7,2 kb) e pequena (s) (~ 3,6 kb) segmentos 10. O segmento S codifica a nucleoproteína viral (NP) e a glicoproteína do envelope (GP), enquanto o segmento L codifica a polimerase viral (L) e proteína de matriz (Z). O L e segmentos de ARN genómico S (ARNv) são empacotados em viriões 10-12. O passo inicial de infecção arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras através de uma interacção entre o GP viral e os seus receptores de células hospedeiras correspondentes que, por JUNV, inclui o receptor de transferrina humana 1 (hTfR1) 13,14. Após a ligação, as partículas JUNV são levados para dentro da célula através de endocitose mediada por clatrina 15.Partículas de tráfego, em seguida, para o final do endossoma onde a baixo pH deste compartimento desencadeia a activação da GP 16,17. Uma vez activadas, as inserções de péptidos de fusão codificada-GP na membrana endossomal, iniciando a fusão entre as membranas viral e endossomais. resultados da fusão de sucesso na liberação dos vRNAs embalados-virion no citoplasma, onde servem como modelos para replicação genômica e transcrição. Quando uma quantidade suficiente de proteínas estruturais virais e ARNv são gerados, novas partículas de montar e botão da célula infectada para completar o ciclo de vida de 18 anos.
Para facilitar a descoberta de novas estratégias para atingir terapeuticamente os arenavírus patogênicos, o nosso grupo tem-se centrado na identificação de factores do hospedeiro que são críticas para a propagação de vírus, mas dispensável para o anfitrião. Neste contexto, a definição do estádio preciso (s) do ciclo de vida viral controlada por esses factores do hospedeiro é necessária para guiar odesenvolvimento de estratégias antivirais. Aqui, nós descrevemos um (Q) ensaio quantitativo com base em RT-PCR que podem ser utilizados para medir a ligação de células arenavírus para o propósito de identificar se as proteínas hospedeiras seleccionadas e / ou moléculas antivirais influenciar esta fase inicial da entrada viral 19. Abordagens alternativas para medir a fixação de células arenavírus têm caracterizado viriões marcados com biotina 20, corantes fluorescentes 21, ou isótopos radioactivos 22. Inconvenientes para estes métodos podem incluir o requisito de grandes quantidades de vírus de entrada (por exemplo, elevadas multiplicidades de infecção (MOI)), a utilização de radioactividade, e / ou passos adicionais de manuseamento para a preparação do vírus de entrada (por exemplo, concentração e / ou a rotulagem de vírus) . Em particular, o uso de alta MOI torna difícil distinguir produtivo contra eventos de fixação não produtivas 15,23. O ensaio à base de qRT-PCR descrito aqui pode detectar eventos de ligação utilizando tão pouco quanto 20 por placaunidades Ming (PFU) de vírus, que se traduz em um MOI de 0,0004 para uma placa de 48 poços. Portanto, a forte sensibilidade do ensaio supera a necessidade de alta MOI assim como quaisquer passos de rotulagem ou de vírus de concentração. Além disso, o ensaio pode ser i) adaptado para medir virião endocitose, bem como libertação de genoma do vírus no citoplasma da seguinte fusão e ii) adaptado para utilização com outros vírus através do desenvolvimento de reagentes de qRT-PCR específica para o vírus (para exemplos, ver 24-27).
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Protocol
Nota: É crítico que o protocolo descrito ser realizada utilizando rigorosa técnica de pré-PCR (ver 28 para uma excelente visão geral sobre como configurar um laboratório de pré-PCR e como conduzir experimentos usando boa técnica de pré-PCR). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1.
1. Prepare Mídia e células de sementes em placas de 48 poços
- Preparar 500 ml de completa de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo soro de bovino fetal a 10%, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico) solução tampão através da adição de 50 ml de calor de soro de bovino fetal inactivado e 5 mL de cada vez de uma solução tampão de 100x de penicilina-estreptomicina e tampão HEPES 100x para um frasco de 500 ml de DMEM. Este reagente pode ser armazenada a 476; C durante meses.
- Semente 2,5 x 10 4 células Vero E6 por poço numa placa de cultura de tecido de 48 poços num volume final de 500 ul de DMEM completo. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2 durante 10 a 18 h.
- Semente da placa no final do dia de trabalho. Teste cada amostra de vírus tanto em duplicado ou triplicado poços.
Nota: Embora uma plataforma de poços com base em 48 para este ensaio é descrito, deve ser possível dimensionar o ensaio para baixo para utilização em placas de 96 ou de placas de 384 poços.
- Semente da placa no final do dia de trabalho. Teste cada amostra de vírus tanto em duplicado ou triplicado poços.
2. Executar Anexo de células-Virus
Nota: O vírus utilizados no presente protocolo, estirpe JUNV Espontânea # 1 (C # 1), foi utilizado com sucesso como uma vacina viva atenuada para a prevenção da doença JUNV 29. JUNV C # 1 foi derivada a partir da estirpe XJ JUNV virulento através de passagens em série tanto in vivo como in vitro e difere da estirpe parental XJ por 12 aminoácidos 30. because JUNV C # 1 é um nível de biossegurança (BSL) patógeno -2-classificado, o trabalho descrito para esta seção devem ser realizados utilizando apropriadas BSL-2 práticas 31. Isso inclui o uso de equipamento de protecção individual (por exemplo, protecção para os olhos, bata de laboratório, luvas duplas), uma cabine de segurança biológica classe II, e garantir que todo o pessoal tenha recebido a formação institucional e aprovações necessárias para lidar com segurança com este organismo.
- Dilui-se a JUNV C # 1 da amostra (s) a ser testado para o PFUs desejado ou se concentrar em unidades formadoras gelada DMEM completo e armazenar em gelo até estar pronto para adicionar a cada poço.
Observação: Como uma alternativa para a realização dos estudos de ligação com vírus diluída em DMEM completo, usar um meio mínimo contendo PBS com uma concentração reduzida de soro (2%) e um tampão apropriado para determinar se o soro pode causar interferência com o acessório do vírus. Similar protocolos de ligação para os vírus alternativas têm relatado o uso de RPMI 1640 sem bicarbonate contendo 0,2% de albumina de soro bovino, 10 mM de (2- (morfolino) etanossulfónico), e 10 mM de HEPES, pH 6,8 32. Este os meios de ligação podem ser superior a evitar alterações de pH que podem ocorrer quando o material é removido a partir do CO 2 -Ambiente da incubadora.- Inocular poços com PFU que variam de 200 a 2000 para limitar eventos de fixação não produtivas. Como mostrado na Figura 2, este ensaio é capaz de detectar anexo usando tão poucos como 20 PFU (ou tantos quanto 2 x 10 6 pfu).
- Criar uma mistura mestre do vírus para uma inoculação em células. Cada amostra de vírus será inoculado em poços duplicados num volume de 50 ul por cavidade. Portanto, se a adição de 2.000 PFU de virus por poço é desejado, dilua 4.800 PFU em um volume total de 120 ul de DMEM completo gelada.
- Para controlar a especificidade do ensaio, usar um par correspondente de linhas de células de ovário de hamster chinês que não expressam quer TfR1 (TRVb) ou express hTfR1 (TRVb-1) como anexo JUNV a estas células deveria ser reduzida ou não, respectivamente 13,33. Alternativamente, o tratamento de células com uma protease, tal como proteinase K para impedir a fixação arenavírus 34 ou entrada 35. Solúvel hTfR1 ou o anticorpo ch128.1 monocolonal, que é específico para hTfR1, também poderia ser considerado como eles são conhecidos por bloquear a entrada de JUNV em células 13,36. Além disso, o pré-tratamento de células com manose livre 14 ou incubação de partículas com anticorpos neutralizantes específicos de JUNV 37 pode inibir a entrada do vírus.
- Por favor note, no entanto, que estes últimos reagentes e abordagens, apesar de bloquear a entrada JUNV, não foram confirmados para bloquear a adesão, embora esta seja uma explicação provável. O protocolo aqui descrito pode ser usado para determinar se se trata formalmente várias abordagens ligação de viriões de impacto.
- Retirar as placas da incubadora a 37 ° C elugar quer num 4 ° C frigorífico ou em gelo durante 15 minutos para inibir a capacidade de as células plaqueadas para efectuar a endocitose.
- Em seguida, aspirar o DMEM completo a partir de cada cavidade e lavar rapidamente cada poço duas vezes com 100 ul de PBS gelado (soro fisiológico tamponado com fosfato) pH 7,4. Em seguida, adicionar 50 ul das amostras de vírus pré-diluído (preparado no passo 2.1) aos poços apropriados.
- Enrole a placa em filme plástico e coloque imediatamente, quer de volta no gelo ou em um 4 ° C frigorífico durante 1 a 1,5 horas para permitir a ligação do vírus a ocorrer. Manter a placa, tampão de lavagem, e as amostras de vírus frio a 4 ° C ao longo deste passo.
- Após a conclusão da incubação de 4 ° C, aspirar o inoculo de vírus e lavar cada poço 3 vezes com 200 ul de PBS gelado.
3. Extracção de ARN viral
- Purifica-se ARN viral a partir de JUNV C # 1 partículas aderidas às monocamadas usando o kit comercial (por exemplo, RNeasy Mini Kit) acording o protocolo do fabricante. Especificamente, siga a "purificação de RNA total a partir de células animais utilizando protocolo de tecnologia de spin" nas páginas 23-28 no RNeasy Mini Handbook (4ª edição, Abril de 2006), com as modificações enumeradas abaixo.
- Lisar as células, conforme indicado no passo 1B por adição de 350 ul de tampão de lise directamente RLT a cada poço. Misture o tampão várias vezes para assegurar a lise das células. Note-se que as células lisam facilmente neste tampão de lise completa e pode ser verificada por meio de visualização poços sob um microscópio invertido.
- Transferir o lisado de células resultante para o kit de coluna (passo 3a) e seguir o resto do protocolo, tal como descrito. Neste ponto, o vírus foi neutralizada pelo tampão de lise de modo que os passos restantes do protocolo pode ser feito fora da cabine de segurança biológica de classe II, desde que os tubos kit não foram contaminadas com vírus infeccioso.
- Incluir o passo opcional de 9 o protocolo do fabricante, que é um additional centrifugação da coluna de centrifugação para eliminar qualquer possibilidade de reporte de Tampão RPE.
- No passo final o protocolo do fabricante (passo 10), elui-se o ARN purificado a partir da coluna de spin com 30 ul de DDH livre de nuclease 2 O. ARN armazenar a -80 ° C neste ponto ou usar directamente no ensaio de qRT-PCR. Para evitar a degradação das amostras de RNA viral purificado por nucleases, utilizar reagentes e equipamento livre de nuclease e manter as amostras de ARN descongeladas em gelo.
Nota: Os tampões RLT e RW1 contêm sal de guanidina e não deve ser misturado com água sanitária. Tampão RW1 contém etanol.
4. qRT-PCR Medição de genoma viral
- Para converter JUNV C # 1 de ARN em ADNc segmento S para qPCR subsequente, sujeitar o ARN viral (gerado no passo 3.1.4) à temperatura ambiente, num volume total de 50 ul.
- Para configurar a reacção RT, primeiro criar uma mistura principal contendo cada um dos seguintes reagentes por reacção: 6,75 mL de nucleaselivre de ddH2O, 5 ul de estoque de um iniciador de RT o S 2 uM para 2098- 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), que é complementar à região de NP do ARN genómico segmento S, 5 ul de tampão de PCR 10X II, 11 ul de uma solução de MgCl 2 25 mM, 1,25 mL (62,5 unidades) da enzima RT, 1 ul (0,4 unidades) de inibidor de RNase, e 10 ul de um stock de dNTPs 500 jiM.
Nota: Durante o curso da replicação arenavírus, 4 espécies de ARN segmento S virais são gerados: um ARN de comprimento completo genómico (ARNv), um comprimento total de ARN antigenómico (vcRNA) (que é o complemento reverso do ARNv), e dois mRNAs subgenómicos codifica os genes NP e GP, respectivamente. O iniciador de RT listados aqui é específica apenas para o segmento S ARNv, mas não o vcRNA, ARNm de NP, ou ARNm de GP. - Misture suavemente a mistura principal RT e depois se alíquota de 40 mL em 0,2 mL tubos de PCR individuais. Adicionar 10 ul de ARN viral para cada tubo. Incluir i) um tubo nenhum controle modelo (por exemplo,. Adicione 10 ml de 2 O a 40 mL livre de nuclease DDH da mistura principal) e ii) um controlo sem enzima RT (por exemplo, adicionar 10 ul de uma amostra de RNA viral conhecido positiva para 40 l de mistura principal que não receberam qualquer enzima RT) para o rastreio de contaminação dos reagentes temperatura ambiente com ADN amplificado contendo a sequência alvo viral. Incluem ARN extraído de células infectadas com a mistura principal completa de RT para controlar a especificidade do ensaio na presença de RNA celular.
- Além disso, incluem uma amostra de ARN viral conhecido-positivo para a mistura principal completo para verificar a qualidade dos reagentes RT. Note-se que o volume da reacção RT pode ser reduzida para 25 ul, se necessário.
- Para configurar a reacção RT, primeiro criar uma mistura principal contendo cada um dos seguintes reagentes por reacção: 6,75 mL de nucleaselivre de ddH2O, 5 ul de estoque de um iniciador de RT o S 2 uM para 2098- 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), que é complementar à região de NP do ARN genómico segmento S, 5 ul de tampão de PCR 10X II, 11 ul de uma solução de MgCl 2 25 mM, 1,25 mL (62,5 unidades) da enzima RT, 1 ul (0,4 unidades) de inibidor de RNase, e 10 ul de um stock de dNTPs 500 jiM.
- Sujeitar os tubos de RT para as seguintes condições de ciclo: 25 ° C durante 10 min, 48 ° C durante 30 min, e 95 ° C durante 5 min. Note-se que as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C neste ponto ou deixada durante a noite no termociclador pela adição de um passo de 4 ° C.
- Perform qPCR em um volume total de 25 ul.
- Adicione uma mistura mestre qPCR, combinando o seguinte: 2,5 ul (de um estoque 9 uM) de cada iniciador directo de PCR para S1937 + 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') e iniciador de PCR inverso 2001- S para 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 ul (de um estoque 2 mM) do qPCR sonda S 1960+ a 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), e 12,5 ul de 2X o mestre universal qPCR misturar. Note-se que o iniciador directo aqui relatado, que é específico para JUNV C # 1, difere por 1 nt a partir da sequência do iniciador originalmente relatado 38, que tem como alvo a estirpe virulenta JUNV Romero.
- Misture suavemente a solução e, em seguida, adicionar 20 ul a cada qPCR bem. Adicionam-se 5 ul de cada reacção de RT para os poços apropriados qPCR. Realizar qPCR em triplicado para cada amostra testada. Note-se que o volume da reacção de PCR pode ser reduzida para tão pouco quanto 12,5 ul, se necessário.
Nota: O software associadoa máquina qPCR irá gerar números de cópias absolutos de JUNV C # 1 RNA genómico segmento S, comparando o valor de cada amostra desconhecida a uma série de diluições padrão de plasmídeo que codifica o gene NP JUNV C # 1, que é o alvo do iniciador qPCR e sonda. O ensaio qPCR só pode proporcionar a quantificação dos valores que caem na gama da curva padrão. Por esta razão, incluem as seguintes quantidades de plasmídeo (em poços em triplicado): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 e 5 x 10 7 cópias por poço.
- Carregue a placa qPCR no termociclador e executar as seguintes condições de reacção: 95 ° C durante 10 min e 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min.
- Recolher e analisar os dados para determinar a quantidade de ARN virai presente em cada amostra de acordo com o protocolo do fabricante.
- Para estabelecer uma curva padrão, utilizando uma amostra recentemente purificado do plasmídeo contendo o alcatrão qPCRsequência obter, em primeiro lugar determinar o número de cópias do plasmídeo nesta solução.
- Calcule o peso molecular do plasmídeo. Se a sequência de todo o plasmídeo é conhecido, calcular esta com a seguinte fórmula: MW = ([A * 312,2] + [L * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Lembre-se de incluir o número total de um nucleotídeo especial encontrada em cada mecha do plasmídeo de cadeia dupla.
- Se o tamanho do plasmídeo é conhecido, mas a sua sequência exacta não é, calcular o MW sob a suposição de que cada par de bases dsDNA tem um PM de 600.
Nota: O plasmídeo pCAGGS NP-JUNV C # 1 aqui utilizado tem um peso molecular de 4,2 x 10 6. - Uma vez que o PM do plasmídeo foi determinada, calcular o número de cópias por ul estão presentes na solução estoque do plasmídeo.
- Em primeiro lugar calcular a ug total de plasmídeo na solução, em seguida, convertê-lo em moles de plasmídeo (por exemplo, se 69 ug de plasmídeo estão contidas em 300 ul de água, seguida de 6,9 x 10 -5 g de plasmídeo * 1 mole / 4,2 x 10 6 g de plasmídeo = 1,6 x 10 -11 moles de plasmídeo), que pode ser convertido para o número de cópias (por exemplo, 1,6 x 10 -11 moles de plasmídeo * 6,022 x 10 23 moléculas / mole = 9,8 x 10 12 moléculas (ou cópias)).
- Separe as cópias de plasmídeo totais na solução de plasmídeo por o volume da referida solução para obter cópias por ul (por exemplo, 9,8 x 10 12 300 cópias / ul = 3,28 x 10 10 cópias).
- Dilui-se esta solução de forma apropriada para que os volumes de 5 ul pode ser carregado para a placa de PCR para proporcionar a gama de números de cópias necessárias para estabelecer a curva padrão.
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Representative Results
Para demonstrar a sensibilidade e gama dinâmica do ensaio qPCR, quantidades conhecidas de um plasmídeo que codifica o gene NP de JUNV C # 1 (intervalo 5-5 x 10 7 cópias) foram submetidos a qPCR como descrito na Seção 4 do protocolo. O ensaio é sensível e pode detectar de forma fiável tão poucos como 5 cópias do ácido nucleico alvo (Figura 2). Além disso, a gama dinâmica do ensaio é grande e, como mostrado na Figura 2, pode cobrir, pelo menos, 7 registos de molde. Embora não mostrado, que já detectada até 5 x 10 9 cópias de ácido nucleico.
Para ilustrar a utilidade do ensaio para a medição da fixação de partícula JUNV C # 1, diversas quantidades de JUNV C # 1 foram pré-ligado a células Vero E6 como descrito no protocolo. Após a lavagem para retirar as partículas não ligadas, as células foram lisadas para a purificação de ARN e as amostras de ARN resultantes foram sujeitos a qRT-PCR. Como mostrado na Figura 3, o ensaio pode detectar eventos de fixação virais usando tão poucos como 20 ou tantos quanto 2 x 10 6 PFU, que se traduz em MOI de 0,0004 e 40, respectivamente.
Como mostrado na Figura 4, é possível modificar o protocolo para medir não só a ligação viral, mas também a taxa de amplificação do genoma contido nas partículas virais de entrada ao longo do tempo. Esta abordagem modificada pode ser usada como um substituto para determinar se mais defeitos nos restantes passos de entrada viral (por exemplo, endocitose da partícula e / ou de fusão e libertação de genoma viral para o citoplasma) pode estar a ocorrer. Curiosamente, a quantidade de genoma viral parece diminuir durante a primeira fixação 6 hr a seguir, o que sugere que uma parte do genoma viral de entrada está fraca. Isso poderia acontecer com partículas que deixam de ser levado para dentro da célula e degradam na extracelularespaço ular ou talvez devido à degradação dentro da rede endolysosomal. Os dados apresentados demonstram que 12 ou 18 horas após a infecção seria horários ideais para triagem de replicação do genoma ativa.
Figura 1:. Descrição de fluxo de trabalho protocolo As etapas principais do ensaio de fixação de células com vírus são: 1) a incubação das partículas de vírus com as células a 4 ° C para permitir a ligação de células com vírus a ocorrer seguido de lavagens para remover vírus não ligado, 2) purificação de RNA viral a partir das células, 3) transcrição reversa (RT) para converter JUNV S segmento de ARN genómico (ARNv) em ADNc, e 4) qPCR para enumerar cópias de JUNV S ARNv como uma medida de fixação de células com vírus. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Ensaio de qPCR para a detecção de JUNV S genoma segmento é sensível e pode ser usado em uma grande faixa dinâmica A JUNV S segmento de qPCR conjunto iniciador-sonda foi testada pela sua capacidade de medir com precisão quantidades conhecidas (5, 16,6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, ou 5 x 10 7) cópias de um plasmídeo de controlo de padrão de ADN que codificam para a sequência alvo. Descrito são as parcelas de amplificação (A) e linhas de ajuste de curva padrão (B). R 2, o coeficiente de correlação de conjunto iniciador-sonda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ensaio de fixação de células JUNV confiável medidasfixação de partícula usando tão poucos como 20 PFU. células Vero E6 foram pré-ligado com quantidades conhecidas de JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5, ou 2 x 10 6 pfu) durante 1,5 horas a 4 ° C. partículas não ligadas foram removidas por lavagem, as células foram lisadas por extracção de ARN, e as amostras de ARN resultantes foram sujeitos a qRT-PCR para detectar JUNV C # 1 segmento S ARNv como uma medida de fixação de partícula para as células Vero E6. Os dados representam o número de cópias médio por poço de poços duplicados ± SEM.
Figura 4:. Cinética de JUNV C replicação do genoma # 1 após infecção de células Vero E6 foram incubados com 2 x 10 PFU de 3 JUNV C # 1 (MOI de 0,04) durante 1,5 horas a 4 ° C. Após várias lavagens em PBS gelado, as células foram colhidas tanto imediatamente (0 h ponto de tempo)ou aquecido a 37 ° C durante os tempos indicados antes da colheita. Em cada caso, o ARN total foi extraído a partir de células e sujeito a qRT-PCR para detectar JUNV C # 1 segmento S ARNv. Os valores estão listados cópias como médias por poço em poços em duplicado ± SEM.
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Discussion
O protocolo que descrevemos é simples e robusta desde que as seguintes considerações críticas são observadas. Em primeiro lugar, rigorosa técnica de pré-PCR deve ser empregado (ver 28 para uma excelente revisão). É imperativo que todos os reagentes e equipamentos são livres de DNA amplificado contendo a sequência alvo qPCR e que os controles apropriados estão no local para detectar a contaminação. Em segundo lugar, para a parte de fixação de células com vírus do protocolo, o vírus, células e meios de comunicação tem de ser mantida a 4 ° C para evitar a endocitose de viriões ligados à superfície. Em terceiro lugar, a quantidade de células colhidas para extracção de RNA não deve exceder a capacidade de ligação de ARN do filtro de purificao de ARN. Em quarto lugar, as amostras de ARN virais purificadas devem ser protegidos da degradação mediada por ribonuclease através da utilização de reagentes e equipamento livre de nuclease e, mantendo-os em gelo quando descongelado. Em quinto lugar, a gama da curva padrão incluída no ensaio qPCR deve ser suficientemente grandepara capturar todos os valores observados a partir de amostras desconhecidas. Em sexto lugar, repetições técnicos devem ser incluídos tanto para a parte de fixação de células com vírus do ensaio, bem como o qPCR de amostras de ARN individuais. Sétimo, os controles (por exemplo, linhas celulares que expressam hTfR1 ou não) pode ser incluído para controlar a especificidade do ensaio. Finalmente, todo o pessoal deve ter formação biossegurança adequado e aprovação institucional para lidar com JUNV infecciosa C # 1 ou outros arenavírus patogênicos.
A porção de qPCR o protocolo pede uma sonda qPCR principalmente para assegurar a especificidade do produto de serem amplificados durante cada fase da reacção de PCR. O custo do ensaio pode ser reduzida, no entanto, eliminando esta sonda de qPCR em favor de outro química qPCR que não necessita de uma sonda (por exemplo, a utilização do corante assimétrico de SYBR Green I 25) e / ou através da redução do volume do qPCR mistura de reacção usadas. Se um qPCR aplicativo independente de sondaRoach é usado, seria importante para verificar que as condições de reacção são suficientemente rigorosas para assegurar a especificidade dos iniciadores de qPCR. É também importante ter consciência de que o RNA arenavírus, seja extraída a partir de células ou de viriões, pode ser preparado de forma não específica para formar ADNc durante a RT, na ausência de um vírus específico do iniciador de RT 12. Portanto, copiar números detectados utilizando um iniciador específico de RT-ARNv não reflectem rigorosamente apenas as espécies de vRNA visados pelo iniciador de RT. Se especificidade para o genoma ou antigenoma é necessário, que relataram uma forma de contornar este fenómeno escorva não específica por meio da utilização de iniciadores de RT biotinilados e esferas de estreptavidina 12.
Uma força importante deste ensaio é a sua extrema sensibilidade. Outros ensaios de ligação de células que caracterizam arenavírus radioactivamente marcado com 22, 20 ou biotinilado marcado fluorescentemente 21 partículas têm exigido MOI de 0,2, 100, ou 1000, respectivaly. Enquanto a utilização de partículas radioactivamente marcadas resulta em boa sensibilidade, isto requer a utilização de radioactividade, o que aumenta os problemas de complexidade e de segurança logísticos associados com este ensaio particular. O método baseia-qPCR descrito aqui requer tão pouco quanto 20 PFU (MOI de ~ 0,0004 em uma placa de 48 poços) e pode detectar de forma fiável de fixação ao longo de um grande alcance dinâmico de MOI (p.ex. MOI de 0,0004 a pelo menos 40) (Figura 3 ). A forte sensibilidade deste ensaio faz com que seja possível utilizar baixo MOI para medição mais precisa dos acontecimentos de ligação produtivos por vírus infeccioso padrão. A sensibilidade elevada também reduz significativamente a quantidade de vírus necessária para o ensaio e, ao fazer isso, limita os passos de manuseamento adicionais que podem reduzir a qualidade de viriões de ser utilizado no ensaio (por exemplo, polietileno de precipitação à base de glicol de viriões, rotulagem viriões com fluoróforos ou isótopos radioactivos e / ou sacarose de bandas de VIRIONS). Além disso, o ensaio de qPCR em si é simples de executar, bem como altamente precisos e reprodutíveis.
O ensaio de ligação celular descrito pode ser modificado para medir a fases adicionais de entrada viral incluindo a endocitose da partícula virai, bem como o passo final de fusão do vírus, que é a libertação de genoma viral para o citoplasma. Para medir a endocitose da partícula, os mesmos passos do protocolo anexo será seguido até a etapa 2.5, que é a ligação das partículas com as células a 4 ° C. As células seriam então aquecida a permitir que as partículas virais a ser sujeita a endocitose, seguido por tratamento com uma protease para remover quaisquer viriões externamente ligados que não foram endocitadas como descrito 22,24. Secções 3 e 4 deste protocolo seria então seguido para extrair RNA viral e quantificar cópias de RNA genômico viral como medida de endocitose. Para medir uncoating genoma seguinte fusão das membranas virais e endossomal, as células seriam pré-ligado comvírus a 4 ° C, aqueceu-se (para permitir a endocitose e fusão) e removeu-se partículas externos, e, em seguida, recolhidas para análise. Numa abordagem, as células podem ser lisadas num tampão isotónico de preservar vesículas intracelulares, e, em seguida, dividido em 2 fracções: uma que seria tratado com um cocktail de RNases (ARN virai não revestido é susceptível de degradação) e o outro que não faria 39 . Alternativamente, as células podem ser separados em fracções citosólicas ou endossómicas 40. Em ambos os casos, qRT-PCR seria usado para quantificar genoma virai no citoplasma como uma medida do desencapsulamento genoma viral. Por último, o ensaio de qRT-PCR pode ser facilmente modificado para estudar acessório do vírus, endocitose, ou fusão para outros vírus fornecidos os reagentes de RT-PCR são adaptados ao novo vírus de interesse (para exemplos, ver 24-27).
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamim Rei para discussões úteis e os Institutos Nacionais de Saúde para apoio a estes estudos por meio de doações T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
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